L'analyse du filtre à air dans l'échantillon d'endotoxines et de l'ADN contenu

L'objectif général de cette procédure est de décrire comment analyser précisément la teneur en endotoxines et en ADN des particules aéroportées extraites, prélevées sur des filtres. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur les aérosols biologiques en intérieur et en extérieur, notamment en ce qui concerne les raisons sanitaires. La procédure de prélèvement sur filtre sera démontrée par Yinon Mazar, étudiant diplômé de mon laboratoire.

Pour un échantillonnage à haut volume, utilisez des filtres en fibres de quartz. Sinon, choisissez le type de filtre spécifique ainsi que la taille de coupure du filtre qui convient le mieux aux besoins de la recherche. Préchauffez les filtres destinés à l'échantillonnage de composés organiques et biologiques en les enveloppant individuellement dans du papier d'aluminium.

Puis les faire cuire dans un four de laboratoire à 450 degrés Celsius pendant au moins cinq heures. Cette étape détruira tous les résidus organiques préexistants. Conserver les filtres cuits à 20 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation pour l'échantillonnage.

Ensuite, nettoyez et désinfectez l'échantillonneur à haut volume, comme celui décrit dans le protocole textuel associé. Puis, placez le filtre préalablement calciné dans la cassette à filtre et faites fonctionner l'échantillonneur conformément aux instructions du fabricant afin de recueillir un échantillon approprié. Dans une cabine de sécurité biologique de classe deux, découpez 22 morceaux circulaires en matériau filtrant propre et préalablement calciné à l’aide d’un foret à liège propre de 1,12 centimètre de diamètre.

Utilisez ces morceaux pour préparer une série de filtres additionnés d'endotoxines destinés à servir de témoins. Ensuite, découpez les filtres contenant l'échantillon prélevé à l’aide d’un carottier propre de 1,12 centimètre de diamètre et placez chaque échantillon dans un tube stérile exempt de pyrogènes de deux millilitres. Transférez également les filtres additionnés d'endotoxines séchés dans des tubes stériles exempts de pyrogènes de deux millilitres séparés.

Ajouter un millilitre d’eau sans pyrogènes à chaque tube. Et les agiter pendant 60 minutes à température ambiante à l’aide d’un agitateur de laboratoire. Ensuite, centrifuger les tubes d’échantillon dans une microcentrifugeuse à 375 × g pendant 10 minutes.

Ensuite, transférez le surnageant contenant les endotoxines dans un nouveau tube pyrogène de deux millilitres. Préparez une microplaque à 96 puits à fond plat, exempte de pyrogènes, avec couvercle pour le test des endotoxines. Commencez par définir les emplacements des échantillons.

Ensuite, allumez le lecteur de microplaques et programmez-le pour une réaction cinétique à 37 degrés Celsius avec un brassage toutes les cinq minutes, suivi de mesures à 405 nanomètres. Répétez le brassage de cinq minutes et la lecture de la plaque 18 fois.

Chargez les échantillons dans la plaque en plaçant 50 microlitres des solutions standards d'endotoxines précédemment utilisées pour contaminer les filtres dans les puits des lignes A1 à A10 et B1 à B10. Placez les témoins sans ajout dans les puits A11, A12, B11 et B12. Ensuite, ajoutez le surnageant provenant de l'extrait du filtre contaminé centrifugé et ses témoins dans les lignes C et D. Puis, ajoutez les surnageants provenant des échantillons expérimentaux et leurs témoins dans les puits restants selon les besoins.

Pour activer le test, ajoutez rapidement 50 microlitres de la solution de glycate d'amébocyte de limule dans chaque puits. Secouez doucement la plaque horizontalement avant de la soulever dans le lecteur de plaques et de démarrer l'expérience.

Une fois terminé, retirez la plaque du lecteur de plaques. Déterminez le niveau d'endotoxines dans chaque échantillon à l'aide de la courbe standard, puis calculez également l'efficacité avec laquelle les endotoxines sont extraites des filtres d'échantillonnage. Préparez d'abord les filtres additionnés d'ADN comme décrit dans le protocole textuel associé.

Pour chaque échantillon de filtre, préparer un mélange de billes de verre traitées à l'acide dans des tubes stériles de 0,5 millilitre, contenant 0,1 gramme de billes de diamètre compris entre 425 et 600 micromètres et 0,3 gramme de billes de diamètre inférieur ou égal à 106 micromètres. Ensuite, découper trois morceaux circulaires à des emplacements choisis aléatoirement sur chaque échantillon de filtre à l’aide d’un carottier désinfecté de 1,12 centimètre de diamètre. Placer les échantillons de filtre dans des tubes vissables individuels de deux millilitres.

Ensuite, ajoutez le mélange de billes de verre à chaque tube, ainsi que 60 microlitres du tampon de lyse cellulaire fourni avec le kit d'extraction de l'ADN. Fermez les tubes et placez les échantillons dans le broyeur à billes. Utilisez le broyeur à billes pour rompre mécaniquement les cellules filtrées pendant une minute, puis refroidissez les échantillons en les plaçant sur de la glace pendant une minute supplémentaire.

Répétez ce cycle cinq fois. Poursuivez en suivant le protocole du fournisseur du kit et extrayez l'ADN des cellules lysées. Après l'élution, rechargez l'échantillon éluté à travers la colonne d'extraction une deuxième fois afin d'améliorer le rendement en ADN.

Activez à l'avance l'appareil de PCR quantitative pour lui permettre de se réchauffer. Dans un nouveau fichier de programme, saisissez les détails de l'analyse de PCR quantitative dans le logiciel de fonctionnement de l'appareil. Ensuite, désinfectez la surface de travail avec un décontaminant d'ADN pour surfaces et travaillez uniquement avec des tubes, des pointes et des réactifs stériles.

Également, placez un seau de glace à côté du poste de travail et mettez le mélange *tac polemoraris* dans le seau. Préparez le mélange de réaction de PCR quantitative comme décrit dans le tableau quatre du protocole accompagnant le texte. Conservez le mélange de réaction à l’abri de la lumière et sur glace jusqu’à son utilisation.

Ensuite, placez une microplaque propre dans un support de plaque afin d'éviter qu'elle ne touche la surface de travail et de la maintenir propre. Ajoutez un microlitre d'ADN témoin, d'ADN échantillon ou d'eau sans nuclease à l'intérieur des puits de la microplaque de PCR quantitative, en triple exemplaire. Puis, ajoutez neuf microlitres du mélange réactionnel maître dans chaque puits de réaction.

Lorsque l'opération est terminée, recouvrez la plaque d'un film adhésif optique et scellez-la hermétiquement sur tous les côtés. Faites centrifuger la plaque dans une centrifugeuse équipée de godets pour plaque pendant une minute à 1000 ×g avant de la placer dans le thermocycleur. Enfin, activez et lancez le programme de PCR quantitative préparé.

Lors de l'extraction des endotoxines, les échantillons filtrés sont centrifugés afin d'extraire les endotoxines du filtre. Différentes vitesses de centrifugation entraînent des efficacités d'extraction variables, particulièrement à des concentrations élevées d'endotoxines.

Un test préliminaire d'efficacité d'extraction doit être réalisé pour le filtre spécifique choisi et le protocole mis en œuvre. Des efficacités d'extraction plus élevées sont obtenues en ajoutant des filtres propres par rapport aux filtres en quartz échantillonnés, et ces deux efficacités sont inférieures à celle obtenue par détection directe de la solution standard. Une fois maîtrisée, l'analyse des endotoxines peut être effectuée en trois heures et demie si elle est réalisée correctement.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage de l'ADN peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le transport d'organismes dans l'atmosphère. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'extraire efficacement les endotoxines et l'ADN à partir de filtres d'échantillons d'air et de les analyser avec précision.