Préparation de thermosensible surfaces nanostructurées pour l'ingénierie tissulaire

Le but global de cette méthode de Langmuir-Schaefer utilisant des copolymères en bloc consiste à fabriquer des feuillets cellulaires dans diverses conditions sur une surface sensible à la température, en contrôlant l'intensité de l'adhésion et des attaches cellulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des biomatériaux, telles que les matériaux biocompatibles, les surfaces de culture cellulaire et la bioséparation. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que l'interaction entre la surface sensible à la température et les cellules peut être contrôlée, et que les conditions de modification pour la récupération des feuillets cellulaires peuvent être optimisées.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'interaction entre la cellule et la surface, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que la bio-séparation et les biofilms. Pour commencer, dissoudre le styrène, l'ECT et l'ACVA dans 40 millilitres de 1,4-dioxane. Congeler la solution dans de l'azote liquide sous vide pendant 15 à 20 minutes afin d'éliminer les espèces réactives.

Après avoir décongelé progressivement la solution à température ambiante, répétez trois fois le cycle de congélation, pompage, décongélation et dégazage. Obtenez l'agent macro-RAFT en polystyrène par polymérisation à 70 degrés Celsius pendant 15 heures dans un bain d'huile. Précipitez l'agent macro-RAFT en polystyrène avec 800 millilitres d'éther, puis séchez sous vide.

Ensuite, dissoudre le monomère IPAAm, l'agent macro-RAFT en polystyrène et l'ACVA dans quatre millilitres de 1,4-dioxane. Éliminer l'oxygène de la solution par des cycles de dégazage par congélation, pompage et décongélation, comme précédemment. Réaliser une polymérisation à 70 degrés Celsius pendant 15 heures dans un bain d'huile après le dégazage.

Enfin, obtenir la molécule de St-IPAAm synthétisée de la même manière que l'agent macro-RAFT de polystyrène. Laver les substrats en verre avec un excès d'acétone et d'éthanol, puis les soniquer pendant cinq minutes afin d'éliminer les contaminants de surface. Sécher les substrats dans une étuve à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, utilisez un plasma d'oxygène pour activer les surfaces des substrats à température ambiante. Plongez les substrats dans du toluène contenant 1 % d'hexatriméthoxysilane pendant une nuit à température ambiante afin de silaniser le substrat. Puis, lavez les substrats silanisés dans du toluène et immergez-les dans de l'acétone pendant 30 minutes pour éliminer les agents non réagis.

Hybrider les substrats pendant deux heures à 110 degrés Celsius afin d'immobiliser complètement la surface. Enfin, découper les substrats silanisés à l'aide d'un coupe-verre en morceaux de 25 millimètres sur 24 millimètres pour qu'ils s'adaptent aux boîtes de culture cellulaire. Placer l'instrument de film de Langmuir dans un cabinet pour éviter l'accumulation de poussière.

Lavez le bac de Langmuir et les barrières avec de l'eau distillée et de l'éthanol afin d'éliminer les contaminants. Séchez le bac et les barrières en les essuyant avec un torchon sans peluches. Ensuite, remplissez le bac avec environ 110 millilitres d'eau distillée, puis placez les barrières de chaque côté du bac.

Ensuite, chauffez une plaque de platine Wilhelmy utilisée pour le suivi de la tension superficielle à l’aide d’un bec Bunsen jusqu’à ce que la plaque devienne rouge. Lavez ensuite la plaque avec de l’eau distillée pour éliminer les contaminants. Suspendez la plaque de Wilhelmy à un fil attaché à l’instrument de mesure de la pression superficielle.

Mettre à zéro l'instrument de mesure de la pression superficielle conformément au protocole du fabricant. Comprimer l'interface air-eau dans la cuve à l'aide des barrières situées des deux côtés de la cuve jusqu'à ce que l'interface atteigne environ 50 centimètres carrés, sans aucune goutte de polymère. Aspirer toutes les petites impuretés jusqu'à ce que la pression superficielle soit presque nulle, soit près de zéro millinewton par mètre.

Repositionnez les barrières des deux côtés et ajoutez de l'eau distillée pour compenser la diminution d'eau distillée. Ensuite, dissolvez cinq milligrammes de la molécule St-IPAAm synthétisée dans cinq millilitres d'une solution de développement au chloroforme. Puis, laissez tomber délicatement 27 microlitres de St-IPAAm dissous dans le chloroforme dans la cuve à l'aide d'une microsyringe ou d'une micropipette.

Après avoir attendu cinq minutes pour permettre l'évaporation complète du chloroforme, déplacez horizontalement les deux barrières afin de comprimer la molécule de St-IPAAm à la surface. Maintenez une vitesse de compression des barrières de 0,5 millimètre par seconde jusqu'à ce que la surface cible de 50 centimètres carrés soit atteinte. Mesurez les isothermes de pression de surface Pi-A à l'aide de la plaque de Wilhelmy en platine fixée à l'instrument de mesure de pression de surface pendant la compression, conformément au protocole du fabricant.

Une fois la taille de la zone cible atteinte, maintenir la surface pendant cinq minutes afin de permettre aux molécules de St-IPAAm de se détendre. Les molécules n'atteignent pas l'équilibre immédiatement après la compression. Ensuite, transférer le film de Langmuir sur un substrat en verre modifié de manière hydrophobe à l'aide d'un appareil de transfert pendant cinq minutes afin d'assurer une absorption robuste du film.

Fixez le substrat en verre hydrophobe parallèlement sur le dispositif. Connectez le dispositif à une platine d'alignement et déplacez-le perpendiculairement. Soulevez le substrat horizontalement à l'aide de l'appareil de transfert et faites-le sécher pendant un jour dans un dessiccateur.

Pour préparer des suspensions cellulaires, cultiver des cellules endothéliales de l'artère carotide bovine, ou BAEC, jusqu'à une confluence d'un tiers à 37 degrés Celsius, sous 5 % CO₂ et 95 % air, sur du polystyrène pour culture cellulaire dans un milieu DMEM contenant du FBS et de la pénicilline. Une fois la confluence atteinte, traiter les BAEC avec trois millilitres de trypsine EDTA à 0,25 % pendant trois minutes à 37 degrés Celsius, sous 5 % CO₂ et 95 % air. Inactiver la trypsine EDTA en ajoutant 10 millilitres de DMEM contenant 10 % de FBS.

Et recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Après centrifugation à 120 ×g pendant cinq minutes, aspirer le surnageant et resuspendre les cellules dans 10 millilitres de DMEM. Ensemencer les cellules récupérées sur les surfaces St-IPAAm à une concentration de 10 000 cellules par centimètre carré, dénombrées à l’aide d’un hémocytomètre jetable.

Observer les cellules sur les surfaces à l’aide d’un microscope équipé d’un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 et 95 % d’air. Ensuite, stériliser les surfaces de St-IPAAm à l’aide d’une lumière ultraviolette intégrée dans un banc propre. Enregistrer des images en enregistrement temporel des BAEC adhérents pendant environ 24,5 heures à 37 degrés Celsius à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 10x.

Après l'adhésion des BAEC, enregistrer le détachement des BAEC de la surface St-IPAAm à 20 degrés Celsius pendant environ 3,5 heures. Après optimisation de l'adhésion et du détachement cellulaires sur la surface transférée de film de Langmuir, fabriquer les feuillets cellulaires en cultivant d'abord les BAEC comme précédemment. Ensemencer un total de 100 000 cellules par centimètre carré sur les surfaces St-IPAAm.

Et incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius sous 5 % de CO2. Les BAEC confluentes se sont détachées spontanément à 20 degrés Celsius. La préparation d'une surface transférée de film de Langmuir sensible à la température est indiquée ici.

La solution de St-IPAAm dans le chloroforme a été déposée délicatement sur une interface air-eau. Deux barrières ont été utilisées pour comprimer les molécules de St-IPAAm à l'interface jusqu'à ce qu'une surface cible de 50 centimètres carrés soit atteinte. La pression superficielle a été mesurée pendant la compression afin de détecter d'éventuels défauts dans le film de Langmuir.

Après compression, un substrat de lame de verre modifié hydrophobiquement a été placé horizontalement sur l'interface à l'aide d'un dispositif d'alignement. Le substrat a été soulevé horizontalement et séché pendant un jour. Après cette étape, les surfaces St-IPAAm étaient prêtes à être utilisées dans des expériences de culture cellulaire.

Des résultats représentatifs d'images topographiques par microscopie à force atomique des surfaces de St-IPAAm sont présentés ici. Des nanostructures ont été observées sur les deux types de surfaces de St-IPAAm. La taille et la forme des nanostructures dépendaient fortement de l'AM et de la composition du St-IPAAm.

Ici, une image macroscopique d'une feuille cellulaire récupérée sur une surface de transfert de film de Langmuir avec du St-IPAAm 480, et une AM de 40 nanomètres carrés par molécule, est présentée. Les cellules ont atteint la confluence après trois jours de culture sur les surfaces de St-IPAAm 170 et de St-IPAAm 480 à 37 degrés Celsius. Et la feuille cellulaire a été rapidement récupérée après abaissement de la température de 37 à 20 degrés Celsius.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer et concevoir la composition moléculaire d'un polymère, fabriquer et transférer un film de Langmuir, contrôler l'adhésion et le détachement des cellules, et récupérer une feuille cellulaire. Depuis son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des biomatériaux et du génie tissulaire pour explorer les interactions entre les cellules et les surfaces, ainsi que les stratégies de culture cellulaire destinées à être utilisées en médecine régénérative. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie par transplantation cellulaire, car elle permet potentiellement de fabriquer des feuillets cellulaires à partir de divers types cellulaires provenant de patients.