Name: Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Découvrez la transformation de levures probiotiques Saccharomyces boulardii pour l'expression de protéines hétérologues et leur récupération dans les tissus immunitaires gastro-intestinaux de souris après gavage oral.

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Les auteurs reconnaissent financement par le Centre des enfants d&#39;immunologie et vaccins et une Innovator Award New NIH (1DP2AI112242-01) attribué à Tracey J. Lamb. Les auteurs remercient également Natalya P. Degtyareva pour la généreuse contribution de rad1 S. cerevisiae.

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ensemble, les protocoles ici décrivent les étapes essentielles nécessaires pour le développement et les tests de souches de levures probiotiques auxotrophes pour la livraison de la protéine thérapeutique hétérologue à l&#39;intestin. Cette manipulation et l&#39;expérimentation de levure probiotique recombinant nécessite des techniques et des ressources avec lesquelles tout laboratoire individu peut ne pas être actuellement familier. Ainsi, bien que de nombreuses études précédentes ont décrit les protocoles ci-dessus pou...

micro-organismes probiotiques sont des moyens potentiels intrigants de manière efficace et économique la prestation protéines hétérologues dans le tractus gastro-intestinal. Ces organismes sont capables de survivre passage à travers le tractus gastro-intestinal pour l&#39;instant ne coloniser 1, ce qui permet un dosage contrôlé et en limitant l&#39;exposition au médicament exprimé. En outre, la capacité de construire facilement ces organismes pour produire une protéine hétérologue à grande échelle les rend une alternative économique aux particules de livraison synthétiques. Cependant, le développement d&#39;une telle approche, comme l&#39;a montré récemment l&#39;aide d&#39;une souche auxotrophe de la levure Saccharomyces probiotiques boulardii 2, nécessite la connaissance des techniques de laboratoire ne sont pas traditionnellement associés au sein d&#39;une étude donnée, allant de la levure et de la biologie moléculaire pour les techniques de manipulation des animaux et des méthodes immunologiques. Ainsi, bien que les procédures individuelles décrites ici ne sont pas en eux-mêmes nouveauxles protocoles de laboratoire, le but de ce manuscrit est de présenter une introduction unifiée pour les techniques nécessaires pour les tests expérimentaux de la levure probiotique en tant que véhicules de délivrance de médicaments à l&#39;appareil gastro-intestinal murin. Fourni est une compilation des protocoles essentiels pour: 1) la génération de souches mutantes auxotrophes de levure qui peut facilement être génétiquement manipulés; 2) la transformation de cultures de levure pour exprimer une protéine hétérologue; 3) l&#39;administration de levure recombinante à l&#39;intestin par gavage; et 4) la récupération de viable levure probiotique recombinant de l&#39;intestin de souris et l&#39;évaluation de leur expression de la protéine hétérologue. En premier lieu, bien que de nombreuses méthodes de sélection positive et négative existent pour la manipulation des espèces de levures, de sélection négative tel que par l&#39;utilisation de marqueurs auxotrophes augmente à la fois l&#39;efficacité et la facilité avec laquelle la levure peut être transformée et sélectionnée. sélection positive des transformants en utilisant des antibiotiques, en collaborationntrast, augmente considérablement le coût de la manipulation de levure. En outre, la sélection de la levure sur un milieu solide contenant antibiotiques peut permettre d&#39;accroître la croissance de colonies de fond non transformées par rapport à la sélection de la levure auxotrophe sur une chute de synthèse sur milieux solides (observations non publiées). levure auxotrophe est souches qui manquent d&#39;enzymes essentiels pour la synthèse des acides aminés essentiels ou uracile. Cette levure peut se développer que si elle est complétée avec le métabolite manquant ou gène métabolique, permettant ainsi une sélection négative lorsque la levure est plaquée sur chute de synthèse sur les médias qui manque le métabolite essentiel. Beaucoup de Saccharomyces souches couramment utilisées en laboratoire cerevisiae sont en fait déjà mutants auxotrophes 3. souches de levures probiotiques industrielle, cliniques et, cependant, sont généralement prototrophe avec la capacité de synthétiser tous les éléments nutritifs nécessaires. Pour permettre la manipulation génétique plus efficace de cette levure, gènes auxotrophes peuvent être ciblés de façon sélectivepour générer des souches qui peuvent être sélectionnés sans antibiotiques. Un ciblage spécifique des gènes marqueurs auxotrophes peut être obtenue par disruption génique médiée par PCR reposant sur ​​la recombinaison homologue ou, plus récemment, par le biais CRISPR / cas9 ciblage 4-6. Alternativement, la mutagenèse UV peut générer rapidement des mutants auxotrophes même dans des souches de levure pour lesquels la transformation avec de multiples plasmides est techniquement difficile 7. Bien que le ciblage PCR et CRISPR / cas9 ont été décrits en détail ailleurs, présenté dans la première partie de ce manuscrit est un protocole détaillé décrivant une approche de mutagenèse UV pour créer des souches auxotrophes qui permettront de sélection négative plutôt que de sélection antibiotique positif de transformants de levure. L&#39;étape suivante nécessaire à l&#39;utilisation de telles souches auxotrophes pour l&#39;administration orale de la protéine hétérologue est une levure transformation avec de l&#39;ADN plasmidique. Depuis la première transformation réussie de yeast sphéroplastes déclarés pour Saccharomyces cerevisiae en 1978 8, de nombreuses modifications ont été caractérisées pour accroître l&#39;efficacité et la facilité avec laquelle les espèces de levure peuvent être génétiquement modifiés. Utilisation d&#39;électroporation pour la transformation réussie de l&#39;ADN dans S. cerevisiae a été décrite la première fois en 1985 et 9 a depuis été améliorées par l&#39;addition de 1 M sorbitol incubation à osmotique des cellules de soutien 10. L&#39;efficacité d&#39;électroporation a été démontré en outre dépendre de l&#39;espèce de levure et de la souche, le nombre de cellules et la phase de croissance, le volume d&#39;électroporation, l&#39;intensité du champ, et des tampons spécifiques 11. Lithium acétate (LiOAc) transformation, initialement décrite par Ito et al. 12, est parmi les protocoles de transformation les plus couramment utilisés car il ne nécessite aucun équipement spécial. Des analyses complémentaires ont montré que l&#39;efficacité de transformation de la levure LiOAc augmente considérablement lorsque les cellules sont recueillies dans la phase mid-logde l&#39;évolution et sont un choc thermique en présence de polyéthylène glycol (PEG) et de l&#39;ADN à 42 ° C 12. Incubation de levure intactes ensemble avec le PEG est essentiel pour la transformation efficace, peut-être par l&#39;amélioration de la fixation de l&#39;ADN sur la membrane cellulaire, ainsi que par d&#39;autres effets sur la membrane 13. Lithium soi augmente également la perméabilité des cellules intactes 14. Bien que la plupart laboratoire S. souches cerevisiae peuvent être facilement transformées en utilisant LiOAc transformation trois, d&#39;autres espèces de levure peuvent être plus efficacement transformés en utilisant des protocoles alternatifs. Pichia pastoris, par exemple, est le plus efficacement transformé par électroporation plutôt que LiOAc transformation 13. Il est donc essentiel de tester multiple méthodes de transformation et d&#39;optimiser les périodes d&#39;incubation et les concentrations de réactifs lors de la tentative de modifier génétiquement une souche de levure non caractérisée. Ce manuscrit décrit ainsi à la fois LiOAc transformation et l&#39;électroporation que des techniques pour la transformation de mutant auxotrophe et de type sauvage S. boulardii. Les lecteurs intéressés sont dirigés vers derniers avis sur descriptions approfondies de l&#39;évolution de la transformation de la levure, d&#39;autres protocoles, et d&#39;autres discussions sur les mécanismes d&#39;action possibles 13,15. Transformation de la levure avec le plasmide codant pour une protéine facilement détectable est en outre essentiel pour les tests en aval, afin d&#39;assurer l&#39;expression et la fonction de la protéine hétérologue appropriée. protéines différentes Myriad peuvent être choisis en fonction de la finalité de l&#39;étude thérapeutique et les anticorps disponibles pour la détection de protéines par immunoblotting, ELISA, et d&#39;autres techniques. Les protocoles pour ces techniques ont été décrites en détail ailleurs 16,17, et peuvent être utilisés pour déterminer les niveaux de production de protéine hétérologue de la levure transformée par comparaison avec des courbes d&#39;étalonnage. Pour des fins de démonstration et de montrerproduction réussie d&#39;une protéine très couramment utilisé dans la levure biologie, ce manuscrit présente transformation avec la protéine de plasmide codant pour fluorescente verte (GFP), ce qui permet une détection ultérieure en utilisant la microscopie de fluorescence. Tout aussi important pour la production d&#39;organismes probiotiques qui expriment la protéine hétérologue est la bonne administration et la détection de ces micro-organismes dans les tissus gastro-intestinaux, comme il est décrit dans les parties trois et quatre. L&#39;administration de levure recombinante par gavage par voie orale permet de réceptionner des quantités contrôlées de levure directement dans l&#39;estomac, à partir duquel souris C57BL / 6 sont naturellement incapables de 18 vomissements. Cependant, la manipulation des animaux impropre et gavage peuvent entraîner des lésions de l&#39;œsophage et de perforation, perforation gastrique, l&#39;administration de la trachée, et une pneumonie par aspiration 19,20. Une mauvaise technique et l&#39;inexpérience peuvent en outre augmenter la variabilité dans les réponses immunitaires murines et resu expérimentaleLTS, qui ont été attribués au stress des animaux lors de gavage oral 21,22. Pratique dans la bonne technique peut donc non seulement atténuer l&#39;inconfort des animaux, mais peut aussi augmenter la précision des résultats expérimentaux. Ce manuscrit décrit et démontre la manipulation des animaux et gavage oral pour l&#39;administration des doses contrôlées de levure recombinante. Enfin, il est essentiel de confirmer la livraison réussie de levure recombinante en analysant les tissus lymphoïdes de la présence de la levure et de la protéine hétérologue. Les tissus immunitaires gastro-intestinaux qui peuvent plus facilement et de manière prévisible être examinés pour déterminer la présence de la levure sont les plaques de Peyer. Les plaques de Peyer sont des organes lymphoïdes secondaires le long de l&#39;intestin grêle qui sont les principaux sites de muqueuses induction de la réponse immunitaire 23. Les antigènes de la lumière sont transmis à travers transcellularly microfold (M) des cellules de l&#39;épithélium et sont libérés dans les plaques de Peyer, exposant ainsi enfermerd cellules présentant l&#39;antigène à intestinale au contenu de la lumière. Bien que l&#39;absorption des particules à travers l&#39;épithélium intestinal peut également être réalisée par les cellules caliciformes, ces cellules ont été représentés pour ne prendre que des particules inférieure à 0,02 um de diamètre 24. Dendrites transépithéliaux étendus à partir de cellules dendritiques CD103 + (DC) prennent également de petites particules à partir du lumen intestinal 25; cependant, il n&#39;y a pas de rapports démontrant que CD103 + DC prennent des particules plus grosses que les bactéries. Ainsi, la levure probiotique intact, de taille moyenne comprise entre 3-6 um de diamètre, sont plus susceptibles d&#39;être absorbé par les cellules M et transféré dans les plaques de Peyer. Décrit ici est un protocole pour la collecte et le dépistage des plaques de Peyer de levure recombinante viable, bien que cette procédure peut également être facilement adapté pour évaluer l&#39;absorption de bactéries probiotiques. En résumé, l&#39;évaluation de la levure probiotique recombinant pour la livraison de laprotéines thérapeu- à l&#39;intestin nécessite la maîtrise des techniques de laboratoire couvrant la biologie moléculaire à la manipulation des animaux et de l&#39;immunologie. Présentés ici sont des protocoles pour 1) la génération et la sélection de souches de levure auxotrophes qui peut être facilement sélectionné négativement sans antibiotiques, 2) protocoles alternatifs pour transformer la levure et permettre l&#39;expression de la protéine hétérologue, 3) des démonstrations de techniques de manipulation des animaux appropriés et gavage oral pendant livraison intragastrique de levure recombinante, et 4) des protocoles pour le patch de la dissection de Peyer et le dépistage de la levure recombinant viable et protéine hétérologue fonctionnel. La combinaison de ces protocoles de permettre la production et l&#39;essai d&#39;une souche de levure probiotique capable de délivrer la protéine thérapeutique hétérologue dans le tractus gastro-intestinal.

<table><tbody><tr><td>Spectrophotomètre SmartSpec 3000</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>Exemple de spectrophotomètre pour déterminer la concentration cellulaire et la 600</sous-> des cultures de levure</td></tr><tr><td>Nouveau-Brunswick Tambour à rouleaux</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>Exemple de tambour à rouleaux pour l’incubation de cultures de levures</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400 Stratagene</td><td></td><td>400075-03</td><td>Exemple de stratalinker</td></tr><tr><td>Stuart Colony Counter SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>Plate support avec grossissement enregistre le nombre de colonies lors de la détection de la pression du stylo</td></tr><tr><td>Scienceware Colony Counter&nbsp ;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>Compteur de colonie à main</td></tr><tr><td>Réplique du dispositif de placage</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>Exemple de réplique de support de placage et de tampons&nbsp ;</td></tr><tr><td>Carrés de velours</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>Épandeurs de cellules stériles en forme de L</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>Acide désoxyribonucléique, simple brin à partir de testicules de saumon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>Exemple d’ADN porteur pour la levure Transformation LiOAc</td></tr><tr><td>Aiguilles de gavage</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&nbsp ; 002</td><td>Pour les souris de 15 à 20 g, l’aiguille suggérée est une aiguille à gavage réutilisable de calibre 22 (boule de 1,25 mm), longue et droite. Pour les souris pesant plus de 20 g, calibre 20 ou plus Des aiguilles à gavage droites ou incurvées peuvent être utilisées</td></tr> 1 <tr><td>ml Seringue à tuberculine jetable stérile à embout coulissant</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>Pince émoussée telle que Electron Microscopy Sciences Pointe dentelée de 7" (178 mm), pince à prise large</td><td>Microscopie électronique</td><td>Sciences 77937-28</td><td>Exemple de pince émoussée nécessaire pour la dissection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection droits et courbes</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72966-02 et 72966-03</td><td>Exemples de ciseaux nécessaires pour la dissection</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Le développement d’un traitement oral recombinant permettrait de cibler plus directement le système immunitaire muqueux et d’améliorer la capacité à combattre les troubles gastro-intestinaux. L’adaptation de la levure probiotique en particulier pour cette approche comporte plusieurs avantages. Ces souches ont non seulement le potentiel de synthétiser une grande variété de protéines hétérologues complexes, mais sont également capables de survivre et de protéger ces protéines pendant leur transit dans l’intestin. Cependant, cette approche nécessite une expertise dans de nombreuses techniques de laboratoire diverses qui ne sont généralement pas utilisées en tandem. De plus, bien que les protocoles individuels de transformation des levures soient bien caractérisés pour les souches de laboratoire couramment utilisées, l’accent est mis ici sur les approches alternatives et l’importance d’optimiser la transformation pour les souches probiotiques moins bien caractérisées. Le détail de ces méthodes facilitera la discussion sur les meilleures approches pour tester la levure probiotique en tant que véhicules d’administration de médicaments par voie orale et servira effectivement à faire progresser le développement de cette nouvelle stratégie de thérapie gastro-intestinale.

Génération d&#39;une courbe de survie après irradiation UV nécessite placage des cellules de levure dilués de telle sorte que les unités formant colonie (UFC) distinctes sont capables de former. Chaque échantillon de 500 ul recueillies comme décrit ci-dessus contient environ 5 x 10 6 cellules; Toutefois, plus de 100 colonies par plaque sont difficiles à distinguer avec précision. Placage échantillon non dilué ainsi que série des dilutions 1:10 de cellules irradiées assure ains...

Nous présentons ici une description unifiée de techniques qui peuvent être utilisés pour développer, transformer, administrer et tester l&#39;expression de protéine hétérologue de la levure probiotique Saccharomyces boulardii.

Transformation de la levure probiotique et leur récupération à partir gastro immunitaire tissus suivants gavage chez des souris

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

L'objectif général de ces procédures est de développer une souche de levure probiotique qui puisse être facilement transformée pour exprimer et délivrer une protéine hétérologue dans le tractus gastro-intestinal murin. Le principal avantage de ces techniques réside dans leur capacité à permettre une génération rapide de souches de levures probiotiques oxytrophes. Ces levures mutantes peuvent ensuite être manipulées génétiquement sans avoir recours à une sélection par antibiotiques.L'administration par gavage oral chez la souris et la collecte des plaques de Peyer permettent également de vérifier l'adhérence des levures mutantes aux tissus immunitaires gastro-intestinaux. Ces méthodes aideront à répondre à des questions clés dans le domaine de la vaccination orale et faciliteront des expériences testant des probiotiques pour la délivrance de thérapeutiques gastro-intestinales. Après avoir préparé le milieu YPD et fait croître les levures toute la nuit jusqu'à la saturation, diluez les cellules d’un facteur 1 à 10 dans de l’eau dans une cuvette en plastique.Ensuite, étalonnez un spectrophotomètre et déterminez la densité optique de la culture de nuit. À l’aide de 20 millilitres d’eau distillée stérile, diluez les cellules jusqu’à une concentration de 10 puissance sept cellules par millilitre. Ensuite, versez les cellules diluées dans une boîte de Pétri en plastique stérile et, après avoir retiré le couvercle, placez la boîte dans un appareil de réticulation UV.Ensuite, exposez la solution cellulaire à des doses croissantes cumulatives d'irradiation UV, en prélevant des aliquotes de 500 microlitres après chaque incrément afin d'établir une courbe de mortalité, et identifiez le pourcentage optimal de survie pour le criblage. Utilisez de l'eau stérile pour diluer les cellules de manière sériée selon des facteurs allant de un à dix. Ensuite, récupérez les cellules de chaque dilution par centrifugation à vitesse maximale pendant une minute.Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans un volume de 100 microlitres d'eau stérile approprié pour la mise en culture des cellules de levure. Ensuite, pipetez le volume total des cellules resuspendues sur des boîtes contenant un milieu solide YPD, et utilisez un répandeur stérile pour répartir uniformément les cellules sur chaque boîte. Tracez une courbe de survie et déterminez la dose d'irradiation UV à utiliser pour le criblage selon le protocole décrit dans le texte.Après avoir exposé les levures à la dose d'irradiation UV choisie pour le criblage, récupérez par centrifugation le volume total des cellules irradiées et utilisez 100 microlitres d'eau stérile pour resuspendre le culot. Étalez sur un milieu minimum contenant du 5-FOA selon le protocole décrit, afin de sélectionner vos trois nouvelles souches auxotrophes en oxytrophie. Confirmez le phénotype ura3 négatif en utilisant l'extrémité d'un cure-dent stérile pour prélever une partie d'une colonie unique sur la boîte de 5-FOA, puis repiquez-la en stries sur des boîtes YPD, 5-FOA et sans uracile.Enveloppez les plaques et incubez-les retournées à 30 degrés Celsius pendant deux à quatre jours. Confirmez le statut oxytrophe en vérifiant la croissance des colonies sur les milieux YPD et 5-FOA, mais pas sur les plaques sans uracile. Après avoir confirmé le statut URA-3 négatif des levures irradiées, préparez une filtration nocturne pour la transformation par acétate de lithium, en inoculant 10 millilitres de YPD avec une colonie mutante unique, puis incubez dans une pièce chaude à 30 degrés Celsius.Le jour suivant, utilisez 50 millilitres de YPD frais et tiède pour diluer les cultures de nuit à une DO600 comprise entre 0,16 et 0,2, puis incubez les cellules dans un agitateur orbital réglé à 200 tr/min, jusqu'à ce que la culture atteigne environ 1 × 10⁷ cellules par millilitre, ce qui prend généralement environ quatre heures. Après avoir lavé les cellules avec de l'eau et de l'acétate de lithium selon le protocole, ajoutez 50 microlitres de cellules resuspendues à une mixture de transformation contenant de l'ADN plasmidique et de l'ADN vecteur. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de PEG, de TE et d'acétate de lithium, puis vortexez.Incuber les préparations à 30 degrés Celsius sur un agitateur orbital à 200 tr/min pendant 30 minutes. Poursuivre avec la transformation comme décrit dans le protocole écrit. Après avoir préparé les cultures de levures selon le protocole écrit, utiliser un hématimètre pour déterminer la concentration cellulaire, puis ajuster à 10 puissance 9 cellules par millilitre.Centrifuger les cellules à 2500 fois G pendant trois minutes. Ensuite, verser le surnageant et resuspendre les cellules en ajoutant le volume approprié d'eau stérile, puis en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Fixer une aiguille de gavage de calibre approprié sur une seringue stérile d'un millilitre, charger l'échantillon de levure et éliminer toutes les bulles d'air.Charger une seringue supplémentaire avec de l'eau stérile pour la gavage des souris témoins. À l'aide de la main non dominante, prendre la souris à gaver et, avec l'index et le pouce, saisir fermement la peau autour du cou. Glisser la queue sous le petit doigt.Veillez à ce que la prise soit ferme et empêche la souris de bouger la tête. Ensuite, insérez délicatement l'aiguille de gavage dans l'œsophage de la souris en orientant l'aiguille le long du palais et de l'arrière de la gorge, en restant légèrement à gauche du centre. Attendez que la souris avale la boule de l'aiguille.Si une résistance est ressentie ou si la souris halète, retirez délicatement l'aiguille et essayez à nouveau de localiser l'œsophage. Une fois que la souris a avalé l'ampoule de l'aiguille d'administration, appuyez doucement sur le piston de la seringue pour administrer la levure directement dans l'estomac de la souris. Retirez délicatement l'aiguille d'administration de l'estomac et de l'œsophage de la souris, puis remettez la souris dans sa cage.Vérifiez que la souris respire et bouge normalement afin de s'assurer que la gavage a été correctement effectuée. Après avoir sacrifié la souris conformément au protocole décrit, placez-la de manière à exposer complètement l'abdomen, puis vaporisez de l'éthanol à 70 % sur la région abdominale. À l’aide de ciseaux, pratiquez une incision transversale à travers le pelage et la peau.Ensuite, écarter manuellement l'incision pour mieux exposer le péritoine, la mince couche séreuse qui recouvre les organes abdominaux. Soulever délicatement le péritoine et pratiquer une incision transversale afin d'exposer les intestins. Puis, utiliser une pince effilée pour détacher soigneusement l'intestin grêle des artères mésentériques, de la graisse et des autres tissus.Exposer l'intestin grêle depuis l'estomac, situé dans le quadrant supérieur gauche de l'abdomen de la souris, jusqu'au caecum, la grande poche de tissu intestinal située au début de l'intestin grêle. Ensuite, isoler les plaques de Peyer en recherchant des fragments de tissu opaque d'environ un à deux millimètres de diamètre, de forme approximativement circulaire, le long de l'intestin grêle. Puis, à l'aide de ciseaux courbes pour la dissection, découper la calotte de la plaque de Peyer, en laissant des marges afin de s'assurer qu'aucun tissu environnant n'est prélevé.Transférez les plaques de Peyer disséquées dans du IMDM complet. Ensuite, versez la solution contenant les plaques de Peyer sur un tamis cellulaire de 40 micromètres. Après avoir lavé les plaques de Peyer avec du IMDM complet, utilisez le piston d'une seringue d'un millilitre pour broyer délicatement le tissu, puis recueillez les cellules dans un tube de 50 millilitres.Centrifuger les cellules filtrées à 1800 tr/min pendant sept minutes. Ensuite, ensemencer et analyser les cellules selon le protocole décrit dans le texte. Cette figure montre un ensemencement à partir d'une dilution en série de cellules de S. boulardii irradiées.La dilution en série garantit que l'utilisation de CF pourrait être dénombrée à chaque dose UV. À partir de ces images de boîtes de levure, la croissance constante des colonies mutantes sur les milieux YPD et 5-FOA, mais pas sur les milieux sans uracile, indique un phénotype oxytrophe moins uracile. Ce graphique illustre l'efficacité de transformation du type sauvage S. boulardii, comparé à S. cerevisiae, en utilisant les deux techniques : l'acétate de lithium et l'électroporation.Bien que la transformation par l'acétate de lithium soit très efficace pour S. cerevisiae, l'efficacité de transformation pour S. boulardii est grandement améliorée en utilisant l'électroporation. Sur ces images en champ clair et en fluorescence, S. cerevisiae transformé avec un plasmide URA3 portant GFE montre une expression fonctionnelle d'une protéine hétérologue. Sur cette figure, un exemple d'utilisation de CF viable détecté à partir de plaques de Peyer après la dissection de l'animal est présenté.Un rendement typique d'UFC récupérées par souris est inférieur à 10. Vous devriez maintenant bien comprendre comment générer des souches mutantes oxytrophes de levures probiotiques, en utilisant la mutagenèse par UV. Nous avons également décrit comment évaluer la capacité de ces levures à exprimer une protéine hétérologue et à adhérer aux plaques de Peyer de l'intestin grêle de la souris.Après avoir suivi ces procédures, d'autres méthodes, telles que le dosage immunoenzymatique (ELISA) et la microscopie à fluorescence, peuvent être utilisées pour évaluer le repliement correct et la fonction des protéines hétérologues exprimées.

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