Name: Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Apprenez à mesurer le taux glycolytique cellulaire par analyse du flux extracellulaire. Cette méthode permet de corriger quantitativement l'acidification totale pour distinguer les contributions respiratoires et glycolytiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions David A. Ferrick et David G. Nicholls pour leur contribution à la conception et à la présentation du projet, Renata L.S. Goncalves et Akos A. Gerencser pour les données non présentées ici et pour les discussions utiles, Barbara Liepe pour les consommables XF24, et Andy Neilson pour sa contribution au développement de l’équation (5).

1. Mesurer Buffering Puissance en un flux Instrument extracellulaire: deux variantes REMARQUE: les calculs et les méthodes décrites ici ont été développées à l&#39;aide d&#39;un analyseur de Flux extracellulaire. Pour les autres instruments, le volume de mesure doit être mise à l&#39;échelle appropriée. <ol><li> Préparer 0,1 M HCl norme dans l&#39;eau en utilisant du HCl concentré (voir matériel et équipement) selon les instructions du fabricant. Remarque: Un exemple de calcul pour préparer des injections HCl pour une utilisation dans les quatre ports d&#39;injection est indiqué dans le Tableau 1: </li></ol><img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" /> Tableau 1. injections consécutives HCl dans un dosage flux extracellulaire ainsi. <ol start="2"><li> Préparer des dilutions de la norme HCl dans le milieu à doser comme dans le tableau 1 pour le nombre de répétitions techniques étant carrIED dans une plaque, plus un pour permettre à l&#39;erreur de pipetage; par exemple, pour les quatre répétitions techniques du port A d&#39;injection, préparer un stock de (1,1 pi x 5) HCl 0,1 M dans (48,9 pi x 5) milieu de dosage. </li><li> Distribuer 50 ul dans chaque port A de la cartouche de la sonde de mesure. Répétez cette procédure pour les ports restants B, C, et D. </li><li> Exécutez un test de flux extracellulaire 10 avec un cycle d&#39;étalonnage standard, suivie de deux cycles de [2 min mélange, 1 min d&#39;attente, et 5 min de la mesure] pour chacun des quatre ajouts portuaires (voir la figure 2). <ol><li> Programmer l&#39;expérience ci-dessus dans le logiciel de l&#39;instrument selon les instructions du logiciel. Charger la cartouche préparé dans la machine et effectuer le calibrage selon les instructions du logiciel. </li><li> Lorsque vous êtes invité par le programme, retirez la plaque contenant étalon-et insérer la plaque contenant du milieu d&#39;essai dans chaque puits dans l&#39;instrument; poursuivre le programme. </li></ol></li><li> U<html> chanter la moyenne de 8-10 points de données obtenues à l&#39;état d&#39;équilibre (en général les 8-10 derniers points) avant et après chaque addition de port, calculer la (cumulatif) différence de pH (ApH) causés par chaque injection d&#39;acide standard. </li><li> Tracer ApH contre nmol H + contenu dans le volume 7 ul piégé par la sonde de mesure. La pente linéaire est le pouvoir tampon (BP) en MPH / pmol H +. </li><li> Alternativement aux étapes 1,2-1,3, effectuer les mesures suivantes de ApH un essai dans lequel des ports A, B, et C sont utilisés pour mener une expérience, suivie par une injection HCl à Port D. Comme dans le tableau 2, quatre répétitions techniques sont utilisé pour générer chaque point d&#39;une courbe standard de 5 points dans les 20 puits expérimentaux (à l&#39;exclusion des puits de correction de température de quatre de fond) de la plaque de flux extracellulaire de dosage. </li></ol>53464table2.jpg &quot;/&gt; Tableau 2. injection HCl simple dans un test de flux extracellulaire bien. 2. Mesurer Buffering alimentation Utilisation d&#39;un pH-mètre externe NOTE: Pour mesurer le pouvoir tampon d&#39;un support en utilisant une sonde de pH externe, étalonner la sonde à 37 ° C et maintenir cette température pendant tous les réactifs pendant l&#39;expérience. <ol><li> Préparer 0,1 M HCl norme dans l&#39;eau en utilisant du HCl concentré selon les instructions du fabricant. </li><li> Chaud sonde de pH, les normes de pH, le milieu de dosage dont le pouvoir tampon est à mesurer, et du HCl 0,1 M à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Calibrer sonde de pH à 37 ° C selon les instructions du fabricant. Maintenir tous les réactifs à 37 ° C tout au long de l&#39;essai en utilisant une plaque chauffante ou un bain d&#39;eau. </li><li> Aliquote de 10 ml du milieu d&#39;essai dans un petit bêcher ou un tube conique. Contrôler le pH en continu en utilisant une sonde de pH immergé. </li><li> Ajouter HCl 0,1 M comme à ladire en 10-20 aliquotes pi de milieu. <ol><li> Assurer le mélange à l&#39;aide d&#39;une barre d&#39;agitation ou par tourbillon manuellement le conteneur après chaque addition d&#39;acide. </li><li> Attendre quelques secondes pour la mesure du pH pour stabiliser, puis enregistrer le pH après chaque addition. </li><li> Comme le montre le tableau 3, faire un nombre suffisant d&#39;ajouts pour assurer calcul de pente précis et pour couvrir la gamme de pH attendu pendant l&#39;expérience. </li></ol></li></ol><img alt="Tableau 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" /> Tableau 3. Mesure de la puissance de mise en mémoire tampon en utilisant un pH-mètre. Les données représentent une expérience typique avec six additions de 20 ul de HCl 0,1 M. <ol start="6"><li> Plot ApH contre nmol ajouté par H + 7 ul, ce qui donne une pente linéaire qui représente le pouvoir tampon (Figure 1). </li></ol> Figure 1. Déterminer pouvoir tampon. HCl courbe d&#39;étalonnage mesurée comme dans le tableau 1, le tableau 2 ou (ici) comme dans le tableau 3. La pente de la courbe en forme linéaire donne le pouvoir tampon (pH / nmol H + dans 7 ul). Chaque point représente moyenne ± SEM de n = 9 répétitions techniques. <ol start="7"><li> Une fois que le pouvoir tampon est connu par la méthode 1 ou 2 ci-dessus, convertir le signal de ECAR (mph / min) à PPR (pmol H + / min / protéine ug) en divisant ECAR par la puissance mise en mémoire tampon (BP) (MPH / pmol H +) mise à l&#39;échelle et à la teneur en protéine de chaque puits: PPR tot (pmol H + / min / pg de protéine) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + à 7 pi) / protéines par puits (pg) L&#39;équation 6 </li><li> Sinon, utilisez les mêmes expériences dans la méthodes 1 ou 2 pour calculer la capacité tampon (BC) valeur utilisée par le logiciel de l&#39;appareil pour calculer automatiquement PPR lors de la collecte de données. REMARQUE: L&#39;utilisateur de l&#39;instrument manuel 12 (page 107) fournit des informations détaillées sur le calcul et l&#39;utilisation de la capacité tampon, où BC est décrit comme BC (mol / L) = moles H + / (ApH x volume tampon (L)) L&#39;équation 7 NOTE: Le pouvoir tampon tel que défini dans l&#39;équation 7 peut être calculée dans les essais de l&#39;instrument ou de la sonde de pH externe décrites ci-dessus. Conversion entre pouvoir tampon capacité tampon et se fait facilement (voir tableau joint): BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + à 7 pi) / 7 pi) de l&#39;équation 8 NOTE: Si connue avant d&#39;effectuer le test, la capacité tampon peut être entré directement dans le logiciel de l&#39;appareil lors de l&#39;installation expérimentale. </li><li>Appliquer cette procédure et les calculs utilisés ci-dessus pour la plupart des systèmes tampons classiques, comme décrit dans la publication précédente 6. NOTE: Le tableau 4 donne la liste de pouvoir tampon capacité tampon et de plusieurs médias conventionnels. </li></ol><img alt="Tableau 4" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" /> Tableau 4. pouvoir tampon et la capacité de mise en mémoire tampon des médias sélectionnés. 3. Réalisation d&#39;une extracellulaire Flux dosage utilisant cellules C2C12 de myoblastes NOTE: Dans l&#39;étape 3.4.3, il n&#39;y avait pas de différences observées dans CO 2 -derived production d&#39;acide dépend de la présence de l&#39;anhydrase carbonique dans la culture C2C12, suggérant que sa présence ne soit pas nécessaire pour la conversion complète de CO 2 à HCO 3 - H + +. Cependant, tester empiriquement ce dans différents systèmes expérimentaux est recommandé avant omanhydrase carbonique itting. <ol><li> Culture souris C2C12 de myoblastes 13 à 37 ° C sous 95% d&#39;air / 5% de CO2 dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec du glucose 11,1 mM, 2 mM de glutamine, 10% en volume de sérum / v bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. </li><li> 24 h avant l&#39;essai, les cellules plaque / graines dans 100 ul du même milieu de culture à 20.000 cellules / puits dans une plaque de dosage à 24 puits en polystyrène flux extracellulaire (voir Matériels et Méthodes) sans revêtement supplémentaire. </li><li> Diluer oligomycine, FCCP, et la roténone, plus myxothiazol et HCl (en option) à 10x concentration finale dans Krebs Ringer phosphate HEPES (KRPH) milieu de dosage (2 mM HEPES, NaCl 136, 2 mM NaH 2 PO 4 mM, KCl 3,7, 1 mM de MgCl2, 1,5 mM de CaCl2, 0,1% p / v d&#39;albumine de sérum bovin gras-acide, pH 7,4 à 37 ° C). </li><li> La préparation des cellules <ol><li> 30 min avant le test, laver les cellules adhérentes trois fois en aspirant à GEretirer ntly le moyen du puits, puis en ajoutant lentement 500 KRPH ul. </li><li> Incuber les cellules après l&#39;étape de lavage troisième à 37 ° C sous air (pas moins de 5% de CO 2, ce qui modifiera le pH de ce milieu exempt de bicarbonate). </li><li> Au début de l&#39;essai, remplacer KRPH dans les puits avec 500 pi KRPH frais contenant anhydrase carbonique 500 U / ml et soit du glucose (10 mM) ou seulement moyen, sans substrat supplémentaire. </li></ol></li><li> Chargement de la cartouche du capteur <ol><li> Pipet 50 aliquotes de chaque composé 10x préparé à l&#39;étape 3.3 dans les ports d&#39;une cartouche extracellulaire flux de capteur comme suit (concentrations finales dans les tests ainsi donnés) de la cartouche: Port A: 2 pg / ml oligomycine, Port B: 0,5 uM FCCP, Port C : roténone 1 uM, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (si l&#39;exécution d&#39;une calibration in-dosage de l&#39;acide comme décrit ci- dessus et dans le tableau 2). NOTE: dans le but d&#39;une inhibition complète de la chaîne respiratoire décrit ici, 1 pm mesxothiazol peut être utilisé de manière interchangeable avec 1 uM antimycine A. </li></ol></li><li> Extracellulaire dosage flux: <ol><li> Effectuez un test de flux extracellulaire standard pour la détermination du contrôle respiratoire comme décrit dans 10. </li></ol></li></ol> NOTE: Pour chaque segment de l&#39;expérience, de déterminer la combinaison, attendez, et les temps de mesure souhaitée, ainsi que le nombre de cycles par segment. REMARQUE: Les données du tableau 5 ont été recueillies au cours de deux cycles de dosage de 2 min mix, 1 minutes d&#39;attente, et à 5 min mesure pour chaque segment, avec trois cycles d&#39;essai se produisant après l&#39;addition du port D de différentes quantités de HCl (pour l&#39;étalonnage de la mémoire tampon puissance comme dans le Tableau 2). <img alt="Tableau 5" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" /> Tableau 5. configuration de test flux extracellulaire. 4. DE MESUREFin ng-point de la concentration de lactate Remarque: Afin de valider le test indirect décrit ici dans un système différent, le point extrémité concentration de lactate à la fin d&#39;une expérience de flux extracellulaire peut être déterminée directement dans une plaque à 96 puits classique par mesure de la vitesse initiale (plus de 2 minutes) de réduction de NAD + NADH → catalysée par la lactate déshydrogénase, décrit en détail dans notre publication préalable 6. Pour les données présentées dans Les résultats représentatifs, la concentration de lactate de point final dans les puits d&#39;essai contenant du glucose était ~ 40 pm. <ol><li> Préparer moyen d&#39;hydrazine 2x: 1 M de Tris, 20 mM d&#39;EDTA, 400 mM d&#39;hydrazine à pH 9,8 à 22 ° C). Immédiatement avant le début de l&#39;essai, ajouter NAD + 4 mM de lactate déshydrogénase et (LDH) à 40 U / ml. Composition de milieu d&#39;essai final (1x): 500 mM de Tris, 10 mM d&#39;EDTA, 200 mM d&#39;hydrazine, 2 mM de NAD +, 20 U / ml de LDH. </li><li> Immédiatement après le dosage flux extracellulaire, retirer 100pi de milieu de dosage de chaque puits de la plaque de dosage flux extracellulaire et le transfert à un puits d&#39;une opaque (noir) plaque de 96 puits. </li><li> Pour chaque échantillon, ajouter 100 pi 2x moyen d&#39;hydrazine. </li><li> Charger immédiatement la plaque dans un lecteur de microplaques et de commencer à surveiller la fluorescence de NADH à 340 nm d&#39;excitation / émission à 460 nm. </li><li> Enregistrer la vitesse initiale d&#39;environ 2 min. </li><li> Exécuter une expérience similaire à construire une courbe d&#39;étalonnage en traçant la vitesse initiale de la concentration de lactate pour des concentrations de lactate ajoutés de 0 à 50 uM. </li><li> Calculer la concentration de lactate dans chaque puits expérimental utilisant la courbe standard. </li></ol> 5. Mesure Teneur en protéines <ol><li> Retirer le reste de milieu d&#39;essai à partir de chaque puits de la plaque de dosage. </li><li> Laver les puits trois fois avec 250 ul KRPH libre-BSA, en prenant soin de minimiser le délogement des cellules de la surface de fond de puits. </li><li> Ajouter 25 ul lyse RIPAmoyen (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, 1% v / v de Triton X-100, 0,5% p / v de désoxycholate de sodium, 0,1% v / v de SDS, pH 7,4 à 22 ° C) à chaque puits de la plaque de dosage. </li><li> Incuber la plaque sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Agiter la plaque sur un agitateur de plaque à 1200 rpm pendant 5 min. </li><li> Mesurer la concentration de protéines par des procédés classiques, par exemple par dosage BCA, en veillant à ce que la composition du tampon de lyse est compatible avec la méthode de mesure. La teneur en protéines dans l&#39;expérience sur la figure 2 était d&#39;environ 4 ug / puits. </li></ol>

<ol><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).</li>
<li>Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+production+in+glycolysis-impaired+tumors+provides+new+insights+into+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.</a> Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).</li>
<li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioenerg.+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp. (46), 2511(2010).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Seahorse Biosciences. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22F24+Extracellular+Flux+Analyzer+and+Prep+Station+Installation+and+Operation+Manual%22">F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual</a>. 1.7, (2010).</li>
<li>Blau, H., Chiu, C., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+human+heterocaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons.</a> Cell. 32, 1171-1180 (1983).</li>
</ol>

Dr Shona Mookerjee déclare qu&#39;elle n&#39;a pas d&#39;intérêts financiers concurrents. Dr Martin Marque a consulté Seahorse Biosciences, qui produit des instruments et des réactifs utilisés dans le présent article. Les frais d&#39;accès ouvertes pour cet article ont été payés par Seahorse Biosciences.

Acidification extracellulaire est une indication facilement mesurée du taux métabolique cellulaire. Pour déterminer correctement le taux de glycolyse cellulaire (tel que défini par la production de lactate), il est essentiel de connaître le pouvoir tampon du milieu de dosage, et pour convertir les mesures de flux extracellulaires de la consommation d&#39;oxygène et l&#39;acidification Proton taux de production. En effectuant ce calcul, l&#39;acidification résultant de CO 2 libéré dans le cycle de l&#39;acide citrique peut être soustrait, en laissant l&#39;acidification qui résulte de la production de lactate. Les multiples façons différentes données ici pour mesurer la puissance de tampon pour cette correction portent différents avantages et inconvénients. Mesure externe à l&#39;aide d&#39;une sonde de pH est très précise et reproductible, mais peut ne pas refléter de petites différences dans la détection de pH introduit par les fluorophores contenus dans la plaque de dosage, l&#39;addition de composés au cours de l&#39;essai, ou la présence de til cellules elles-mêmes. Le mesures de pH traitent en plaque ces questions, mais aussi introduire des degrés variables de bruit expérimental. La correction de CO 2 à l&#39;ECAR permet pour la première fois le calcul sans équivoque et quantitative des taux de la glycolyse, et révèle la variation de la contribution respiratoire et glycolytique ECAR totale au cours d&#39;une expérience. En utilisant l&#39;équation 5 et les mesures d&#39;OCR, ECAR, et le pouvoir tampon, le taux de la glycolyse peut être calculée en utilisant la simple feuille de calcul fournie (tableau 6). Ce taux peut être vérifiée par la mesure de lactate post-hoc si désiré 6. Dans les cellules où la voie des pentoses phosphates est hautement actif, l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs de la voie tels que le 6-aminonicotinamide peut être utile d&#39;isoler taux glycolytique. Calcul de la contribution de chacun de CO 2 - et le lactate dérivé H + du total mesurées extra cellulaire acidification Coter et oxygène consommatTaux d&#39;ions est un outil précieux pour l&#39;utilisation des données de flux extracellulaires de faire des déclarations puissantes et quantitatives sur l&#39;activité métabolique. En utilisant les procédures décrites ici, y compris les diverses modifications pour mesurer la puissance de tampon, et l&#39;optimisation de l&#39;expérience flux extracellulaire pour les cellules visées par l&#39;enquête et les données souhaitées, le taux de glycolyse dans des cellules intactes peut être quantifiée dans une large gamme de conditions expérimentales. Ce procédé est limité à des cellules qui peuvent croître en culture adhérente (ou sur des cellules ou organites qui peuvent être respectées) une surface de polystyrène. Il est le plus fiable lorsque les cellules cultivées sont homogènes et confluentes, bien que les données utiles peuvent encore être obtenues sur une plage de ces conditions. Les calculs nécessitent une certaine connaissance du métabolisme des cellules, comme Max H + / O 2 gammes de 0,65 à 1,0 pour l&#39;oxydation complète de différents substrats et plus pour oxydation partielle 6, cependant, si les cellules sont known à oxyder le glucose, une valeur de 1,0 peut être présumée. Bien pertinente à tous caractérisation métabolique, ce procédé peut être particulièrement utile lorsqu&#39;il est utilisé dans des systèmes dans lesquels un décalage entre le métabolisme respiratoire et glycolytique pour maintenir l&#39;approvisionnement en ATP cellulaire est un phénotype critique, y compris la caractérisation de cellules souches et de cellules cancéreuses dérivées de tumeurs. La compréhension des modifications de contrôle métabolique dans ces contextes et d&#39;autres permettra à un plus grand degré de sophistication et la précision dans la conception expérimentale et l&#39;analyse de ces types de cellules.

L&#39;objectif global de cette méthode est de mesurer avec précision le taux de la glycolyse des cellules en utilisant l&#39;analyse de flux extracellulaire. La mesure quantitative du taux de la glycolyse en utilisant l&#39;acidification extracellulaire est le point final souhaité de nombreuses expériences. Cependant, le taux global de l&#39;acidification extracellulaire est la somme de deux composantes: l&#39;acidification respiratoire, sous forme de CO 2 (qui hydrate à H 2 CO 3 dissocie alors de HCO 3 - + H +), et de l&#39;acidification de la glycolyse, sous la forme de lactate - + H +. Les contributions de CO 2 à l&#39;acidification extracellulaire totale ont jusqu&#39;à récemment été considéré comme négligeable dans la plate-forme de mesure utilisée ici, l&#39;analyseur XF24 7. Cependant, il est clair dans plusieurs autres systèmes qui CO 2 peut être un contributeur majeur à l&#39;acidification extracellulaire 4-5. Plusieurs documents reconnaissent ce concontribution, mais ne tentez pas de quantification directe de CO 2 -derived 3,8,9 acide. Nous avons récemment démontré que quantitativement production de CO 2 est une source importante de l&#39;acidification extracellulaire dans ce système 6. En outre, bien qu&#39;il existe plusieurs voies métaboliques qui produisent du CO 2 de catabolisme du glucose, celles effectuées par les déshydrogénases de la matrice dans le cycle de l&#39;acide citrique sont les contributeurs écrasante et toutes les autres sources génèrent des quantités de CO 2 qui sont dans l&#39;erreur expérimentale 6. Sans correction de production de CO 2, l&#39;acidification extracellulaire est donc un indicateur ambigu de taux glycolyse et ne peut être utilisée quantitativement. Notre dernière publication met en lumière plusieurs cas où respiratoires CO 2 comprend la majeure partie du signal de l&#39;acidification totale, même dans les cellules croit généralement d&#39;utiliser principalement la glycolyse 6. En outre, lerespiratoires CO 2 contribution à l&#39;acidification totale varie considérablement au cours des expériences de profilage métaboliques communs, ce qui démontre que la comparaison correcte de la vitesse au cours de la glycolyse différentes parties d&#39;une expérience nécessite une correction pour le CO 2. Pour mesurer le taux glycolytique de cellules en utilisant le taux d&#39;acidification extracellulaire, il est nécessaire de convertir des changements de pH à des changements dans totale H + générés, et pour soustraire l&#39;acidification extracellulaire provoquée par CO 2 libéré pendant le fonctionnement du cycle de l&#39;acide citrique. Ici, nous décrivons un procédé simple pour la mesure de la vitesse de production de protons extracellulaire (à partir de changements extracellulaires du pH et de la force calibrée tampon du milieu de dosage) et production de CO 2 (à partir de changements extracellulaires de la concentration en O 2), et montrons comment calculer le taux glycolytique l&#39;utilisation de ces mesures. Cette méthode force<html> ens l&#39;utilité de la mesure de l&#39;acidification extracellulaire en l&#39;utilisant pour calculer correctement le taux glycolytique tel que défini par la production de lactate. Sans correction pour le CO respiratoires 2 (ou mesure directe de lactate), il est impossible de déterminer si et dans quelle mesure le taux d&#39;acidification totale reflète le taux de la glycolyse, confondant l&#39;interprétation des expériences qui utilisent l&#39;acidification extracellulaire totale comme une mesure directe de la production de lactate. CALCULS CO 2 et le lactate sont, dans l&#39;erreur expérimentale, les deux seuls contributeurs à la production d&#39;acide extracellulaire, basées sur des expériences avec des cellules de myoblastes 6. Par conséquent, le taux d&#39;acidification extracellulaire totale (PPR, le taux de production de protons) peut être définie comme: PPR tot = PPR resp + PPR Glyc équation 1 . _content &quot;&gt; où tot = totale; resp = respiratoire; Glyc = glycolytique glycolytique PPR est donc: PPR PPR Glyc = tot - PPR resp équation 2 Ici, PPR tot = ECAR tot / BP équation 3 où ECAR = taux d&#39;acidification extracellulaire (mph / min), et BP = pouvoir tampon (mph / pmol H + à 7 pi), tandis que PPR resp = (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) L&#39;équation 4 où K = une constante d&#39;équilibre de CO 2 combiné hydratation et la dissociation de HCO 3 - + H +; max + H / S 2 = ee CO 2 acidification -derived pour une transformation métabolique particulier tel que l&#39;oxydation complète du glucose 6; OCR = taux d&#39;oxygène de la consommation (pmol de O 2 / min), et OCR rot / myx = non mitochondrial OCR. Equation 4 isolats mitochondrial OCR en soustrayant tout OCR non-mitochondrial (défini comme OCR qui est résistant à la mitochondrial poisons respiratoire roténone et myxothiazol) et représente le maximum H + généré par O 2 consommé pour chaque substrat (max H + / O 2 ) (voir 6), ainsi que la proportion de CO 2 donnant lieu à H + à la température et le pH expérimental (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1). Pour toute oxydation du glucose, de l&#39;oxygène mitochondrial Taux de consommation (OCR) est exactement égal au taux de production de CO 2. Dans le volume d&#39;essai confiné de mesure de flux extracellulaire, CO 2 produitsd par respiration reste piégé dans le milieu d&#39;essai. La majeure partie du CO 2 est piégé hydraté en H 2 CO 3, qui se dissocie ensuite à HCO 3 - + H +. Une petite fraction reste dissous mais pas hydraté, et une autre petite fraction est hydraté mais pas dissocié, comme dicté thermodynamiquement par la constante d&#39;équilibre combiné de CO 2 hydratation et la dissociation de HCO 3 - + H + à la température expérimentale (37 ° C) et le pH (~ 7,4). Ainsi, l&#39;équation complète pour le calcul de PPR g en soustrayant de PPR PPR resp tot est: PPR Glyc = ECAR tot / BP - (10 pH-PK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) L&#39;équation 5 jen cette façon, les taux de la respiration et de la glycolyse, ainsi que leur taux de production d&#39;ATP associés, peut être déterminée quantitativement à partir de mesures simples (consommation d&#39;oxygène, acidification extracellulaire, capacité tampon) et l&#39;importation ou le calcul des autres valeurs requises (H + / S 2 , P / S, et la constante d&#39;équilibre K 1) 6. L&#39;expérience décrite ici se développe sur des techniques standard pour utiliser le Flux Analyzer extracellulaire tels que Seahorse XF24 10,11; pour d&#39;autres formats de mesure de flux extracellulaire (par exemple, XF 96 e, ou XFP), tous les volumes ci-dessous devraient être réduites de manière appropriée. Le pouvoir tampon du milieu d&#39;essai peut être mesurée par la construction d&#39;une courbe d&#39;étalonnage, soit directement dans la plate-forme flux extracellulaire ou séparément à l&#39;aide d&#39;une sonde de pH étalonnée. Ici, trois options de mesure de mise en mémoire tampon par le moyen d&#39;analyse de flux sont donnés extracellulaire, y compris en utilisant tous INJECTIsur les ports de l&#39;analyseur de flux extracellulaire avec des puits d&#39;échantillons exempts de cellules, ou en utilisant uniquement le dernier port d&#39;injection dans les puits contenant des cellules (section 1) ou en utilisant une mesure de pH externe (section 2). Voir la feuille de calcul ci-jointe pour les calculs complets de données d&#39;exemple. Pour mesurer la puissance tampon en utilisant la capacité de l&#39;instrument flux extracellulaire pH de détection, il est plus sûr d&#39;utiliser des puits sans cellules afin de minimiser la variation du signal. Cependant, dans l&#39;erreur, aucune différence statistique existe entre les puits lors de la réalisation et cette mesure contenant des cellules exempt de cellules (données non présentées). NOTE: La variation décrit dans l&#39;étape 1.7 comporte l&#39;avantage de rendre compte de tous les changements potentiels à tampon conférés par composés ajoutés ou par la présence de cellules, avec l&#39;inconvénient d&#39;un signal bruyant. Toutefois, comme indiqué ci-dessus, aucune différence significative n&#39;a été trouvée dans le pouvoir tampon calculé entre la conception acellulaire indiqué dans le tableau 1 etla conception post-expérience dans le tableau 2 dans les conditions expérimentales décrites ici. En outre, sur des plages de ApH petites (&lt;0,4 unités; expérimentalement meilleure limités à 0,2 unités), la pente linéaire obtenue en reportant Δ mpH / pmol H + se rapproche de manière adéquate la relation logarithmique entre ApH et [H +]. La pente de cette courbe d&#39;étalonnage représente donc le pouvoir tampon du milieu d&#39;essai dans l&#39;essai de pH / nmol H + dans 7 ul, ou MSP / pmol H + dans 7 ul. Nous recommandons d&#39;augmenter le pouvoir tampon milieu ou en diminuant la densité cellulaire pour les échantillons qui dépassent un changement de 0,2 unité de pH au cours de la durée de mesure. Le temps de mesure peut aussi être diminué, mais cela pourrait réduire le taux d&#39;acidification de l&#39;état d&#39;équilibre et d&#39;introduire des erreurs dans le calcul du taux.

<table><tbody><tr><td>Pherastar FS</td><td>BMG</td><td>n/a</td><td>lecteur de microplaques</td></tr><tr><td>Seahorse XF-24</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>n/a</td><td>instrument de flux extracellulaire</td></tr><tr><td>Seahorse XF plaque de dosage Seahorse</td><td>Bioscience</td><td>V7-PS</td><td>consommable</td></tr><tr><td>XF Calibrant</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td>solution</td></tr><tr><td>HCl standard</td><td>Sigma</td><td>38280</td><td>chimique</td></tr><tr><td>oligomycine</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>produit chimique</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>produit chimique</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>produit chimique</td></tr><tr><td>Myxothiazol</td><td>Sigma</td><td>T5580</td><td>produit chimique</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>moyen</td></tr><tr><td>composant FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>milieu composant</td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>composant moyen</td></tr><tr><td>anhydrase carbonique</td><td>Sigma</td><td>C2624</td><td>produit chimique</td></tr><tr><td>Plaque de dosage à 96 puits</td><td>Corning</td><td>CLS3991</td><td>consommable</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Sigma</td><td>N7004</td><td>produit chimique</td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td>produit chimique</td></tr></tbody></table>

mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour déterminer glycolytique taux

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

La mesure extracellulaire de la consommation d’oxygène et de la production d’acide est un moyen simple et puissant de surveiller les taux de respiration et de glycolyse1. Les réactions mitochondriales (respiration) et non mitochondriales (autres réactions redox) consomment de l’oxygène, mais ces réactions peuvent être facilement distinguées par l’inhibition chimique de la respiration mitochondriale. Cependant, alors que la consommation d’oxygène mitochondriale est une mesure directe et sans ambiguïté du taux respiratoire2, il n’en va pas de même pour la production d’acide extracellulaire et sa relation avec le taux glycolytique 3-6. L’acide extracellulaire produit par les cellules est dérivé à la fois du lactate, produit par la glycolyse anaérobie, et du CO2, produit dans le cycle de l’acide citrique pendant la respiration. Pour la glycolyse, la conversion du glucose en lactate- + H+ et l’exportation des produits dans le milieu de dosage sont à l’origine de l’acidification glycolytique. Pour la respiration, l’exportation de CO2, l’hydratation en H2CO3 et la dissociation en HCO3- + H+ sont à l’origine de l’acidification respiratoire. Les proportions d’acidification glycolytique et respiratoire dépendent des conditions expérimentales, y compris le type de cellule et le(s) substrat(s) fourni(s), et peuvent aller de près de 100 % d’acidification glycolytique à près de 100 % d’acidification respiratoire 6. Ici, nous démontrons les méthodes de collecte de données et de calcul nécessaires pour déterminer les contributions respiratoires et glycolytiques à l’acidification extracellulaire totale par des cellules entières en culture en utilisant des cellules myoblastiques C2C12 comme modèle.

<html> La figure 2 montre les données brutes d&#39;une expérience typique. Les 10 derniers points de l&#39;enregistrement à la fois de l&#39;OCR et le pH (ombragée barres verticales) point-à-point de mesure ont été utilisés pour les calculs. Les préoccupations initiales que la valeur moyenne (de mesure de point milieu) de chaque cycle de dosage ne fourniraient pas une résolution suffisante des tarifs pour un calcul précis, d&#39;autant plus qu&#39;il semblait y avoir un léger décalage entre l&#39;addition de port et le taux d&#39;acidification de l&#39;état d&#39;équilibre, ont été pas confirmée, que cela ne semble pas contribuer de manière significative à des erreurs de calcul (non représenté). Alternativement, si la capacité tampon correct est entré lors de l&#39;installation expérimentale, PPR peut être lue directement à partir de la lecture de la collecte des données de l&#39;instrument en affichant la sortie PPR dans le logiciel de l&#39;appareil ou dans le format compatible PC disponible en tant que l&#39;un des paramètres de sortie de données. ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Le représentant des traces de flux extracellulaires de O 2 et H +. OCR pH et des traces de l&#39;exemple expérience dans le tableau 5, contenant 10 mM de glucose en début d&#39;essai. Port D a différentes concentrations de HCl pour l&#39;étalonnage de la puissance de mise en mémoire tampon (non représentée sur ces traces moyennées). Les données de la publication précédente 6. Chaque point représente moyenne ± SEM de n = 8 répétitions biologiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> L&#39;analyse des données des résultats représentatifs Utilisation de la feuille de calcul indiqué dans le tableau 6 et fourni en pièce jointe, les valeurs des données de puits individuels peuvent être entrés dans les colonnes affichées avec en-têtes jaunes. Les six colonnes à<html> le droit sont calculées à partir de ces entrées. L&#39;exemple dans le tableau 6 montre les calculs de PPR et resp Glyc PPR utilisant ECAR et les données OCR des puits individuels pour les conditions natives avec ou sans glucose ajouté, avant Port A plus de oligomycine. Répétitions techniques sur chaque préparation biologique sont normalement la moyenne pour donner des valeurs uniques des sorties dans les quatre dernières colonnes, les données provenant de différentes préparations biologiques sont en moyenne à la propagation appropriée des statistiques d&#39;erreur dans BP et ces quatre valeurs. <img alt="Tableau 6" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" /> Tableau 6. Calcul de l&#39;appareil respiratoire et de l&#39;acidification de la glycolyse. Colonnes intitulées en jaune indiquent valeurs à entrer de calcul (par exemple, BP, max H + / O 2), ou à partir de la collecte de données (par exemple, l&#39;ECAR tot, OCR).<html> ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table |. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau comme une feuille de calcul Excel .</a> Contributions de la glycolyse et la respiration à PPR après correction La figure 3 montre la sortie graphique des données calculées comme dans le tableau 6 pour les débits en natif de l&#39;acidification glycolytique et respiratoire, les taux suivants oligomycine plus (Port A), et les taux suivants plus FCCP (Port B). Ces données démontrent clairement comment les proportions du changement d&#39;acidification respiratoire et de la glycolyse avec choix du substrat (glucose par rapport au témoin (CTL) avec aucun ajoutés) et avec le statut mitochondrial (fonction native vs fonction pharmacologiquement altérée). &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" /> Figure 3. Taux Proton de production (PPR) à partir de sources de la glycolyse et respiratoires. PPR provenant de la respiration (Les parties ouvertes) et de la glycolyse (des parties remplies) des cellules C2C12 calculées selon l&#39;équation 5 avec du glucose ajoutée (trois barres de gauche) ou sans glucose ajoutée (trois barres à droite). Les données de six. Toutes les données représentent la moyenne ± SEM de n = 8 répétitions biologiques.

La glycolyse est un marqueur métabolique déterminant dans plusieurs systèmes biologiques. La surveillance de la glycolyse par la mesure du flux extracellulaire de H+ est courante, mais nécessite une correction quantitative et sans ambiguïté. Ici, nous montrons comment recueillir et corriger des données de flux extracellulaires pour distinguer les sources respiratoires et glycolytiques d’acidification extracellulaire.

Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer précisément le taux de glycolyse des cellules à l'aide d'une analyse du flux extracellulaire. Cette méthode peut aider à lever les ambiguïtés dans le domaine de l'analyse du flux extracellulaire, en particulier l'utilisation de l'acidification extracellulaire totale pour déterminer le taux de glycolyse. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre une correction quantitative du taux d'acidification extracellulaire total afin de déterminer à la fois les taux de production de protons respiratoires et glycolytiques.Deuxièmement, pour mesurer la puissance tampon avec un instrument de flux extracellulaire, répartir d'abord 50 microlitres d'acide dilué dans chacun des quatre ports A, B, C et D de la cartouche de sonde de mesure. Ensuite, programmer l'instrument de flux extracellulaire pour exécuter un dosage de flux extracellulaire avec un cycle d'étalonnage standard suivi de deux cycles pour chacune des quatre additions aux ports. Puis charger la cartouche préparée dans l'appareil et étalonner l'instrument conformément aux instructions du logiciel.Lorsque le programme le demande, retirez la plaque contenant le ca et insérez la plaque contenant le milieu d'essai. Poursuivez ensuite le programme en utilisant la moyenne de huit à dix points de données obtenus à l'état stationnaire avant et après chaque ajout de port. Pour calculer la différence cumulative du pH provoquée par chaque injection d'acide standard.Tracer la variation du pH en fonction de la concentration molaire de protons contenue dans le volume de sept microlitres piégé par la sonde de mesure. La pente linéaire correspond au pouvoir tampon exprimé en unités milli pH. Pour charger alternativement les protons, remplir les ports A, B et C avec le milieu d'essai, puis ajouter la concentration appropriée d'acide chlorhydrique dans le port D, comme indiqué dans le tableau.Ensuite, mesurez le pH à l’aide des quatre réplicats techniques pour générer chaque point d’une courbe standard à cinq points dans les 20 puits expérimentaux de la plaque de dosage de flux extracellulaires. Pour mesurer la puissance tampon avec un pH-mètre externe, chauffez le milieu de dosage des étalons de pH et l’acide chlorhydrique 0,1 molaire à 37 degrés Celsius dans un bain-marie, et chauffez la sonde de pH dans le tampon d’étalonnage à 37 degrés Celsius pendant que les autres matériaux chauffent. Étalonnez la sonde à 37 degrés Celsius selon les instructions du fabricant et aliquotez 10 millilitres du milieu de dosage dans un petit récipient.Immerger la sonde de pH dans le milieu pour une surveillance continue. Ensuite, ajouter de l'acide chlorhydrique 0,1 molaire au milieu d'essai par aliquotes de 10 à 20 microlitres à la fois, en remuant le milieu. Après chaque ajout, laisser le pH se stabiliser pendant quelques secondes après chaque addition d'acide et noter la mesure de pH comme indiqué dans le tableau.Effectuez un nombre suffisant d'ajouts pour garantir un calcul précis de la pente et couvrir la plage de pH attendue pendant l'expérience, 30 minutes avant le dosage. Lavez la population appropriée de cellules adhérentes trois fois en aspirant doucement le milieu, puis en ajoutant lentement 500 microlitres de KRPH dans chaque puits après le troisième lavage. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius sous air pendant 30 minutes pour démarrer le dosage.Remplacer le milieu dans chaque puits par 500 microlitres de KRPH frais contenant 500 unités par millilitre d’anhydrase carbonique avec ou sans pipette de glucose. Prélever des aliquotes de 50 microlitres de chaque composé expérimental dans les orifices de la cartouche d’une cartouche de capteur de flux extracellulaire aux concentrations appropriées et effectuer un dosage standard de flux extracellulaire pour déterminer le rapport de contrôle respiratoire sur cette figure. Les données d’une expérience typique sont présentées ici en utilisant les 10 derniers points de mesure issus de l’enregistrement point par point du taux de consommation d’oxygène et du pH pour les calculs.Les taux de production de protons respiratoires et de protons glycolytiques, calculés à partir des taux individuels d'acidification extracellulaire et de consommation d'oxygène, permettent de déterminer les conditions natives avant l'ajout du port. Une addition d'oligomycine montre les taux natifs d'acidification respiratoire et glycolytique. Les taux après l'ajout d'oligomycine et les taux après l'ajout de FCCP, calculés à partir du tableau, sont représentés sur le graphique, illustrant clairement comment les proportions d'acidification respiratoire et glycolytique varient en réponse aux changements de substrat.Pour cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer l'acidification à la même température que celle des expériences prévues, généralement 37 degrés Celsius, en suivant cette procédure. D'autres dosages, comme la mesure du lactate, peuvent être utilisés pour valider le taux glycolytique calculé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de recueillir et de corriger les données de flux extracellulaire afin de distinguer entre l'acidification extracellulaire respiratoire et glycolytique, en utilisant une calibration acide interne ou externe.N'oubliez pas que le travail avec des poisons mitochondriaux peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et la mesure du réactif sec sous hotte chimique, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

measurement-analysis-extracellular-acid-production-to-determine

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ce protocole fournit une approche biochimique pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR) des cellules leucémiques primaires avec le dosage du flux extracellulaire. L’évaluation du profil métabolique de ces cellules permet de caractériser leurs demandes, ce qui conduit à une thérapie personnalisée.

Dosage du flux extracellulaire : une méthode de mesure du profil métabolique des cellules

La reprogrammation métabolique est une caractéristique et une condition préalable à la polarisation des macrophages M1 et M2. Ce manuscrit décrit un test pour la mesure des paramètres fondamentaux de la glycolyse et de la fonction mitochondriale dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris. Cet outil peut être utilisé pour étudier comment des facteurs particuliers affectent le métabolisme et le phénotype du macrophage.

Caractérisation métabolique des polarisée M1 et M2 macrophages dérivées de moelle osseuse Utilisation en temps réel Analyse extracellulaire Flux

L’étude du métabolisme devient de plus en plus pertinente pour la recherche immunologique. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les splénocytes de souris et les lymphocytes T et B.

Un protocole optimisé pour l&#39;analyse glycolyse et mitochondrial Respiration dans Lymphocytes

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des cellules leucémiques de leucémie patients la moelle osseuse et l’analyse de leur état métabolique. Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires pourrait aider à mieux caractériser la demande des cellules primaires et pourrait mener à une médecine plus personnalisée.

Évaluation du profil métabolique des cellules leucémiques primaires

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les cellules humaines primaires de tueur naturel (NK) isolées du sang périphérique, au repos ou après l’activation induite par l’IL15. Le protocole décrit pourrait être facilement étendu aux cellules NK humaines primaires activées par d’autres cytokines ou stimuli solubles.

Analyse du métabolisme des cellules tueuses naturelles humaines

Décrit ici est un protocole détaillé pour effectuer un test de stress mitochondrial et un test de taux glycolytique dans des échantillons de tissu rétinien ex vivo à l’aide d’un bioanalyseur commercial.

Détermination de la respiration mitochondriale et de la glycolyse dans des échantillons de tissu rétinien ex vivo

L’évaluation de la phosphorylation oxydative à l’aide de respiromètres à haute résolution est devenue une partie intégrante de l’analyse fonctionnelle des mitochondries et du métabolisme énergétique cellulaire. Ici, nous présentons des protocoles pour l’analyse du métabolisme énergétique cellulaire à l’aide de respiromètres haute résolution à chambre et à microplaques et discutons des principaux avantages de chaque appareil.

La respirométrie à haute résolution pour évaluer la bioénergétique dans les cellules et les tissus à l’aide de respiromètres à chambre et à plaques

La méthode présentée ici résume les protocoles optimisés pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives (HSPC) non adhérentes de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR) des HSPC en temps réel.

Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

Ici, nous décrivons en détail les méthodes d’extraction des macrophages de la moelle osseuse, de la rate et du cœur infarctus, puis d’évaluation du flux métabolique dans les cellules vivantes.

Analyse du flux métabolique ex vivo dans les macrophages spléniques et cardiaques et les monocytes de la moelle osseuse

Ce protocole décrit une méthode rentable pour réaliser un test de résistance à la glycolyse afin de quantifier la reprogrammation métabolique dans la microglie primaire de la souris. Après isolement et stimulation inflammatoire, le taux d’acidification extracellulaire (RARE) est mesuré à l’aide de réactifs fraîchement préparés et ajustés en pH, suivi d’une normalisation des protéines afin de permettre une évaluation précise et reproductible des déplacements glycolytiques.

Étude de la glycolyse dans la microglie primaire à l’aide d’un test de flux extracellulaire

Apprenez à mesurer le taux glycolytique cellulaire par analyse du flux extracellulaire. Cette méthode permet de corriger quantitativement l'acidification totale pour distinguer les contributions respiratoires et glycolytiques.

Mesure et analyse de la production extracellulaire acide pour Déterminer glycolytique Taux

Explorer plus de vidéos