Name: Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Découvrez la transformation de levures probiotiques Saccharomyces boulardii pour l'expression de protéines hétérologues et leur récupération dans les tissus immunitaires gastro-intestinaux de souris après gavage oral.

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Les auteurs reconnaissent financement par le Centre des enfants d&#39;immunologie et vaccins et une Innovator Award New NIH (1DP2AI112242-01) attribué à Tracey J. Lamb. Les auteurs remercient également Natalya P. Degtyareva pour la généreuse contribution de rad1 S. cerevisiae.

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ensemble, les protocoles ici décrivent les étapes essentielles nécessaires pour le développement et les tests de souches de levures probiotiques auxotrophes pour la livraison de la protéine thérapeutique hétérologue à l&#39;intestin. Cette manipulation et l&#39;expérimentation de levure probiotique recombinant nécessite des techniques et des ressources avec lesquelles tout laboratoire individu peut ne pas être actuellement familier. Ainsi, bien que de nombreuses études précédentes ont décrit les protocoles ci-dessus pou...

micro-organismes probiotiques sont des moyens potentiels intrigants de manière efficace et économique la prestation protéines hétérologues dans le tractus gastro-intestinal. Ces organismes sont capables de survivre passage à travers le tractus gastro-intestinal pour l&#39;instant ne coloniser 1, ce qui permet un dosage contrôlé et en limitant l&#39;exposition au médicament exprimé. En outre, la capacité de construire facilement ces organismes pour produire une protéine hétérologue à grande échelle les rend une alternative économique aux particules de livraison synthétiques. Cependant, le développement d&#39;une telle approche, comme l&#39;a montré récemment l&#39;aide d&#39;une souche auxotrophe de la levure Saccharomyces probiotiques boulardii 2, nécessite la connaissance des techniques de laboratoire ne sont pas traditionnellement associés au sein d&#39;une étude donnée, allant de la levure et de la biologie moléculaire pour les techniques de manipulation des animaux et des méthodes immunologiques. Ainsi, bien que les procédures individuelles décrites ici ne sont pas en eux-mêmes nouveauxles protocoles de laboratoire, le but de ce manuscrit est de présenter une introduction unifiée pour les techniques nécessaires pour les tests expérimentaux de la levure probiotique en tant que véhicules de délivrance de médicaments à l&#39;appareil gastro-intestinal murin. Fourni est une compilation des protocoles essentiels pour: 1) la génération de souches mutantes auxotrophes de levure qui peut facilement être génétiquement manipulés; 2) la transformation de cultures de levure pour exprimer une protéine hétérologue; 3) l&#39;administration de levure recombinante à l&#39;intestin par gavage; et 4) la récupération de viable levure probiotique recombinant de l&#39;intestin de souris et l&#39;évaluation de leur expression de la protéine hétérologue. En premier lieu, bien que de nombreuses méthodes de sélection positive et négative existent pour la manipulation des espèces de levures, de sélection négative tel que par l&#39;utilisation de marqueurs auxotrophes augmente à la fois l&#39;efficacité et la facilité avec laquelle la levure peut être transformée et sélectionnée. sélection positive des transformants en utilisant des antibiotiques, en collaborationntrast, augmente considérablement le coût de la manipulation de levure. En outre, la sélection de la levure sur un milieu solide contenant antibiotiques peut permettre d&#39;accroître la croissance de colonies de fond non transformées par rapport à la sélection de la levure auxotrophe sur une chute de synthèse sur milieux solides (observations non publiées). levure auxotrophe est souches qui manquent d&#39;enzymes essentiels pour la synthèse des acides aminés essentiels ou uracile. Cette levure peut se développer que si elle est complétée avec le métabolite manquant ou gène métabolique, permettant ainsi une sélection négative lorsque la levure est plaquée sur chute de synthèse sur les médias qui manque le métabolite essentiel. Beaucoup de Saccharomyces souches couramment utilisées en laboratoire cerevisiae sont en fait déjà mutants auxotrophes 3. souches de levures probiotiques industrielle, cliniques et, cependant, sont généralement prototrophe avec la capacité de synthétiser tous les éléments nutritifs nécessaires. Pour permettre la manipulation génétique plus efficace de cette levure, gènes auxotrophes peuvent être ciblés de façon sélectivepour générer des souches qui peuvent être sélectionnés sans antibiotiques. Un ciblage spécifique des gènes marqueurs auxotrophes peut être obtenue par disruption génique médiée par PCR reposant sur ​​la recombinaison homologue ou, plus récemment, par le biais CRISPR / cas9 ciblage 4-6. Alternativement, la mutagenèse UV peut générer rapidement des mutants auxotrophes même dans des souches de levure pour lesquels la transformation avec de multiples plasmides est techniquement difficile 7. Bien que le ciblage PCR et CRISPR / cas9 ont été décrits en détail ailleurs, présenté dans la première partie de ce manuscrit est un protocole détaillé décrivant une approche de mutagenèse UV pour créer des souches auxotrophes qui permettront de sélection négative plutôt que de sélection antibiotique positif de transformants de levure. L&#39;étape suivante nécessaire à l&#39;utilisation de telles souches auxotrophes pour l&#39;administration orale de la protéine hétérologue est une levure transformation avec de l&#39;ADN plasmidique. Depuis la première transformation réussie de yeast sphéroplastes déclarés pour Saccharomyces cerevisiae en 1978 8, de nombreuses modifications ont été caractérisées pour accroître l&#39;efficacité et la facilité avec laquelle les espèces de levure peuvent être génétiquement modifiés. Utilisation d&#39;électroporation pour la transformation réussie de l&#39;ADN dans S. cerevisiae a été décrite la première fois en 1985 et 9 a depuis été améliorées par l&#39;addition de 1 M sorbitol incubation à osmotique des cellules de soutien 10. L&#39;efficacité d&#39;électroporation a été démontré en outre dépendre de l&#39;espèce de levure et de la souche, le nombre de cellules et la phase de croissance, le volume d&#39;électroporation, l&#39;intensité du champ, et des tampons spécifiques 11. Lithium acétate (LiOAc) transformation, initialement décrite par Ito et al. 12, est parmi les protocoles de transformation les plus couramment utilisés car il ne nécessite aucun équipement spécial. Des analyses complémentaires ont montré que l&#39;efficacité de transformation de la levure LiOAc augmente considérablement lorsque les cellules sont recueillies dans la phase mid-logde l&#39;évolution et sont un choc thermique en présence de polyéthylène glycol (PEG) et de l&#39;ADN à 42 ° C 12. Incubation de levure intactes ensemble avec le PEG est essentiel pour la transformation efficace, peut-être par l&#39;amélioration de la fixation de l&#39;ADN sur la membrane cellulaire, ainsi que par d&#39;autres effets sur la membrane 13. Lithium soi augmente également la perméabilité des cellules intactes 14. Bien que la plupart laboratoire S. souches cerevisiae peuvent être facilement transformées en utilisant LiOAc transformation trois, d&#39;autres espèces de levure peuvent être plus efficacement transformés en utilisant des protocoles alternatifs. Pichia pastoris, par exemple, est le plus efficacement transformé par électroporation plutôt que LiOAc transformation 13. Il est donc essentiel de tester multiple méthodes de transformation et d&#39;optimiser les périodes d&#39;incubation et les concentrations de réactifs lors de la tentative de modifier génétiquement une souche de levure non caractérisée. Ce manuscrit décrit ainsi à la fois LiOAc transformation et l&#39;électroporation que des techniques pour la transformation de mutant auxotrophe et de type sauvage S. boulardii. Les lecteurs intéressés sont dirigés vers derniers avis sur descriptions approfondies de l&#39;évolution de la transformation de la levure, d&#39;autres protocoles, et d&#39;autres discussions sur les mécanismes d&#39;action possibles 13,15. Transformation de la levure avec le plasmide codant pour une protéine facilement détectable est en outre essentiel pour les tests en aval, afin d&#39;assurer l&#39;expression et la fonction de la protéine hétérologue appropriée. protéines différentes Myriad peuvent être choisis en fonction de la finalité de l&#39;étude thérapeutique et les anticorps disponibles pour la détection de protéines par immunoblotting, ELISA, et d&#39;autres techniques. Les protocoles pour ces techniques ont été décrites en détail ailleurs 16,17, et peuvent être utilisés pour déterminer les niveaux de production de protéine hétérologue de la levure transformée par comparaison avec des courbes d&#39;étalonnage. Pour des fins de démonstration et de montrerproduction réussie d&#39;une protéine très couramment utilisé dans la levure biologie, ce manuscrit présente transformation avec la protéine de plasmide codant pour fluorescente verte (GFP), ce qui permet une détection ultérieure en utilisant la microscopie de fluorescence. Tout aussi important pour la production d&#39;organismes probiotiques qui expriment la protéine hétérologue est la bonne administration et la détection de ces micro-organismes dans les tissus gastro-intestinaux, comme il est décrit dans les parties trois et quatre. L&#39;administration de levure recombinante par gavage par voie orale permet de réceptionner des quantités contrôlées de levure directement dans l&#39;estomac, à partir duquel souris C57BL / 6 sont naturellement incapables de 18 vomissements. Cependant, la manipulation des animaux impropre et gavage peuvent entraîner des lésions de l&#39;œsophage et de perforation, perforation gastrique, l&#39;administration de la trachée, et une pneumonie par aspiration 19,20. Une mauvaise technique et l&#39;inexpérience peuvent en outre augmenter la variabilité dans les réponses immunitaires murines et resu expérimentaleLTS, qui ont été attribués au stress des animaux lors de gavage oral 21,22. Pratique dans la bonne technique peut donc non seulement atténuer l&#39;inconfort des animaux, mais peut aussi augmenter la précision des résultats expérimentaux. Ce manuscrit décrit et démontre la manipulation des animaux et gavage oral pour l&#39;administration des doses contrôlées de levure recombinante. Enfin, il est essentiel de confirmer la livraison réussie de levure recombinante en analysant les tissus lymphoïdes de la présence de la levure et de la protéine hétérologue. Les tissus immunitaires gastro-intestinaux qui peuvent plus facilement et de manière prévisible être examinés pour déterminer la présence de la levure sont les plaques de Peyer. Les plaques de Peyer sont des organes lymphoïdes secondaires le long de l&#39;intestin grêle qui sont les principaux sites de muqueuses induction de la réponse immunitaire 23. Les antigènes de la lumière sont transmis à travers transcellularly microfold (M) des cellules de l&#39;épithélium et sont libérés dans les plaques de Peyer, exposant ainsi enfermerd cellules présentant l&#39;antigène à intestinale au contenu de la lumière. Bien que l&#39;absorption des particules à travers l&#39;épithélium intestinal peut également être réalisée par les cellules caliciformes, ces cellules ont été représentés pour ne prendre que des particules inférieure à 0,02 um de diamètre 24. Dendrites transépithéliaux étendus à partir de cellules dendritiques CD103 + (DC) prennent également de petites particules à partir du lumen intestinal 25; cependant, il n&#39;y a pas de rapports démontrant que CD103 + DC prennent des particules plus grosses que les bactéries. Ainsi, la levure probiotique intact, de taille moyenne comprise entre 3-6 um de diamètre, sont plus susceptibles d&#39;être absorbé par les cellules M et transféré dans les plaques de Peyer. Décrit ici est un protocole pour la collecte et le dépistage des plaques de Peyer de levure recombinante viable, bien que cette procédure peut également être facilement adapté pour évaluer l&#39;absorption de bactéries probiotiques. En résumé, l&#39;évaluation de la levure probiotique recombinant pour la livraison de laprotéines thérapeu- à l&#39;intestin nécessite la maîtrise des techniques de laboratoire couvrant la biologie moléculaire à la manipulation des animaux et de l&#39;immunologie. Présentés ici sont des protocoles pour 1) la génération et la sélection de souches de levure auxotrophes qui peut être facilement sélectionné négativement sans antibiotiques, 2) protocoles alternatifs pour transformer la levure et permettre l&#39;expression de la protéine hétérologue, 3) des démonstrations de techniques de manipulation des animaux appropriés et gavage oral pendant livraison intragastrique de levure recombinante, et 4) des protocoles pour le patch de la dissection de Peyer et le dépistage de la levure recombinant viable et protéine hétérologue fonctionnel. La combinaison de ces protocoles de permettre la production et l&#39;essai d&#39;une souche de levure probiotique capable de délivrer la protéine thérapeutique hétérologue dans le tractus gastro-intestinal.

<table><tbody><tr><td>Spectrophotomètre SmartSpec 3000</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Exemple de spectrophotomètre pour déterminer la concentration cellulaire et la 600</sous-> des cultures de levure</td></tr><tr><td>Nouveau-Brunswick Tambour à rouleaux</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Exemple de tambour à rouleaux pour l’incubation de cultures de levures</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400 Stratagene</td><td></td><td>400075-03</td><td>Exemple de stratalinker</td></tr><tr><td>Stuart Colony Counter SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Plate support avec grossissement enregistre le nombre de colonies lors de la détection de la pression du stylo</td></tr><tr><td>Scienceware Colony Counter&nbsp ;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>Compteur de colonie à main</td></tr><tr><td>Réplique du dispositif de placage</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Exemple de réplique de support de placage et de tampons&nbsp ;</td></tr><tr><td>Carrés de velours</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>Épandeurs de cellules stériles en forme de L</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Acide désoxyribonucléique, simple brin à partir de testicules de saumon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Exemple d’ADN porteur pour la levure Transformation LiOAc</td></tr><tr><td>Aiguilles de gavage</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp ; 002</td><td>Pour les souris de 15 à 20 g, l’aiguille suggérée est une aiguille à gavage réutilisable de calibre 22 (boule de 1,25 mm), longue et droite. Pour les souris pesant plus de 20 g, calibre 20 ou plus Des aiguilles à gavage droites ou incurvées peuvent être utilisées</td></tr> 1 <tr><td>ml Seringue à tuberculine jetable stérile à embout coulissant</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Pince émoussée telle que Electron Microscopy Sciences Pointe dentelée de 7" (178 mm), pince à prise large</td><td>Microscopie électronique</td><td>Sciences 77937-28</td><td>Exemple de pince émoussée nécessaire pour la dissection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection droits et courbes</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72966-02 et 72966-03</td><td>Exemples de ciseaux nécessaires pour la dissection</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Le développement d’un traitement oral recombinant permettrait de cibler plus directement le système immunitaire muqueux et d’améliorer la capacité à combattre les troubles gastro-intestinaux. L’adaptation de la levure probiotique en particulier pour cette approche comporte plusieurs avantages. Ces souches ont non seulement le potentiel de synthétiser une grande variété de protéines hétérologues complexes, mais sont également capables de survivre et de protéger ces protéines pendant leur transit dans l’intestin. Cependant, cette approche nécessite une expertise dans de nombreuses techniques de laboratoire diverses qui ne sont généralement pas utilisées en tandem. De plus, bien que les protocoles individuels de transformation des levures soient bien caractérisés pour les souches de laboratoire couramment utilisées, l’accent est mis ici sur les approches alternatives et l’importance d’optimiser la transformation pour les souches probiotiques moins bien caractérisées. Le détail de ces méthodes facilitera la discussion sur les meilleures approches pour tester la levure probiotique en tant que véhicules d’administration de médicaments par voie orale et servira effectivement à faire progresser le développement de cette nouvelle stratégie de thérapie gastro-intestinale.

Génération d&#39;une courbe de survie après irradiation UV nécessite placage des cellules de levure dilués de telle sorte que les unités formant colonie (UFC) distinctes sont capables de former. Chaque échantillon de 500 ul recueillies comme décrit ci-dessus contient environ 5 x 10 6 cellules; Toutefois, plus de 100 colonies par plaque sont difficiles à distinguer avec précision. Placage échantillon non dilué ainsi que série des dilutions 1:10 de cellules irradiées assure ains...

Nous présentons ici une description unifiée de techniques qui peuvent être utilisés pour développer, transformer, administrer et tester l&#39;expression de protéine hétérologue de la levure probiotique Saccharomyces boulardii.

Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

L'objectif général de ces procédures est de développer une souche de levure probiotique qui puisse être facilement transformée pour exprimer et délivrer une protéine hétérologue dans le tractus gastro-intestinal murin. Le principal avantage de ces techniques réside dans leur capacité à permettre une génération rapide de souches de levures probiotiques oxytrophes. Ces levures mutantes peuvent ensuite être manipulées génétiquement sans avoir recours à une sélection par antibiotiques.L'administration par gavage oral chez la souris et la collecte des plaques de Peyer permettent également de vérifier l'adhérence des levures mutantes aux tissus immunitaires gastro-intestinaux. Ces méthodes aideront à répondre à des questions clés dans le domaine de la vaccination orale et faciliteront des expériences testant des probiotiques pour la délivrance de thérapeutiques gastro-intestinales. Après avoir préparé le milieu YPD et fait croître les levures toute la nuit jusqu'à la saturation, diluez les cellules d’un facteur 1 à 10 dans de l’eau dans une cuvette en plastique.Ensuite, étalonnez un spectrophotomètre et déterminez la densité optique de la culture de nuit. À l’aide de 20 millilitres d’eau

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo illustre une procédure de transplantation de microbiote fécal chez une souris déficiente en interleukine-10 avec une inflammation du côlon. Les microbes fécaux colonisés dans l’intestin libèrent des métabolites secondaires, provoquant la libération de cytokines anti-inflammatoires et réduisant l’inflammation du côlon.

Évaluation des effets de la transplantation de microbiote fécal chez une souris déficiente en interleukine-10

Cette vidéo présente l’administration orale de cellules de levure transformées dans un modèle murin. Les cellules de levure transformées sont administrées par voie orale à l'aide d'une technique de gavage, atteignant l'estomac de la souris. Plus tard, les cellules migrent vers l'intestin grêle, où les cellules microrepliées les engloutissent et facilitent leur transfert vers les plaques de Peyer et accèdent au système immunitaire intestinal.

Administration orale de cellules de levure transformées dans le système immunitaire intestinal de souris

Ici nous fournissons des protocoles détaillés pour l’administration orale d’antibiotiques aux souris, collection d’échantillons de matières fécales, l’extraction d’ADN et la quantification des bactéries fécales de qPCR.

Analyses de polymérase quantitative axée sur la réaction en chaîne de murin microbiote Intestinal après un traitement antibiotique par voie orale

Cette étude détaille le processus des quantités précises de gavage des probiotiques pour souris néonatales. Le montage expérimental a été optimisé afin d’inclure, sans s’y limiter aux probiotiques dosage, méthodes d’administration et la quantification des bactéries dans les intestins.

Études de probiotiques chez la souris néonatales à l’aide de Gavage

Nous décrivons une nouvelle méthode pour produire des blT-souris doublehumanisées qui comportent un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome d'intestin humain-comme un homme stable. Ce protocole peut être suivi sans avoir besoin de souris exemptes de germes ou d'installations gnotobiotiques.

Un modèle double humanisé DE BLT-souris avec un microbiome humain stable-comme l'intestin et le système immunitaire humain

Le but de ce protocole est de visualiser la forme et la localisation des cellules de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal des mammifères.

Visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant l'hybridation fluorescente in Situ

L’interaction de la susceptibilité génétique, de l’immunité muqueuse et de l’environnement microécologique intestinal est impliquée dans la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Dans cette étude, nous avons appliqué la transplantation de microbiote fécal à des souris déficientes en IL-10 et étudié son impact sur l’inflammation colique et la fonction cardiaque.

Évaluation thérapeutique de la transplantation de microbiote fécal dans un modèle murin déficient en interleukine 10

Ici, nous présentons un protocole pour établir le modèle murin de colite induite par le sulfate de dextran sans germes pseudo-germes induits par des antibiotiques afin d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans la régulation des effets positifs de Bacillus cereus sur la colite.

Étude des effets atténuants de l’administration de Bacillus cereus sur la colite par la modulation du microbiote intestinal

Les bactériophages (phages), des virus qui infectent les bactéries, font partie intégrante du microbiome intestinal. Bien que ces habitants symbiotiques déterminent la forme physique bactérienne et la dynamique des populations, on comprend peu de choses sur leur impact sur l’homéostasie intestinale et les maladies. Ce protocole étudie des phages T4 isolés dans un modèle murin, adaptable à d’autres paires phage-bactérie.

Interaction entre le bactériophage T4 et E . coli dans l’intestin murin : un modèle prototypique pour l’étude de la dynamique hôte-bactériophage in vivo

Ce protocole décrit les meilleures pratiques pour le transfert et l’hébergement de souris sans germes dans des isolateurs expérimentaux à cage unique (isocages) tout en maintenant des conditions stériles. Les méthodes de transplantation fécale chez des souris exemptes de germes et la collecte de bactéries viables à partir de ces souris intestinales « humanisées » pour d’autres applications sont discutées.

Préparation et maintenance d’une expérience de cage bio-exclusion isopositive pour la transplantation fécale humaine chez des souris exemptes de germes

Découvrez la transformation de levures probiotiques Saccharomyces boulardii pour l'expression de protéines hétérologues et leur récupération dans les tissus immunitaires gastro-intestinaux de souris après gavage oral.

Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

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