Name: Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez l'imagerie des organites subcellulaires dans les embryons vivants de Danio rerio. Cette technique permet d'étudier la dynamique des mitochondries et des centrosomes in vivo pour la biologie cellulaire neuronale.

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P.E. est soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 et la Graduate School de la Technische Universität München (TUM-GS). G.P. a été soutenu par TUM-GS. L.T. est soutenu par une bourse de l’EMBO (EMBO ALTF 108-2013). Les travaux de D.P. sur le poisson-zèbre ont été soutenus par la DFG par le biais du Sonderforschungsbereich « Mécanismes moléculaires de la neurodégénérescence » (SFB 596) ; le Center for Integrated Protein Sciences (Munich) et le septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7/2007-2013) dans le cadre de la convention de subvention n° 200611 (MEMOSAD). Il est actuellement boursier de la New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller et a été soutenu par une bourse de l’Académie allemande des sciences Leopoldina. L.G. est soutenu par le financement de la DFG à travers le SFB 870 « Assemblage et fonction des circuits neuronaux », projet A11. 
Nous remercions Kristina Wullimann pour l’entretien de notre installation de pisciculture, Yvonne Hufnagel pour le soutien technique et Thomas Misgeld pour les commentaires sur le manuscrit. Nous sommes reconnaissants à R. Köster (Technische Universität Braunschweig) de nous avoir fourni le vecteur M1 Medusa (pSKmemmRFP :5xUAS :H2B-CFP :5xUAS :Centrin2-YFP) à partir duquel nous avons cloné Centrin-YFP et S.C. Suzuki et T. Yoshimatsu (Université de Washington) pour avoir fourni la cassette 14xUAS :MA-céruléenne que nous avons utilisée pour générer la construction du rapporteur pour créer CentrinFish. Nous remercions également S.C. Suzuki et T. Yoshimatsu (Université de Washington) pour la lignée transgénique Otx2 :Gal4, A. Sagasti pour la construction Sensory :Gal4-VP16 (UCLA) et M. Nonet (Université de Washington à St. Louis) pour le vecteur pCold Heart Tol2. Nous remercions Bettina Schmid, Alexander Hruscha et Christian Haass (Centre allemand pour les maladies neurodégénératives de Munich - DZNE) d’avoir contribué au développement de MitoFish.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous démontrons la polyvalence du système d&#39;expression Gal4-UAS aux mitochondries tag fluorescence, centrosomes et les membranes cellulaires de types cellulaires spécifiques in vivo dans des embryons de poisson zèbre. De nombreuses protéines de fusion fluorescentes qui marquent les autres organites ou structures sous - cellulaires peuvent être trouvés dans la littérature et peuvent être obtenus auprès du laboratoire respectif, les sources commerciales ou des dépôts de plasmides non commerciaux (par...

L&#39;imagerie in vivo fournit une visualisation directe des comportements cellulaires dans le contexte le plus physiologique. La transparence des embryons de poisson zèbre, leur développement rapide et externe et un riche éventail d&#39;outils génétiques qui permettent l&#39; étiquetage fluorescent ont tous contribué à l&#39;utilisation croissante de la microscopie in vivo pour élucider la dynamique des événements clés du développement. Les études d&#39;imagerie de développement du système nerveux chez le poisson zèbre ont par exemple considérablement élargi notre connaissance du comportement des cellules progénitrices neurales et le sort de leur progéniture , y compris leur migration ultérieure, la différenciation et l&#39; intégration du circuit 1-8. Le décor est désormais planté pour étudier la dynamique subcellulaire qui sous-tendent ces comportements cellulaires. En effet, le poisson zèbre sont déjà exploitées comme des outils pour in vivo la biologie cellulaire. Il est maintenant possible de visualiser les mitochondries 9-11, centrosomes 2,8,12-14, Golgi 15Le cytosquelette d&#39; actine et microtubules 4 16, 17 endosomes et les composants de la membrane apicale complexe 1,18, entre autres structures sous - cellulaires dans les embryons de poisson zèbre in vivo. Jusqu&#39;à présent, une grande partie de ce qui est connu sur la fonction de ces organites vient d&#39;étudier leur comportement dans les cellules cultivées. Bien que des études in vitro ont donné un remarquable aperçu de la biologie cellulaire, les cellules en culture ne représentent pas pleinement la complexité de la situation in vivo et ne reflètent donc pas nécessairement la fonction et la dynamique des organites intracellulaires in vivo. Embryons de poisson zèbre offrent une solution viable en alternative vivo d&#39;étudier la dynamique subcellulaire. Comme les vertébrés, le poisson - zèbre possède de nombreux systèmes d&#39;organes (par exemple, la rétine neurale) qui sont homologues à celles trouvées chez les espèces de mammifères. En outre, les embryons de poisson zèbre sont de plus en plus utilisés pour modéliser les maladies humaines 19,20 </sup&gt;, y compris ceux qui sont liés à la fonction centrosomale (par exemple, microcéphalie 21 et amaurose 22 congénitale de Leber) et de la fonction mitochondriale (par exemple, la maladie de Parkinson 23, tauopathies 10,24 et le syndrome de Barth 25). imagerie in vivo au niveau cellulaire et subcellulaire dans ces cas, permettra une meilleure compréhension de la biologie des cellules sous-jacentes de ces états pathologiques. L&#39;objectif général des méthodes décrites ici est de fournir un guide complet pour enquêter sur les organites et d&#39; autres structures subcellulaires dans les embryons de poisson zèbre en utilisant la microscopie optique in vivo. L&#39;ensemble du flux de travail impliqués dans la visualisation et le suivi des structures intracellulaires in vivo est décrit - des approches d&#39;étiquetage génétiques, de générer transitoirement exprimer et de poissons transgéniques stables, et enfin à l&#39; imagerie utilisant grand champ et la microscopie confocale. Bien que chacun de ces procedures est utilisé par de nombreux laboratoires de poisson zèbre, les protocoles décrits sont optimisés et rationalisés pour étudier la dynamique des structures subcellulaires. Deux aspects spécifiques des travaux décrits ici méritent mention: Tout d&#39;abord, l&#39;utilisation du système d&#39;expression Gal4-UAS dans de multiples configurations pour génétiquement organites d&#39;étiquettes dans types cellulaires spécifiques. Deuxièmement, une comparaison directe de grand champ et la microscopie confocale à des structures subcellulaires d&#39;image in vivo. Les stratégies actuelles pour modifier génétiquement des organites d&#39;étiquettes et autres structures sous - cellulaires chez le poisson zèbre , soit utiliser des ARNm coiffés 1,4,8 ou des constructions d&#39;ADN sur la base , où les éléments promoteurs entraînent directement l&#39;expression des protéines de fusion 9,14,15 transcrit in vitro coiffé résultats d&#39;ARN in. rapide et large expression, ce n&#39;est pas spécifique du tissu cependant. En outre, les niveaux d&#39;expression diminuent au fil du temps que l&#39;ARN coiffé est dilué ou dégradé. Ainsi, l&#39;utilisation d&#39;ARN à base deconstruit pour examiner la dynamique des organites à des stades ultérieurs de développement est limitée (généralement jusqu&#39;à 3 jours après la fécondation). Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant des constructions d&#39;ADN, où le contrôle spatial et temporel d&#39;expression est déterminé par des éléments spécifiques du promoteur. Quand les constructions d&#39;ADN sur la base sont utilisés dans le contexte du système Gal4-UAS des améliorations significatives des niveaux d&#39;expression du transgène sont observées 26,27. Dans ce système d&#39;expression bipartite éléments promoteurs spécifiques du type cellulaire conduisent l&#39;expression d&#39;un activateur de transcription de Gal4, tandis que les gènes rapporteurs sont clonés en aval de la séquence d&#39;activation en amont Gal4 de liaison (UAS). En combinant UAS journalistes avec les pilotes Gal4 appropriés, l&#39;expression peut être limitée aux types cellulaires spécifiques, contourner la nécessité de cloner des gènes rapporteurs derrière des promoteurs différents à chaque fois un motif d&#39;expression spécifique est souhaitée. En outre, l&#39;expression de multiples gènes rapporteurs UAS peut êtreentraînés par un seul activateur de Gal4. Le système Gal4-UAS fournit donc une approche génétique polyvalent et flexible pour l&#39;étiquetage subcellulaire. Grand champ et microscopes confocaux sont les chevaux de bataille de la plupart des laboratoires. Les systèmes à grand champ utilisent généralement une lampe à arc en tant que source de lumière et détecter la lumière émise par une caméra sensible qui est placé à l&#39;extrémité du trajet lumineux. Cette modalité d&#39;imagerie est généralement limitée à des échantillons minces comme hors de la lumière de mise au point obscurcit les informations de mise au point dans des échantillons plus épais. Microscopes confocale diffèrent des systèmes à champ large en ce qu&#39;ils sont construits pour favoriser les signaux qui proviennent du plan focal par rapport à ceux qui sont originaires de mise au point ( par exemple, «sectionnement optique») 28. Pour réaliser un sectionnement optique à sténopé est placée dans le chemin d&#39;émission dans une position conjuguée à la source de lumière ponctuelle. Les lasers sont utilisés en tant que sources de lumière et les signaux sont détectés avec des tubes photomultiplicateurs (PMT). Pratiquement, un laserfaisceau est glissée sur l&#39;échantillon point par point et l&#39;émission de fluorescence à chaque point (pixel) est détecté par le PMT. Ici, nous l&#39;image les mêmes structures subcellulaires dans la vie des embryons de poisson zèbre utilisant à la fois grand champ et la microscopie confocale pour fournir une comparaison directe des deux modalités de microscopie. L&#39;objectif sous-jacent de fournir de telles comparaisons est d&#39;offrir des lignes directrices pour le choix technique de microscopie la plus appropriée pour la question spécifique à portée de main. En utilisant les approches décrites ici, nous démontrons Gal4-UAS étiquetage génétique basée des mitochondries et centrosomes. Ces organites sont imagés dans différents types de cellules du système nerveux et dans les cellules musculaires en utilisant grand champ et la microscopie confocale à démontrer la pertinence de chaque modalité d&#39;imagerie. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour enquêter sur d&#39;autres organites et des structures subcellulaires dans l&#39;embryon de poisson zèbre vivant.

<table><tbody><tr><td>Agarose (2-hydroxyéthylagarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>Température de gélification basse Type VII</td></tr><tr><td>Chauffe-bloc</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixeur compact</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 Hydrate de nitrate de calcium, 99,996 %&nbsp ;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>Pour préparer la caméra CCD 30x de Danieau</td></tr><tr><td></td><td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Coated Dumont #5 Forceps</td><td>Dumont - Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td>#5 Forceps</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage de la parabole</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>Anneau chauffant</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate méthanesulfate</td><td>sel PharmaQ</td><td>Tricaïne PharmaQ-25g</td><td>Tricaïne (anesthésique)</td></tr><tr><td>Microscope de dissection de fluorescence</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GeneClean kit</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>Plats de culture à fond de verre</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Boîte de Pétri de 35 mm, micropuits de 14 mm, verre de protection n° 0</td></tr><tr><td>Aiguilles en verre</td><td>World Precision Instruments Inc.&nbsp ;</td><td>TW100F-4</td><td>Pour micro-injections</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>Pour préparer 30x Graisse sous vide poussé Danieau’s</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning&nbsp ;</td><td>DCC000001242 150g</td><td>Graisse au dioxyde de silicium</td></tr><tr><td>KCl 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>Pour préparer 30x</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O de Danieau &nbsp ; Sulfate de magnésium heptahydraté 98+ % A.C.S réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>Pour préparer 30x</td></tr><tr><td>Microinjecteur de Danieau&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td>Microchargeurs</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 ul</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Porte-micropipette</td><td>Intracel</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Pour transcrire PCS-Transposase</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra >99.5 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>Pour préparer le nanophotomètre</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de Danieau <td>30x Pour mesurer la concentration d’ADN/ARN</td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Flaming/Brown</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&nbsp ;</td><td>Objectif</td><td></td><td>à cône d’immersion dans l’eau</td></tr><tr><td>Nikon N-Phénylthiourée Grade I, env. 98 %</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU (empêche la pigmentation)</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Sarstedt AG&nbsp ;</td><td>821472</td><td>92 x 16 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>Moules en plastique&nbsp ;</td><td>Outils scientifiques adaptatifs</td><td>TU-1</td><td>Pour les micro-injections</td></tr><tr><td>Couvercle en plexiglas avec un trou</td><td>Sur</td><td></td> mesure <td>Le trou dans le couvercle en plexiglas doit être 3 mm plus grand que le diamètre de l’objectif du cône de trempage d’eau</td></tr><tr><td>Passoire à thé (plastique)</td><td></td><td></td><td>Pour collecter les œufs de poisson-zèbre</td></tr><tr><td>Contrôleur de température</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>Double température automatique </td></tr><tr><td>Contrôleur Pipettes de transfert</td><td>Sarstedt AG&nbsp ;</td><td>86.1171</td><td>Pipettes de transfert en plastique de 3,5 ml</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>Objectif à cône d’immersion dans l’eau</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope grand champ</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU (50x Stock)</td><td></td><td></td><td>Dissoudre 76 mg de PTU dans 50 ml d’eau distillée Remuer vigoureusement à température ambiante&nbsp ; Conserver à -20 oC dans 1 ml d’aliquotes Utiliser à 1x solution de travail</td></tr><tr><td>Tricaïne (20x Stock)</td><td></td><td></td><td>Dissoudre 200 mg de Tricaïne dans 48 ml d’eau distillée Ajouter 2 ml de base 1M Tris (pH9) Ajuster au pH 7&nbsp ; Conserver à -20 oC dans 1 ml d’aliquotes Utilisation à 1x solution de travail</td></tr><tr><td>Solution de Danieau (30x stock)</td><td></td><td></td><td>1,740 mM&nbsp ; NaCl&nbsp ; 21 mM&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; KCl&nbsp ; 12 mM&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; MgSO4.7H2O&nbsp ; 18 mM&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Ca (NO3)2 150 mM&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Tampon HEPES&nbsp ; Eau distillée jusqu’à 1 L&nbsp ; Store à 4 oC&nbsp ; Utilisation à une solution de travail 0,3x</td></tr></tbody></table>

imagerie structures subcellulaires dans le embryo living zebrafish

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

L’imagerie in vivo offre un accès sans précédent au comportement dynamique des structures cellulaires et subcellulaires dans leur contexte naturel. La réalisation de telles expériences d’imagerie chez des vertébrés supérieurs tels que les mammifères nécessite généralement un accès chirurgical au système étudié. L’accessibilité optique des poissons-zèbres embryonnaires et larvaires permet de contourner ces procédures invasives et permet l’imagerie dans l’organisme intact. En effet, le poisson-zèbre est maintenant un modèle bien établi pour visualiser les comportements cellulaires dynamiques à l’aide de la microscopie in vivo dans un large éventail de contextes de développement, de la prolifération à la migration et à la différenciation. Un développement plus récent est l’utilisation croissante du poisson-zèbre pour étudier les événements subcellulaires, y compris le trafic mitochondrial et la dynamique des centrosomes. La relative facilité avec laquelle ces structures subcellulaires peuvent être marquées génétiquement par des protéines fluorescentes et l’utilisation de techniques de microscopie optique pour les imager transforment le poisson-zèbre en un modèle in vivo de biologie cellulaire. Nous décrivons ici des méthodes permettant de générer des constructions génétiques qui marquent des organites par fluorescence, en mettant en évidence les mitochondries et les centrosomes comme exemples spécifiques. Nous utilisons le système bipartite Gal4-UAS dans plusieurs configurations pour restreindre l’expression à des types de cellules spécifiques et fournir des protocoles pour générer des poissons transgéniques stables et exprimant transitoirement. Enfin, nous fournissons des lignes directrices pour choisir les méthodes de microscopie optique les plus appropriées pour l’imagerie de la dynamique subcellulaire.

Ici, l&#39;utilisation du grand champ et la microscopie confocale à la mitochondrie et centrosomes dans la vie des embryons de poisson zèbre image est directement comparé et contrasté. En fonction de la localisation des cellules dans lesquelles la dynamique des organites doivent être examinés et que la fréquence inhérente des événements subcellulaires spécifiques, en général, soit à grand champ ou la microscopie confocale est le meilleur choix. Nous imagé organites dans les neurones RB s...

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Le but global de cette méthode d'imagerie est d'étudier les organites subcellulaires chez un vertébré in vivo. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie cellulaire neuronale, telles que la dynamique des mitochondries ou des centrosomes dans un contexte in vivo. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'ensemble de l'expérience peut être réalisé chez un vertébré intact, sans nécessiter aucune intervention chirurgicale.Cette méthode peut fournir des informations non seulement sur la dynamique subcellulaire dans des conditions physiologiques, mais peut également être appliquée à l’étude de modèles pathologiques, tels que la maladie d’Alzheimer. Après avoir généré des embryons exprimant de façon transitoire par microinjection, ou obtenu des embryons à partir de lignées transgéniques stables, conformément au protocole décrit, examinez les œufs morts ou non fécondés à la fin de la première journée. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférez les embryons viables dans une solution de Danieau contenant 1x PTU afin d’empêcher la formation de pigments, et maintenez les embryons dans la solution de Danieau contenant 1x PTU jusqu’à l’analyse de l’expression du transgène.Le jour de l'expérience d'imagerie, utiliser un microscope stéréofluorescent pour examiner les embryons anesthésiés afin de détecter l'expression du transgène. Ensuite, transférer les embryons sélectionnés vers une boîte de Pétri séparée contenant du tampon de Danieau avec du PTU 1x et de la tricaïne 1x. Une fois les embryons anesthésiés, pipeter délicatement quelques-uns d'entre eux dans de l'agarose à bas point de fusion contenant du PTU 1x et de la tricaïne 1x, en transférant le moins de liquide possible afin d'éviter de diluer l'agarose.Transférez les embryons avec une petite quantité d'agarose dans une boîte de Pétri à fond en verre. Ensuite, travaillez relativement rapidement et utilisez une pince pour positionner les embryons dans l'orientation souhaitée selon la structure à imager. Les embryons doivent être correctement orientés, par exemple à plat sur le côté pour l'imagerie de la rétine ou d'un neurone de Rohon-Beard.Une orientation précise garantira une qualité d'imagerie optimale et améliorera la vitesse d'acquisition. Après avoir laissé la gélose durcir pendant au moins 15 minutes, ajoutez du tampon de Danieau contenant 1x PTU et 1x tricaine pour recouvrir les embryons. Pour réaliser une microscopie en champ large, équilibrez un plat contenant les poissons montés dans une chambre chauffante à 28,5 degrés Celsius, placez-le sur la platine d'un microscope en champ large, sélectionnez une zone d'intérêt, puis ouvrez le logiciel du microscope.Sous Éclairage, cliquez sur Paramètres de configuration pour définir les jeux de filtres appropriés selon la longueur d'onde d'intérêt. Sous Paramètres de la caméra, saisissez le temps d'exposition nécessaire pour acquérir une image adéquate. Ensuite, choisissez un objectif à immersion dans l'eau à longue distance de travail, dont le grossissement varie de 40x à 100x, possédant la plus grande ouverture numérique et corrigé chromatiquement.Cliquez sur « Live » pour choisir le champ de vision. Dans le cas d’un neurone R-B, observez le transport mitochondrial au niveau de l’axone principal, émanant du corps cellulaire ou dans l’arborisation périphérique. Ensuite, dans le menu ImageJ, cliquez sur le bouton de sélection rectangulaire et définissez une région d’intérêt, ou ROI.Et cliquez sur ROI dans la fenêtre de Micromanager. Après avoir sélectionné la ROI pour l'acquisition d'image, cliquez sur Arrêter et Enregistrer pour enregistrer la morphologie neuronale dans le canal YFP. Pour acquérir l'image du transport mitochondrial, cliquez sur Acquisition Multidimensionnelle.Ensuite, dans la fenêtre appelée Acquisition multidimensionnelle, sélectionnez le nombre de points temporels et l'intervalle entre les points temporels. Dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle, cliquez sur Canaux, puis ajoutez et définissez la longueur d'onde d'imagerie ainsi que la durée d'exposition. Cliquez sur Enregistrer les images pour enregistrer automatiquement les fichiers dans le dossier spécifique indiqué dans le chemin d'accès.Maintenant, cliquez sur Acquérir dans le coin supérieur droit pour démarrer l'imagerie en laps de temps. Pour la microscopie confocale, après avoir placé les embryons montés dans une chambre chauffante à 28,5 degrés Celsius sur la platine du microscope confocal, ouvrez le logiciel du microscope et cliquez sur Trans Lamp ou Epi Lamp. Ensuite, à l’aide des oculaires du microscope, utilisez respectivement la lumière transmise ou la fluorescence pour identifier la région d’intérêt.Dans la fenêtre des paramètres d'acquisition, vérifiez que l'objectif sélectionné pour l'imagerie correspond à celui qui apparaît dans le menu déroulant des objectifs disponibles. Ensuite, dans la fenêtre de contrôle d'acquisition d'image, cliquez sur le bouton de la liste des colorants et sélectionnez les fluorophores appropriés. Sinon, cliquez sur le bouton Chemin lumineux et colorants pour définir manuellement les paramètres.Dans la fenêtre Paramètres d'acquisition, ajustez le facteur de zoom et le rapport d'aspect de l'image numérisée afin d'obtenir la taille de pixel nécessaire pour résoudre au mieux les structures observées. Réglez la taille du pixel à environ la moitié de la résolution théorique de l'objectif, respectant ainsi le critère d'échantillonnage de Nyquist. Pour déterminer la taille du pixel d'une image acquise, cliquez sur le bouton I dans la fenêtre de contrôle d'acquisition d'image.Ensuite, réglez la vitesse de balayage à la plus rapide possible. Puis, dans la fenêtre de contrôle d'acquisition d'image, cliquez sur la moyenne de ligne de Kalman et réglez-la sur un facteur de deux ou trois pour réduire le bruit. Pour sélectionner un mode de balayage séquentiel permettant d'imager des fluorophores ayant des spectres chevauchants, cliquez sur Séquentiel et Ligne.Ensuite, ajustez la puissance de sortie des lignes laser concernées. Pour balayer en continu la région sélectionnée tout en ajustant les paramètres du détecteur pour chaque canal, cliquez sur XY Répéter ou sur Focus x2 ou Focus x4. Puis, ajustez la tension d'entrée (HV), le gain et le décalage pour chaque canal afin d'acquérir des images présentant la plage dynamique maximale de valeurs de gris.Appuyez maintenant sur Ctrl + H pour visualiser les images acquises à l’aide d’une table de correspondance qui identifie les pixels sous-saturés en bleu et les pixels sur-saturés en rouge, que l’on doit éviter dans les deux cas. Réévaluez la puissance de sortie des lignes laser concernées ainsi que les paramètres du détecteur. Pour définir les limites inférieure et supérieure du volume à imager, cliquez dans Réglage d’acquisition sur le bouton Fin Définir à la limite supérieure, puis focalisez-vous sur la limite inférieure et appuyez sur Début Définir.Pour vérifier la résolution en Z de l'objectif, dans le contrôle d'acquisition d'image, cliquez sur le symbole I. Sélectionnez ensuite une taille de pas égale à la moitié de la résolution en Z pour l'objectif donné. Dans la sous-fenêtre TimeScan, indiquez la fréquence à laquelle les Z-stacks doivent être acquis, ainsi que le nombre de fois où les images doivent être capturées, afin de configurer une série temporelle adaptée à la dynamique de la structure subcellulaire à imager.Cliquez sur les boutons Profondeur et Temps pour confirmer que la série en profondeur (Z-stack) et la série temporelle seront acquises. Enfin, cliquez sur le bouton XY Zt pour commencer l'acquisition d'images en laps de temps. Après l'acquisition des images, cliquez sur Série terminée dans l'interface logicielle.Et enregistrez les images au format OIB afin de conserver les images et les métadonnées associées. Cette figure montre des organites et des neurones R-B situés à la surface de l'embryon, visualisés par microscopie à grand champ et microscopie confocale. Ici, une acquisition en enregistrement temporel sur un microscope à grand champ a permis de suivre le déplacement d'une mitochondrie individuelle dans l'arborisation périphérique d'un neurone R-B.L'imagerie confocale est nettement plus lente et peut conduire à une sous-estimation de la dynamique de certains événements subcellulaires spécifiques. Les images de cellules rétiniennes acquises par microscopie en champ large souffrent d'un faible contraste, car les signaux fluorescents provenant d'un grand volume de tissu masquent les détails dans le plan focal. Ici, la capacité de sectionnement optique de la microscopie confocale améliore nettement le contraste.Les encarts montrent les détails d'une région de la couche nucléaire interne, avec une coloration des membranes cellulaires et des mitochondries. Sous l'effet d'un promoteur spécifique Gau-4 de neurone sensoriel, l'expression en mosaïque résultant des injections de UAS-mito-CFP et de UAS-MAY-FP permet le suivi de cellules individuelles sur plusieurs jours, comme observé ici sur un neurone sensoriel R-B à deux et trois jours post-fécondation. En plus des mitochondries, d'autres organites subcellulaires tels que les centrosomes peuvent être marqués par fluorescence.Dans cet exemple, deux cassettes UAS sur un unique construct continu ont permis l'expression de YFP ciblant le centrosome et de la céruleine ciblant la membrane dans les cellules rétiniennes. Les encarts montrent une cellule en phase M. Ce protocole complet nécessite plusieurs jours, depuis l'accouplement, la collecte des œufs, les injections, jusqu'à l'acquisition finale des images trois ou quatre jours après la fécondation.L'expérience d'imagerie proprement dite au microscope peut durer plusieurs minutes à une journée entière. Après cette procédure, d'autres organites comme les microtubules ou les peroxysomes peuvent être marqués et observés afin de comprendre leur dynamique in vivo. N'oubliez pas que le PTU est cancérigène et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Imagerie du développement vasculaire cérébral chez le poisson zèbre larvaire est décrite. Techniques pour faciliter l'imagerie 3D et modifier le développement vasculaire cérébral en utilisant des traitements chimiques sont également fournis.

Imagerie et de reconstruction 3D de structures vasculaires cérébraux embryonnaires poisson zèbre

Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

La méthode décrite ici permet une analyse time-lapse du développement des organes dans des embryons de poisson zèbre en utilisant une fluorescence microscope de dissection capables d'effectuer le sectionnement optique et des stratégies simples de réadaptation pour corriger la dérive focale et plane.

Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d&#39;imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

La mitose est essentielle à tout organisme vivant et les défauts entraînent souvent le cancer et des troubles du développement. En utilisant ce protocole d’imagerie et le poisson-zèbre comme système modèle, les chercheurs peuvent visualiser la mitose dans un organisme vertébré vivant et la multitude de défauts qui se produisent lorsque les processus mitotiques sont défectueux.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Développement de cils est vitale pour l’organogenèse appropriée. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour étiqueter et de visualiser les cellules ciliées du poisson-zèbre.

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

Ce protocole démontre l'immunofluorescence séquentielle et l'immunohistochimie sur des cryosections des embryons de poisson zèbre de stade précoce permettant des analyses précises de colocalisation dans des populations cellulaires spécifiques.

Immunofluorescence séquentielle et immunohistochimie sur les embryons de poissons zèbres cryosectionnés

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.

Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre

Découvrez l'imagerie des organites subcellulaires dans les embryons vivants de Danio rerio. Cette technique permet d'étudier la dynamique des mitochondries et des centrosomes in vivo pour la biologie cellulaire neuronale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

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