Tomodensitométrie et l'imagerie optique du couplage de l'ostéogenèse-angiogenèse à évaluer l'intégration des crâniens autogreffes et allogreffes

L’objectif global de cette procédure est de suivre l’intégration des greffes osseuses crâniennes en termes de régénération osseuse et de néovascularisation à l’aide d’approches d’imagerie multimodale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, telles que le couplage ostéogenèse-angiogenèse. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une détermination 3D haute définition des trois vasculaires, et elle permet l’étude de l’organe complet démontrant que la procédure sera doron Vic, un étudiant au doctorat dans mon laboratoire après avoir euthanasié une souris de mer Bab âgée de sept à huit semaines.

Selon le protocole textuel, utilisez une tondeuse à cheveux pour raser la région calvaire dans le sens inverse de la croissance des cheveux. Appliquez 70 % d’isopropanol sur la carcasse, la tête à désinfecter. Ensuite, utilisez un scalpel numéro 11 pour couper la peau du cuir chevelu et retirez le périoste à l’aide d’une perceuse dentaire et d’une dent de 4,5 millimètres de diamètre intérieur.

Détachez un fragment circulaire d’os calvaire. Transférez le fragment d’os dans une boîte en plastique de 100 millimètres contenant une solution saline stérile. À ce stade, observez le sang et les tissus mous attachés au fragment d’os à l’aide d’une pince à épiler incurvée.

Tenez un fragment d’os à la fois et utilisez un applicateur à embout de coton pour bien l’écouvillonner. Enlever tout tissu cérébral, tissu mou et sang. À l’aide de ciseaux fins, coupez doucement les éclats d’os qui restent attachés au greffon afin que le greffon ait une forme arrondie parfaite.

Trempez chaque greffon une fois dans un tube de 15 millilitres contenant 70 % d’éthanol et deux fois dans des tubes de 15 millilitres contenant du PBS pour éliminer l’éthanol. Congelez l’allogreffe dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius dans des tubes cryogéniques pendant au moins une semaine après la congélation. Assurez-vous que l’allogreffe est transparente en travaillant avec des souris transgéniques receveuses qui expriment la luciférase sous le contrôle du promoteur de l’ostéocalcine.

Après avoir anesthésié une souris femelle de sept à huit semaines à l’aide d’anesthésiques injectables et vérifié la sédation. Utilisez une tondeuse à cheveux dans le sens inverse de la pousse des cheveux pour raser la région calvaire. Appliquez un dépilatoire pour enlever les restes de fourrure et utilisez de la gaze sèche pour l’essuyer après moins de deux minutes maximum.

Utilisez ensuite de la gaze imbibée de solution saline pour essuyer la zone. Désinfectez le cuir chevelu en appliquant 5 % de chlorhexidine par voie sous-cutanée. Injectez cinq milligrammes par kilogramme de carprofène dilué dans 200 microlitres de solution saline.

Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse et gardez l’animal sur un coussin thermique en tout temps. Placez ensuite l’animal sous les jumelles en fonctionnement. Ensuite, à l’aide de ciseaux fins et d’une pince à épiler, faites une coupe ovale d’un centimètre de long dans la peau du cuir chevelu avec une pince à épiler.

Tenez le périoste et utilisez des ciseaux fins pour le couper avec une mèche dentaire et une perceuse de cinq millimètres de diamètre extérieur pour affiner la perceuse calvaire deux millimètres en avant de la suture lambdoïde pour éviter la pénétration de la dure-mère. Percez les trois quarts de l’os et utilisez une spatule pour détacher le fragment d’os. Une étape critique du protocole est la fin de la localisation du défaut.

Une blessure à la suture labo entraînera des saignements massifs. Par conséquent, il faut veiller à ne pas perturber le duromètre sous-jacent et le sagittal supérieur. Pour implanter une autogreffe.

Utilisez 10 millilitres de solution saline stérile dans une plaque en plastique de 10 millimètres pour laver le fragment d’os. Retirer les caillots sanguins sans enlever les tissus mous pour implanter une allogreffe, décongeler à l’avance et normaliser l’échantillon à température ambiante. Lavez ensuite le fragment d’os avec une pince à épiler incurvée.

Placez le greffon osseux dans le défaut afin qu’il ne touche pas les marges du défaut. Ensuite, à l’aide de gel de fibrine, collez le greffon à l’os hôte. Suturez la peau avec quatre sutures oh Vicryl et appliquez de la povidone iodée sur la coupe chirurgicale.

Marquez l’oreille de la souris et injectez 0,25 milligramme par kilogramme d’anti-berline. Pour inverser l’effet anesthésique du méat. Effectuer les soins postopératoires selon le protocole textuel.

Préparez une solution saline héparinée en pesant 2000 unités d’héparine de sodium et en les transférant dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez 20 millilitres de solution saline stérile dans le tube et agitez. Remplissez une seringue de 20 millilitres avec 15 millilitres de solution saline héparinée réchauffée et connectez la seringue à un ensemble de veines du cuir chevelu de calibre 23.

Fixez la seringue à un pousse-seringue et réglez la pompe sur 10 millilitres à raison d’un millilitre par minute. Après avoir anesthésié une souris selon le protocole de texte, confirmez la sédation par un pincement des orteils et fixez la souris. Son dos à une planche de fixation enveloppée d’une doublure de surface absorbante.

Ensuite, coupez la peau de l’abdomen au cou. Coupez la paroi abdominale jusqu’au processus xiphoïde. Ensuite, coupez la cage thoracique le long de sa face latérale, en vous assurant que le cœur est entièrement exposé et que le cœur et les poumons ne sont pas endommagés.

Utilisez un hémostat pour rétracter le sternum. Insérez l’aiguille papillon à trois millimètres dans le ventricule gauche. Ensuite, avec de la colle en trois secondes, collez l’aiguille sur le cœur et la paroi thoracique L’insertion de l’aiguille papillon dans le ventricule gauche est une procédure délicate.

Essayez d’éviter l’insertion dans le ventricule droit ou trop profondément dans le ventricule gauche, car il pénétrera la paroi postérieure du cœur. Ensuite, activez immédiatement la pompe. Au bout d’une minute, disséquez la veine inférieure de l’ovale afin de dépressuriser le système vasculaire.

Inclinez la planche de manière à ce que les fluides s’écoulent loin de la tête. Une perfusion réussie entraînera une clarification du foie et des vaisseaux sanguins. Maintenant perfusé 10 millilitres de formaldéhyde à 4 %.

Éviter la pénétration des bulles d’air dans le système vasculaire. Lorsque la perfusion est complète, comme l’indique un raidissement de la queue, utilisez 10 millilitres de solution saline héparinée pour éliminer le formaldéhyde. Préparez l’agent de contraste radio-opaque selon les instructions du fabricant.

En mélangeant le composé diluant et l’agent de durcissement dans un tube en plastique, perfuser l’animal avec l’agent de contraste à raison d’un millilitre par minute. Les artères coronaires intestinales et hépatiques devraient jaunir lorsque la perfusion est terminée. Coupez le tube à l’aiguille papillon et enveloppez la carcasse dans du papier pour éviter que la solution ne s’échappe dans la région du calvaire.

Placez l’animal à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour permettre la polymérisation le lendemain. Pour disséquer la région calvaire, utilisez un scalpel pour couper la peau le plus latéralement possible, en évitant d’endommager la région crânienne d’intérêt. Localisez la greffe osseuse, puis utilisez des ciseaux fins pour couper l’os crânien à 10 millimètres de la greffe.

À l’aide d’un scanner micro CT. Réglez le champ de vision sur 20,5 millimètres, l’énergie des rayons X sur 55 KVP, l’intensité sur 145 microampères, un millier de projections à 360 degrés et un temps d’intégration de 200 millisecondes. Scannez l’échantillon d’os calvaire isolé.

Observez les coupes reconstruites en 2D qui ont été générées par le logiciel de micro-tomodensitométrie. Assurez-vous de scanner correctement la région d’intérêt, puis de localiser le défaut calvaire. Si les récipients perfusés sont facilement identifiables, utilisez de l’acide trichloracétique à 6 % dilué dans de l’eau distillée deux fois.

Pour détartrer l’échantillon, balayez à nouveau l’échantillon en utilisant les mêmes paramètres que ceux décrits ci-dessus. Localisez la suture lambdoïde dans les tranches 2D reconstruites. Définissez un volume cylindrique d’intérêt ou VOI de deux millimètres de hauteur et d’un diamètre de huit millimètres tangent à la suture.

Il s’agit du site anatomique du défaut. Ensuite, segmentez l’os des tissus mous. Réglez le seuil inférieur sur 130 et appliquez un filtre gaussien 3D contraint pour supprimer partiellement le bruit dans les volumes.

Générez une reconstruction 3D. Assurez-vous que le VOI est correctement positionné à l’aide du logiciel IPL et de l’objet DT. La fonction Peram génère une carte d’épaisseur.

Cette fonction décrit le volume du récipient pour chaque diamètre de récipient pour effectuer l’imagerie et la microtomographie par ordinateur. Selon le protocole textuel, comme montré ici, sept jours après l’opération, la tomodensitométrie a montré un volume significativement plus élevé de vaisseaux sanguins de petit et moyen diamètre qui nourrissaient toute la zone de greffe chez les souris qui avaient reçu des autographes par opposition aux souris ayant reçu des allogreffes où les vaisseaux semblaient pénétrer de l’extérieur. De plus, l’imagerie par fluorescence a montré une perfusion sanguine significativement plus élevée chez les animaux traités à l’autographe.

Au 14e jour, l’arbre vasculaire de l’allogreffe atteint toute la proximité des greffons. Pourtant, le volume des récipients était nettement inférieur à celui du groupe Autographt. Cette différence était plus importante lorsque des vaisseaux d’un diamètre de 0,08 à 0,1 millimètre ont été comparés, comme on le voit ici, 28 jours après l’opération, le volume vasculaire est revenu à la ligne de base sept jours après l’opération.

Le groupe d’autogreffe a démontré une minéralisation osseuse significativement plus importante, comme le montre l’imagerie de fluorescence à l’aide d’une sonde dirigée vers l’hydroxyapatite. L’os s’est formé tout au long de la proximité du greffon dans ce groupe alors qu’il ne s’est formé qu’aux marges de défaut dans le groupe allogreffe comme marqué par une forme d’anneau 56 jours après la chirurgie, le volume osseux était significativement plus élevé et l’épaisseur du greffon était significativement plus grande chez les animaux qui ont reçu des autographes par rapport aux allogreffes Une fois maîtrisée, cette technique chirurgicale peut être réalisée en 25 minutes environ. Suite à cette procédure, une imagerie de fluorescence à l’aide d’autres sondes peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple, les activités des ostéoclastes et l’implication de la réponse immunitaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager la régénération osseuse dans l’angiogenèse sous-jacente.