Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

L’objectif global de cette méthode d’imagerie est d’étudier les organites subcellulaires d’un vertébré in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire neuronale, telles que la dynamique des mitochondries ou des centrosomes dans un contexte in-vivo. Le principal avantage de cette technique est que l’ensemble de l’expérience peut être réalisée sur un vertébré intact, sans qu’il soit nécessaire de recourir à une intervention chirurgicale.

Cette méthode peut fournir des informations non seulement sur la dynamique subcellulaire dans des conditions physiologiques, mais elle peut également être appliquée à l’étude de modèles de thèse, tels que la maladie d’Alzheimer. Après avoir généré des embryons exprimant transitoirement par micro-injection, ou obtenu des embryons à partir de lignées transgéniques stables, selon le protocole de texte, à la fin du premier jour, dépister les ovules morts ou non fécondés. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférez les embryons viables dans la solution de Danieau contenant 1 x PTU pour prévenir la formation de pigments, et maintenez les embryons dans la solution de Danieau contenant 1 x PTU jusqu’au dépistage de l’expression transgénique.

Le jour de l’expérience d’imagerie, utilisez un microscope à dissection de fluorescence pour dépister l’expression transgénique des embryons anesthésiés. Transférez ensuite les embryons sélectionnés dans une boîte de Pétri séparée contenant le tampon de Danieau avec 1x PTU et 1x tricaïne. Une fois les embryons anesthésiés, pipetez-en doucement quelques-uns dans l’agarose à bas point de fusion contenant 1x PTU et 1x tricaïne, en transférant le moins de liquide possible pour éviter de diluer l’agarose.

Transférez les embryons avec une petite quantité d’agarose dans une boîte de Pétri à fond de verre. Ensuite, en travaillant relativement rapidement, à l’aide d’une pince, positionnez les embryons dans l’orientation souhaitée en fonction de la structure à imager. Les embryons doivent être correctement orientés, par exemple, à plat sur le côté pour l’imagerie de la rétine ou d’un neurone Rohon-Beard.

Une orientation précise garantira la meilleure qualité d’image et optimisera la vitesse d’acquisition. Après avoir laissé l’agarose se solidifier pendant au moins 15 minutes, ajoutez le tampon de Danieau avec 1x PTU et 1x tricaïne pour couvrir les embryons. Pour réaliser la microscopie à grand champ, après avoir équilibré une parabole de poisson monté dans une chambre de chauffe à 28,5 degrés Celsius, sur la platine d’un microscope à grand champ, et choisi une zone d’intérêt, ouvrez le logiciel du microscope.

Sous Éclairage, cliquez sur Paramètres de configuration pour définir les jeux de filtres appropriés pour la longueur d’onde qui vous intéresse. Sous Paramètres de l’appareil photo, entrez le temps d’exposition nécessaire pour acquérir une image appropriée. Ensuite, choisissez un objectif à cône d’immersion dans l’eau à longue distance de travail, allant d’un grossissement de 40x à 100x, qui a l’ouverture numérique la plus élevée et qui est corrigé chromatiquement.

Cliquez sur Live pour choisir le champ de vision. Dans le cas d’un neurone R-B, imagez le transport mitochondrial au niveau de l’axone souche, émanant du corps cellulaire ou dans l’arbre périphérique. Ensuite, dans le menu ImageJ, cliquez sur le bouton de sélection rectangulaire et définissez une région d’intérêt, ou ROI.

Et cliquez sur ROI dans la fenêtre du microgestionnaire. Après avoir sélectionné le retour d’intérêt de l’imagerie, cliquez sur Arrêter et enregistrer pour enregistrer la morphologie neuronale dans le canal YFP. Pour imager le transport mitochondrial, cliquez sur Multi-D Acquisition.

Ensuite, dans la fenêtre appelée Acquisition multidimensionnelle, sélectionnez le nombre de points temporels et l’intervalle entre les points temporels. Dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle, cliquez sur Canaux, puis ajoutez et définissez la longueur d’onde de l’imagerie et le temps d’exposition. Cliquez sur Enregistrer les images pour enregistrer automatiquement les fichiers dans le dossier spécifique indiqué dans l’itinéraire du répertoire.

Maintenant, cliquez sur Acquérir dans le coin supérieur droit pour démarrer l’imagerie en accéléré. Pour la microscopie confocale, après avoir placé les embryons montés dans une chambre de chauffe à 28,5 degrés Celsius sur la platine confocale, ouvrez le logiciel du microscope et cliquez sur Trans Lamp ou Epi Lamp. Ensuite, via les oculaires du microscope, utilisez respectivement la lumière transmise ou la lumière de fluorescence pour identifier la région d’intérêt.

Dans la fenêtre Paramètres d’acquisition, vérifiez que l’objectif choisi pour l’imagerie correspond à l’objectif qui apparaît dans le menu déroulant des objectifs disponibles. Ensuite, dans la fenêtre Contrôle d’acquisition d’image, cliquez sur le bouton de la liste des colorants et sélectionnez les fluorophores appropriés. Vous pouvez également cliquer sur le bouton Trajectoire de la lumière et colorants pour définir manuellement les paramètres.

Dans la fenêtre Paramètres d’acquisition, ajustez le facteur de zoom et les proportions de l’image numérisée pour obtenir la taille de pixel nécessaire pour résoudre au mieux les structures imagées. Réglez la taille des pixels à environ la moitié de la résolution théorique de l’objectif, suivant ainsi les critères d’échantillonnage de Nyquist. Pour déterminer la taille en pixels d’une image acquise, dans la fenêtre Contrôle d’acquisition d’image, cliquez sur le bouton I.

Ensuite, réglez la vitesse de numérisation sur la plus rapide possible. Ensuite, dans la fenêtre Contrôle de l’acquisition d’image, cliquez sur Moyenne de la ligne de Kalman et réglez-la sur un facteur de deux ou trois pour réduire le bruit. Pour sélectionner un mode de balayage séquentiel pour l’imagerie de fluorophores avec des spectres superposés, cliquez sur Séquentiel et Ligne.

Ensuite, ajustez la puissance de sortie des lignes laser concernées. Pour balayer en continu la région sélectionnée tout en ajustant les paramètres du détecteur pour chaque canal, cliquez sur Répétition XY ou Focus x2 ou Focus x4. Ensuite, ajustez HV, Gain et Décalage pour chaque canal afin d’acquérir les images qui ont la plage dynamique la plus élevée de valeurs de gris.

Maintenant, appuyez sur Ctrl plus H pour visualiser les images acquises via une table de correspondance qui identifie les pixels sous-saturés en bleu et les pixels sursaturés en rouge, deux éléments à éviter. Réévaluez la puissance de sortie des lignes laser pertinentes et les paramètres du détecteur. Pour définir les limites supérieure et inférieure du volume à imager, dans le paramètre d’acquisition, cliquez sur le bouton Fin du jeu à la limite supérieure, puis concentrez-vous sur la limite inférieure et appuyez sur Démarrer le jeu.

Pour vérifier la résolution Z de l’objectif, dans le contrôle d’acquisition d’image, cliquez sur le symbole I. Sélectionnez ensuite une taille de pas qui correspond à la moitié de la résolution Z pour l’objectif donné. Dans la sous-fenêtre TimeScan, entrez la fréquence à laquelle les piles Z doivent être acquises et le nombre de fois que les images doivent être acquises, afin de configurer une série chronologique appropriée à la dynamique de la structure subcellulaire à imager.

Cliquez sur les boutons Profondeur et Temps pour confirmer que la pile Z et les séries chronologiques seront acquises. Enfin, cliquez sur le bouton XY Zt pour commencer à acquérir des images en accéléré. Après l’acquisition de l’image, sur l’interface du logiciel, cliquez sur Série terminée.

Et enregistrez les images au format OIB pour enregistrer les images et les métadonnées associées. Cette figure montre des organites et des neurones R-B situés à la surface de l’embryon à l’aide de champs larges et de microscopie confocale. Ici, l’imagerie en accéléré sur un microscope à grand champ a été utilisée pour suivre le mouvement d’une mitochondrie individuelle dans l’arborescence périphérique d’un neurone R-B.

L’imagerie confocale est nettement plus lente et peut conduire à une sous-estimation de la dynamique d’événements subcellulaires spécifiques. Les images des cellules rétiniennes acquises par microscopie à grand champ souffrent d’un faible contraste, car les signaux fluorescents provenant d’un grand volume de tissu obscurcissent les détails dans le plan focal. Ici, la capacité de sectionnement optique de la microscopie confocale améliore sensiblement le contraste.

Les inserts montrent les détails d’une région de la couche nucléaire interne, avec marquage des membranes cellulaires et des mitochondries. Pilotée par le pilote Gau-4 spécifique d’un neurone sensoriel, l’expression en mosaïque des injections de UAS-mito-CFP et UAS MAY-FP permet de suivre les cellules individuelles pendant des jours, comme on le voit dans ce neurone sensoriel R-B deux et trois jours après la fécondation. En plus des mitochondries, d’autres organites subcellulaires, tels que les centrosomes, peuvent être marqués par fluorescence.

Dans cet exemple, deux cassettes UAS sur une seule construction contiguë ont piloté l’expression du YFP ciblé par le centrosome et du céruléen ciblé par la membrane dans les cellules rétiniennes. Les encarts montrent une cellule en phase M. Toute cette procédure nécessite plusieurs jours entre l’accouplement, le prélèvement d’ovules, les injections, puis enfin l’imagerie trois ou quatre jours après la fécondation.

L’expérience d’imagerie au microscope peut prendre de quelques minutes à une journée entière. À la suite de cette procédure, d’autres organites comme les microtubules ou les peroxysomes peuvent être marqués et imagés afin de comprendre leur dynamique in vivo. N’oubliez pas que le PTU est cancérigène et que des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.