Stem Cell-like

L'objectif général de ce protocole est d'utiliser des explants de toit de blastocèle ou de cap animal de x laevis pour tester les mécanismes moléculaires et les processus cellulaires sous-jacents au développement neural in vitro et in vivo. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie du développement et de la biologie des cellules souches concernant l'acquisition du destin cellulaire, la migration cellulaire, ainsi que les propriétés autonomes et non autonomes des cellules neuronales. Les techniques présentées offrent des outils simples, peu coûteux, polyvalents et efficaces pour explorer les mécanismes fondamentaux régissant le comportement des cellules neuronales clés.

Ces tests permettent d'évaluer les déterminants du destin neuronal pour la reprogrammation de cellules souches pluripotentes induites et la génération mature de cellules dérivées du tissu nerveux en vue de criblages approfondis. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car les techniques exigent une dextérité manuelle. J'ai eu l'idée de ces méthodes lorsque je réfléchissais à l'analyse du comportement de ségrégation cellulaire.

Pour monter à plat le tube neural antérieur de Xenopus laevis, utiliser une pipette plastique de transfert pour placer un embryon fixé, déshydraté et réhydraté dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie à ras bord de PBT. Ensuite, insérer une paire de pinces fines entre les yeux et le tube neural au niveau du pédoncule optique, puis détacher les yeux. Puis, introduire délicatement la pince sous l'ectoderme recouvrant le tube neural à l'arrière de la tête et retirer soigneusement l'ectoderme.

Après avoir effectué l'hybridation NC2 appropriée et le marquage, transférez l'embryon dans une nouvelle boîte de Pétri de 60 millilitres remplie de PBT et utilisez une pince fine pour isoler grossièrement le tube neural antérieur de l'embryon. Ensuite, retirez soigneusement la notocorde faiblement attachée située sous le tube neural. Si nécessaire, retirez également les vésicules otiques et les parties restantes du mésoderme.

Lorsque tous les appendices du tube neural ont été sectionnés, séparez le tube neural antérieur de l'embryon. Ensuite, transférez le tube neural isolé dans un tube conique de 1,5 millilitre rempli de glycérol à 50 % dans du PBS pour un traitement nocturne à quatre degrés Celsius. Après un second traitement nocturne dans du glycérol à 90 %, transférez le tube neural sur une lame de microscope dans une petite quantité de glycérol et utilisez des aiguilles en tungstène pour disséquer les tubes neuraux le long des lignes médianes dorsale et ventrale.

Ensuite, utilisez des anneaux de renfort recouverts d'une lame de verre pour monter les deux côtés du tube neural dans un mélange à 90 % de glycérine et de PBS. Pour préparer la perle destinée à l'induction d'un explant de calotte animale, utilisez une micropipette P200 pour transférer la moitié d'un aliquot de perles de résine traitées à l'albumine de sérum bovin (BSA) dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Remplacez ensuite l'eau distillée stérile du nouveau tube par 200 microlitres de milieu contenant la molécule expérimentale d'intérêt, et incubez pendant deux heures à quatre degrés Celsius.

À la fin de l'incubation, transférez les embryons en stade de blastula ou de gastrula très précoce dans du PBS contenant du calcium et du magnésium, supplémenté avec 0,2 % de BSA. Ensuite, sous un microscope stéréo, pincez la membrane vitelline avec le côté d'une paire de forceps et utilisez une deuxième paire de forceps pour détacher lentement la membrane depuis le côté végétal de l'embryon, en prenant soin de ne pas endommager le côté animal. Puis, à l’aide de forceps fins, découpez un petit carré au pôle animal de chaque embryon.

À l’aide d’une pointe de pipette revêtue de BSA, transférez les calottes dans des puits individuels d’une plaque multi-puits Terasaki contenant du sérum physiologique de Barth modifié à 0,5X, en plaçant le côté animal pigmenté en contact avec le fond arrondi du puits. À l’aide d’une micropipette P20, sélectionnez les billes rose foncé provenant du tube de traitement et déposez une bille sur chaque calotte, en utilisant une pince pour centrer les billes sur les calottes. Une fois la dernière bille placée, posez la plaque sur des feuilles de papier imbibées d’eau et recouvrez-la avec un récipient en plastique avant l’incubation.

Pour préparer des explants de calottes animales dissociés et réagrégés, isoler 15 à 30 calottes animales comme vient d'être démontré. Utiliser des pinces fines pour découper un petit carré de tissu à partir des pôles animaux. Transférer les calottes animales dans une cavité recouverte d'agarose, remplie de solution saline de Holtfreter sans calcium, en les plaçant avec leur côté pigmenté vers le haut.

Après quelques minutes, une désagrégation devrait être observée. Utilisez une pince fine pour séparer les couches pigmentées du reste du tissu. Ensuite, utilisez une micropipette P20 pour éliminer le pigment.

Lorsque la majorité des couches pigmentées ont été retirées et que les cellules sont complètement dissociées, faire tourbillonner la plaque pour recentrer les cellules, puis utiliser une micropipette P1000 pour éliminer autant que possible le milieu, en prenant soin de ne pas toucher les cellules. Ensuite, ajouter un millilitre de solution saline de Holtfreter contenant du calcium dans le puits. Transférer les calottes animales dissociées dans un tube de 1,5 millilitre.

Après avoir centrifugé les cellules, utilisez une micropipette P1000 pour retirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 20 microlitres de solution saline de Holtfreter avec calcium. Laissez les cellules se réagréger pendant trois à six heures à température ambiante. Ensuite, ajoutez lentement un millilitre de NAM 3/4 pour détacher délicatement les explants du fond du tube, puis utilisez une pipette plastique de transfert pour répartir les explants dans des plaques individuelles non revêtues.

Pour transplanter des explants de chapeau animal sur des plaques neurales de Xenopus laevis, commencez par recouvrir des boîtes de Pétri de 60 millimètres avec de l'agarose à 3 % et du NAM aux 3/4 dans lesquels de petits trous auront été pratiqués. Ensuite, transférez des embryons en stade de neurula précoce dans du PBS contenant du calcium et du magnésium supplémenté avec 0,2 % de BSA afin de retirer la membrane vitelline. Puis, remplissez la boîte de dissection recouverte d'agarose avec du NAM frais aux 3/4 et transférez les embryons dans la boîte de dissection, côté dorsal vers le haut.

Maintenant, transférez un explant de calotte animale réagrégée vers la plaque de dissection, en laissant l'explant s'enfoncer lentement dans la boîte par gravité une fois que la pointe de la pipette a franchi la surface du NAM. Ensuite, sous un microscope stéréo, utilisez une pince arrondie pour maintenir l'embryon en place tout en effectuant une incision sur la plaque neurale à l'aide d'une aiguille en tungstène afin d'insérer l'explant. Découpez un petit morceau de l'explant de calotte animale réagrégée à l’aide de la pince arrondie et d’un bistouri à sourcils.

Utilisez le fragment de tissu pour dimensionner un morceau d’explant destiné à la greffe. Cette figure montre des tubes neuraux antérieurs de X laevis et de X tropicalis montés à plat comme vient de l’être démontré aux stades 30, 32 et 35 après une hybridation double en montage entier avec NC2. Comme on peut l’observer sur ces images, l’expression du gène sonic hedgehog de Xenopus est détectée dans les cellules en contact avec des billes imprégnées de milieu conditionné supplémenté avec l’extrémité C-terminale du gène sonic hedgehog, mais pas dans les cellules en contact avec des billes traitées avec un milieu témoin.

Après dissociation et réagrégation comme vient de l'être démontré, ces explants contenant des cellules de calotte animale antériorisées ont été mélangés avec des cellules de calotte animale antériorisées exprimant Otx2. Comme observé, ces cellules exprimant Otx2 ne se sont pas séparées des cellules ne l'exprimant pas. Les deux types de cellules se sont librement intercalés dans tout l'explant.

En revanche, dans les explants où les cellules exprimant Otx2 étaient mélangées à des cellules BAR HL-2, Otx2 et IRX3, les cellules exprimant plusieurs gènes formaient des agrégats cohérents qui ne se répartissaient pas uniformément au sein de l’explant réagrégé. Lorsqu’ils étaient greffés dans la plaque neurale antérieure d’embryons de x laevis comme vient de l’être démontré, les explants mixtes composés de cellules coexprimant BAR HL-2, Otx2 et IRX3, mélangés à des cellules exprimant la partie N-terminale du sonic hedgehog, présentaient une expression endogène de sonic hedgehog et s’isolaient des cellules épithéliales neurales antérieures. En revanche, lorsque des explants mixtes composés de cellules exprimant Otx2 et la partie N-terminale du sonic hedgehog étaient greffés dans la plaque neurale de x laevis, les cellules greffées n’exprimaient ni sonic hedgehog ni ne s’isolaient de leurs cellules voisines.

Une fois maîtrisée, la greffe de l'ectoderme de bonnet sur des plaques neurales embryonnaires peut être réalisée en deux à trois heures, selon le nombre d'embryons greffés. Il s'agit d'une technique très robuste et particulièrement gratifiante. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel d'être extrêmement vigilant quant à la contamination bactérienne et fongique.

Après les procédures de greffe, d'autres méthodes comme l'hybridation in situ sur préparation entière peuvent être réalisées afin de suivre le devenir et le comportement des cellules greffées. Les programmes développementaux sous-jacents à l'organogenèse du tube neural sont largement conservés, en particulier chez les vertébrés. Ainsi, les informations obtenues chez les amphibiens ont approfondi notre compréhension des processus cellulaires et moléculaires sous-jacents au développement des vertébrés.