Name: Isolement des régions génomiques spécifiques et lidentification des molécules associées par enChIP (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Découvrez la technique enChIP pour isoler des régions génomiques spécifiques et identifier les protéines et ARN associés. Cette méthode permet d'étudier la transcription et la régulation épigénétique avec une grande précision.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation sciences Takeda (TF); la Fondation Asahi Glass; l&#39;Uehara Memorial Foundation (HF); l&#39;Kurata Memorial Technology Foundation (TF et HF) Hitachi sciences et de la; Grant-in-Aid pour jeunes scientifiques (B) (# 25830131), Grant-in-Aid pour la recherche scientifique (C) (# 15K06895) (TF); et un Grant-in-Aid pour la recherche scientifique sur de cycle de transcription »des domaines innovants (# 25118512 &amp; # 15H01354), Grant-in-Aid pour la recherche scientifique (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid pour la recherche exploratoire ( # 26650059) et Génome Support &#39;(# 221S0002) (HF) du ministère de l&#39;Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie du Japon.

1. Conception de molécules Engineered liaison à l&#39;ADN Reconnaissant le Locus cible <ol><li> Pour enChIP utilisant des complexes CRISPR, utilisez l&#39;outil Web de CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) pour identifier des séquences cibles ARNg candidat dans la région génomique d&#39;intérêt, comme décrit précédemment 18. Cet outil Web renvoie 23 pb des sites génomiques de la forme 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;dans la région cible. </li><li> Synthétiser un gBlock comprenant la séquence de promoteur U6 et de la séquence 5&#39;-N 20 en 5&#39;-N 20 NGG-3 &#39;en utilisant les services commerciaux (voir la figure 2) 19,20. À des fins de sous-clonage, inclure des sites d&#39;enzymes de restriction appropriés à l&#39;extérieur de la gBlock. </li><li> Insérez le gBlock dans un vecteur approprié comme décrit précédemment 16. Plusieurs vecteurs rétroviraux pour gBlocks sont disponibles (voir Matériaux). </li><li> Pour enChIP utilisant des protéines TAL, concevoir des protéines TAL reconnaissant le target loci. Générer des plasmides codant pour des protéines TAL utilisant les services commerciaux. Générer des vecteurs d&#39;expression contenant les protéines TAL condensés avec un ou plusieurs mots-clés tels que FLAG 3 × 15 comme décrit précédemment. </li></ol> 2. Mise en place de cellules pour l&#39;analyse des enChIP <ol><li> Exprimez 3 × FLAG-dCas9 et ARNg (procédure basée CRISPR-) ou 3 × FLAG-TAL (TAL procédure à base de protéines) dans les cellules pour être analysé comme décrit précédemment 14-17. <ol><li> Utilisez transfection transitoire si l&#39;efficacité de la transfection est élevé. Un vecteur d&#39;expression contenant 3 × FLAG-dCas9 et le promoteur CMV est disponible (voir Matériaux). </li><li> Envisager de créer des transformants stables en utilisant des méthodes conventionnelles si l&#39;efficacité de transfection transitoire est faible. En plus des vecteurs de retrovirus mentionnés ci-dessus pour gBlock, des vecteurs rétroviraux de 3 × FLAG-dCas9 sont disponibles (voir Matériaux). </li></ol></li><li&gt; Confirmation de l&#39;expression du 3xFLAG-dCas9 ou protéine 3xFLAG-TAL dans les cellules transfectées par analyse par immunotransfert en utilisant un anticorps anti-FLAG (Ab) 14 à 17 comme décrit précédemment. Note: L&#39;expression de ces protéines marquées peuvent également être confirmée par coloration intracellulaire avec anti-FLAG-FITC et une analyse FACS ultérieure. Un protocole pour la coloration intracellulaire peut être téléchargé à partir de notre page d&#39;accueil (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). </li><li> Confirmez expression de la ARNg par la technique RT-PCR standard. </li><li> Pour l&#39;identification quantitative des protéines interagissant avec la région génomique d&#39;intérêt, envisager l&#39;utilisation d&#39;un marquage isotopique stable par les acides aminés dans la culture cellulaire (SILAC) d&#39;analyse combiné avec enChIP (enChIP-SILAC). Remarque: Le support pour l&#39;analyse de SILAC peuvent être achetés auprès de fournisseurs commerciaux. SILAC est puissante dans la détection des interactions spécifiques. <ol><li> Les cellules de la culture dans SILAC milieu lourd. Préparer des cellules culturouge dans le milieu de la lumière de SILAC comme contrôle négatif. Utilisez au moins 5 × 10 7 cellules pour chaque moyen de SILAC (lourd ou léger). Pour un marquage efficace, ajoutez les deux L-lysine-2HCl, 13 C 6 et L-arginine-HCl, 13 C 6, 15 N 4 dans les médias SILAC lourds. Remarque: Au moins cinq divisions cellulaires sont nécessaires pour les protéines de l&#39;étiquette. <ol><li> Par exemple, la culture de cellules de fibrosarcome HT1080 humaines exprimant de manière stable 3xFLAG-dCas9 et un ARNg à 37 ° C et 5% de CO 2 dans des milieux DMEM pendant SILAC et sérum dialyse de fœtus bovin avec Lysine-2HCl ainsi que la L-arginine-HCl (milieu de lumière) ou 13 C 6 L-lysine-2HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-arginine-HCl (milieu lourd) (voir Matériaux) 16. Ajouter 50 mg de léger ou lourd de L-lysine 2HCI et L-arginine-HCl dans 500 ml de milieu. </li><li> Cellules Trypsiniser et replate avant qu&#39;ils ne deviennent confluentes sorte que les cellules conservent growt exponentielleh. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. La réticulation des cellules avec du formaldéhyde <ol><li> Pour les cellules en culture en suspension, le transfert de 2 × 10 7 cellules exprimant des protéines 3xFLAG-Tal ou 3xFLAG-dCas9 ainsi ARNg et suspendre dans 30 ml de milieu de culture régulière dans un tube de 50 ml de la centrifugeuse. Lorsque plusieurs cellules sont utilisées, augmenter les volumes et quantités de réactifs proportionnellement. Pour les expériences de SILAC, mélanger les cellules cultivées dans un milieu lourd ou moyen de lumière (5 x 10 7 cellules chacun) et diviser le total de 1 x 10 8 cellules dans 5 tubes contenant 2 x 10 7 cellules. </li><li> Ajouter 810 ul de formaldehyde à 37% à 30 ml de la suspension de cellules (concentration finale 1%) et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Pour les cellules adhérentes, fixer directement les cellules dans des boîtes de culture en ajoutant 810 ul de 37% de formaldéhyde à 30 ml de milieu de culture. </li><li> Arrêter la reticulation par addition de 3,1 ml de 1,25 M une solution de glycine (concentration finale 127 mM), etincuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation (300 g pendant 5 min à 4 ° C). Prenez soin de le surnageant dont le formaldéhyde et le stocker dans un flacon de récupération approprié. <ol><li> Pour les cellules adhérentes, détacher les cellules avec un grattoir à cellules et la récolte dans un tube de 50 ml, et de recueillir des cellules de la manière décrite dans cette étape. </li><li> Pour les expériences de SILAC, mélanger les cellules individuelles cultivées dans un milieu lourd ou moyen de lumière (5 x 10 7 cellules chacun), diviser le total de 1 x 10 8 cellules dans 5 tubes contenant 2 x 10 7 cellules, et de recueillir des cellules telles que décrites dans le présent marche. </li></ol></li><li> Laver le culot cellulaire avec 30 ml de PBS deux fois par tube. Prenez soin de le surnageant dont le formaldéhyde et le stocker dans un déchets approprié bottle.Handle les déchets de formaldéhyde conformément aux lignes directrices de la sécurité chimique. Les cellules fixées peuvent être congelés et conservés à -80 ° C. </li></ol> 4. Préparation de la chromatine (par 2 x 107 cellules) <ol><li> Suspendre les cellules fixées dans 10 ml de tampon de lyse cellulaire (10 mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 0,5% de IGEPAL CA-630 et 1 x inhibiteurs de protease) et laisser incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Centrifugeuse l&#39;échantillon (830 g à 4 ° C pendant 8 min) et jeter le surnageant avec précaution. </li><li> Suspendre le culot dans 10 ml de tampon de lyse nucléaire (Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, 1% de Triton X-100, le désoxycholate à 0,5% de sodium, 0,5% de lauroylsarcosine, et les inhibiteurs de protéase 1x). Incuber sur de la glace pendant 10 min et vortex toutes les 2-3 min. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon (830 × g à 4 ° C pendant 8 min) et jeter le surnageant avec précaution. </li><li> Laver le culot dans 10 ml de PBS. Le culot (fraction de la chromatine) peut être stocké à -80 ° C après congélation immédiate dans de l&#39;azote liquide. </li></ol> 5. Le traitement par ultrasons de la chromatine (par 2 x 10 7 cellules) <ol><li> Suspendre la fraction de la chromatine dans 800 pi detampon de lyse 3 modifié (mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium à 0,1%, 0,1% SDS, et 10 1x inhibiteurs de protease) et transférer dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Soniquer la chromatine en utilisant un appareil à ultrasons (voir Matériaux) et les conditions suivantes: Sortie: 3; devoir: 100% (en continu); et l&#39;heure: gratuit. Effectuer 10-18 cycles de traitement par ultrasons pendant 10 secondes et le refroidissement sur de la glace pendant 20 sec. Pour éviter un échauffement excessif, incuber les échantillons sur la glace pendant 2 min tous les 5-6 cycles. Pour éviter la formation de mousse, garder la position de la pointe de la sonde ultrasons 0,5 cm au-dessus du fond du tube. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à (16 000 xg à 4 ° C pendant 10 min) et le surnageant transférer dans un tube de 1,5 ml. La chromatine traitée aux ultrasons peut être conservé à -80 ° C après congélation immédiate dans de l&#39;azote liquide. </li></ol> 6. Évaluation de la chromatine fragmentation <ol><li> Mélanger 10 pi de la chromatine fragmentée avec 85 pi d&#39;eau distillée. </li><li> Ajouter 4 pi5 M de NaCl et incuber à 65 ° CO / N. </li><li> Ajouter 1 pi de 10 mg / ml de RNase A et incuber à 37 ° C pendant 45 min. </li><li> Ajouter 2 ul d&#39;EDTA 0,5 M (pH 8,0), 4 pi de Tris 1 M (pH 6,8) et 1 ul de 20 mg / ml de proteinase K, puis incuber à 45 ° C pendant 1,5 heure. </li><li> Séparer 10 ul de l&#39;échantillon par électrophorèse dans un gel d&#39;agarose à 1% qui ne contient pas de coloration tels que des colorants SYBR Green. </li><li> Colorer le gel à évaluer la distribution des longueurs de la chromatine fragmentée. Conditions qui génèrent une longueur moyenne de 0,5-2 kpb (gamme de 0,2-4 kb) sont recommandés. </li><li> On purifie l&#39;ADN à partir des échantillons restants par extraction au phénol-chloroforme ou en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ADN (voir Matériaux). L&#39;ADN purifié peut être utilisé comme ADN d&#39;entrée pour estimer les rendements des analyses de enChIP (voir 8.11). </li></ol> 7. Préparation des Dynabeads conjugués avec des anticorps (par 2 x 10 7 cellules) <ol><li> Prérogner deux tubes de 1,5 ml, pour une pré-compensation en utilisant IgG de souris normale et l&#39;autre pour l&#39;incubation avec l&#39;anticorps anti-FLAG Ab. Ajouter 150 pi de billes de protéine G-magnétiques conjugué (voir Matériaux) à chaque tube. </li><li> Placer les tubes sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Jeter le surnageant par pipetage. </li><li> Suspendre les billes dans 1 ml de PBS contenant 0,01% de Tween-20 (PBS-T). Placer les tubes sur un support magnétique et attendre 2 min. Jeter le surnageant par pipetage, puis répétez l&#39;étape. </li><li> Suspendre les billes dans 1 ml de PBS-T contenant 0,1% de BSA. </li><li> Ajouter 15 ug d&#39;IgG de souris normale ou Ab anti-FLAG et tourner à 4 ° CO / N. </li><li> Isoler brièvement, puis placer les tubes sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Jeter le surnageant par pipetage. </li><li> Suspendre les billes dans 1 ml de PBS-T. Inversez les échantillons à plusieurs reprises et centrifuger brièvement. Placer les tubes sur un support magnétique et attendre pendant 3 min, puis jeter le surnageant par pipetage. Répétez le lavagedeux fois avec du PBS-T (total de trois étapes de lavage). </li></ol> 8. Immunoprécipitation de la chromatine (par 2 x 10 7 cellules) <ol><li> Mélanger la chromatine fragmentée préparé en 5.3) (environ 800 pi) avec un cinquième du volume (environ 200 ul) de tampon de lyse modifié 3 contenant 5% de Triton X-100 (concentration finale de 1% de Triton X-100). </li><li> Ajouter la solution de la chromatine dans le tube, dans lequel des billes magnétiques conjuguées protéine G avec conjugués IgG de souris normale ont été préparés. Tournez à 4 ° C pendant 1 heure. </li><li> Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. </li><li> Transférer le surnageant dans le tube, dans lequel des billes magnétiques conjuguées protéine G conjugués avec Ab anti-FLAG ont été préparés. Tournez à 4 ° CO / N. </li><li> Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Jeter le surnageant par pipetage. </li><li> Suspendre les billes dans 1 ml de tampon pauvre en sel (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inhibiteurs de la protéase, et 1x) et tourner à 4 ° C pendant 5 min. Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Jeter le surnageant par pipetage et répéter l&#39;étape de lavage. </li><li> Laver les billes avec du tampon riche en sel (Tris 20 mM (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% de Triton X-100, 0,1% SDS inhibiteurs de la protéase, et 1x) deux fois. </li><li> Laver les billes avec du tampon LiCl (10 mM de Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 250 mM de LiCl, 0,5% de IGEPAL CA-630, le désoxycholate de sodium à 0,5%, et les inhibiteurs de protéase 1x) deux fois. </li><li> Laver les billes avec du TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM de Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, des inhibiteurs IGEPAL CA-630, et 0,1% de protéase 1x) une fois. </li><li> Suspendre les billes dans 200 pl de tampon d&#39;élution (Tris 50 mM (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 0,1% de IGEPAL CA-630, les inhibiteurs de protéase 1x, et 500 ug / ml de 3 × FLAG peptide) et incuber à 37 ° C pendant 20 min. Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 3 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et répéter ce elutétape ions. </li><li> On purifie l&#39;ADN de faible portion (par exemple, 5%) de l&#39;éluat par extraction au phénol-chloroforme ou en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ADN (voir Matériaux). L&#39;ADN purifié peut être utilisé pour la PCR avec l&#39;amorce spécifique fixe à estimer les rendements de enChIP analyse en comparant avec l&#39;ADN d&#39;entrée préparé à l&#39;étape 6.7, comme décrit précédemment 14,16. </li></ol> 9. SDS-PAGE, coloration, et analyse par spectrométrie de masse <ol><li> Mélanger l&#39;éluat (400 ul) avec 1 ml de 2-propanol, 50 ul d&#39;acétate de sodium 3 M (pH 5,2), et 5 ul de 20 mg / ml de glycogène. Précipiter la chromatine à -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugeuse l&#39;échantillon (16 000 × g à 4 ° C pendant 30 min) et jeter le surnageant. Rincer le culot avec 1 ml d&#39;éthanol à 70% et centrifuger à nouveau (16 000 xg à 4 ° C pendant 10 min). Jeter le surnageant par pipetage complètement. </li><li> Suspendre le culot dans 40 ul de tampon échantillon 2x (125 mM de Tris (pH 6,8), 10% de 2-Mercaptoethanol, 4% de SDS, 10% de saccharose, et 0,004% de bleu de bromophénol). Vortex pendant 5 minutes pour dissoudre complètement la pastille, puis incuber à 100 ° C pendant 30 min pour dénaturer les protéines et inverse la réticulation. </li><li> Pour SDS-PAGE, courir 40 pl de l&#39;échantillon sur le gel jusqu&#39;à ce que le colorant atteint 1 cm en dessous du puits. Note: Nous utilisons habituellement 4-20% des gels de gradient, mais d&#39;autres gels% peut être utilisé. </li><li> Colorer le gel avec du bleu de Coomassie ou une coloration d&#39;argent. </li><li> Couper le gel en cinq morceaux (2 mm de hauteur). </li><li> Effectuer la digestion de gel et l&#39;analyse par spectrométrie de masse comme décrit précédemment 13-16. </li><li> Pour les expériences de SILAC avec 5 x 10 7 cellules chacune (total de 1 x 10 8 cellules), pastille de suspendre les cinq premiers tubes dans 40 ul de tampon d&#39;échantillon 2x (il ne faut pas mettre à l&#39;échelle vers le haut). </li></ol> 10. Purification d&#39;ARN et ARN-Seq Analyse <ol><li> Pour purifier l&#39;ARN après enChIP, ajouter 5 U / ml de RNase Inhibitor (SEe) à tous les matériaux de solutions tampons, à l&#39;exception du tampon de lyse 3 modifié et le tampon d&#39;élution, à laquelle ajouter 40 U / ml d&#39;inhibiteur de la RNase. </li><li> Mélanger l&#39;éluat (400 ul) avec 16 ul de NaCl 5 M et on incube à 65 ° C pendant 2 heures. </li><li> Ajouter 1 ml de réactif à base d&#39;acide guanidinium-phénol-(voir Matériaux) à l&#39;échantillon. Vortex pendant 15 secondes, puis incuber à température ambiante pendant 5-15 min. Centrifuger l&#39;échantillon pendant 15 min à 12 000 x g et la température ambiante. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et ajouter 5 pi de p-bromoanisole. Vortex pendant 15 secondes, puis incuber à température ambiante pendant 3-5 min. Centrifuger l&#39;échantillon pendant 10 min à 12 000 x g et la température ambiante. </li><li> Transférer le surnageant (environ 1 ml) dans un nouveau tube de 2 ml et ajouter 1 ml de 2-propanol. Retourner le tube et incuber à température ambiante pendant 10 min. Chargez le mélange sur une colonne dans un kit de purification d&#39;ARN (voir Matériaux). Centrifuger la colonne pendant 1 min à 12000 × g et la température ambiante. </li><li> lavagela colonne avec 400 pi d&#39;ARN tampon de lavage dans un kit de purification d&#39;ARN (voir Matériaux). </li><li> Ajouter 80 ul de désoxyribonucléase I cocktail (mélange de 5 pi de DNase I (1 U / pl), 8 pi de 10 × DNase I tampon de réaction, 3 ul d&#39;eau sans RNase DNase /, et 64 ul d&#39;ARN tampon de lavage dans un kit de purification d&#39;ARN (voir Matériaux)) de la colonne. Incuber l&#39;échantillon à 37 ° C pendant 15 min puis centrifuger pendant 30 secondes à 12 000 × g et RT. </li><li> Laver la colonne avec 400 pi d&#39;ARN prélavage tampon dans un kit de purification d&#39;ARN (voir Matériaux) deux fois. </li><li> Eluer l&#39;ARN avec 50 ul de DNase / RNase-free eau. L&#39;ARN élue peut être utilisé pour le séquençage de l&#39;ARN. </li></ol>

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<li>Cencic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protospacer+adjacent+motif+%28PAM%29-distal+sequences+engage+CRISPR+Cas9+DNA+target+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage.</a> PLoS One. 9, 109213(2014).</li>
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</ol>

Les auteurs ont déposé un brevet sur enChIP (Nom du brevet : 'Méthode d’isolement de régions génomiques spécifiques à l’aide de molécules de liaison à l’ADN reconnaissant des séquences d’ADN endogènes' ; Numéro de brevet : PCT/JP2013/74107). H.F. est membre du conseil consultatif d’Addgene.

Ici, nous décrivons la purification de régions génomiques spécifiques à l’aide de molécules de liaison à l’ADN modifiées telles que le système CRISPR et les protéines TAL, et l’identification de protéines et d’ARN liés à ces régions génomiques. La liaison de molécules de liaison à l’ADN modifiées au génome peut affecter la structure de la chromatine, y compris le positionnement des nucléosomes, et peut abroger les fonctions génomiques, comme décrit dans les expériences d’interférence CRISPR21. Pour éviter ces effets aberrants potentiels, nous proposons des lignes directrices spécifiques pour le choix des régions génomiques cibles. Tout d’abord, pour éviter l’inhibition potentielle du recrutement des ARN polymérases et des facteurs de transcription, ainsi que la perturbation du positionnement des nucléosomes autour du site de début de transcription, les régions cibles pour les analyses des régions promotrices devraient être plusieurs centaines de paires de bases en amont de (5' à) le site de début de transcription. En revanche, lors de l’analyse de régions génomiques avec des limites distinctes, telles que les amplificateurs et les silencieux, les régions génomiques qui sont directement juxtaposées à ces régions peuvent être ciblées car il est moins probable que la liaison de molécules de liaison à l’ADN modifiées affecte leurs fonctions. De plus, il est préférable d’éviter d’utiliser des régions cibles qui sont conservées chez différentes espèces, car d’importantes molécules de liaison à l’ADN se lient souvent à des régions conservées au cours de l’évolution et l’inhibition de leur liaison peut perturber les fonctions des régions génomiques cibles. À cet égard, il est toujours nécessaire de vérifier que la fonction de la région génomique cible est maintenue dans les cellules établies utilisées pour les analyses enChIP. Étant donné que plusieurs ARNg peuvent être testés facilement et qu’il est fastidieux et coûteux de générer plusieurs versions de protéines TAL ou à doigts de zinc reconnaissant différentes régions génomiques cibles, l’enChIP utilisant CRISPR est plus avantageuse que l’enChIP utilisant d’autres protéines.
Il a été démontré que dCas9 se lie aux sites hors cible, bien que l’affinité avec ces sites puisse être plus faible que celle avec les sites cibles22-25. Il existe plusieurs façons de gérer la contamination des molécules liées à ces sites hors cible. Tout d’abord, l’utilisation de plusieurs, au moins deux, ARNg différents serait recommandée. Les molécules couramment observées dans l’enChIP à l’aide d’ARNg distincts seraient de véritables points positifs. Deuxièmement, la comparaison de différentes conditions pour l’enChIP serait efficace pour annuler la contamination des molécules non spécifiques et des molécules liées à des sites hors cible. Des exemples de ces ensembles de comparaison seraient (i) la stimulation (-) et (+), ou (ii) différents types de cellules tels que les cellules T et les cellules B. Enfin, une analyse quantitative de la liaison des molécules candidates doit être effectuée pour confirmer leur liaison spécifique aux sites cibles. Il est préférable de préparer des cellules exprimant uniquement dCas9 mais pas l’ARNg comme contrôle négatif.
À l’aide d’analyses enChIP, nous avons réussi à identifier un certain nombre de molécules connues et nouvelles interagissant avec des régions génomiques spécifiques (Tableaux 1-3)14-17. Cependant, cette technique n’a pas permis de détecter d’autres protéines connues interagissant avec ces régions. Par exemple, STAT1 s’associerait au promoteur IRF-1 lors de la stimulation de l’IFNγ8, mais notre analyse enChIP-SILAC n’a pas détecté STAT1 en tant que protéine induite à interagir avec cette région génomique16. De plus, dans l’analyse enChIP-MS des télomères, nous n’avons pas détecté les protéines shelterine composées de TRF-1 et TRF-215, dont il a été démontré qu’elles interagissent avec les télomères26. Il y a plusieurs raisons potentielles à ces écarts. Premièrement, la stœchiométrie de liaison de Stat1 au promoteur IRF-1 pourrait être très faible. Il est raisonnable que l’enChIP-MS, y compris l’enChIP-SILAC, détecte les protéines qui sont plus abondamment associées aux régions génomiques cibles ; Par conséquent, l’analyse d’un plus grand nombre de cellules pourrait être nécessaire pour détecter ces protéines. L’augmentation de la sensibilité des instruments MS contribuerait également à la détection efficace des protéines à faible liaison stœchiométrique. Deuxièmement, certaines protéines, y compris peut-être Stat1 et les shelterines, pourraient être des cibles difficiles pour les analyses MS. Troisièmement, dans notre analyse des protéines de liaison aux télomères15, les protéines 3×FLAG-TAL reconnaissant les télomères (3×FN-Tel-TAL) pourraient avoir bloqué la liaison des shelterines aux télomères de manière compétitive.
Contrairement à la difficulté relative de détecter les facteurs de transcription se liant à des régions génomiques spécifiques à l’aide d’enChIP, nous avons réussi à identifier des régulateurs épigénétiques tels que les enzymes de modification des histones à l’aide des analyses enChIP. Le succès de cette technique peut être dû au fait que les régulateurs épigénétiques se lient à un large éventail de régions génomiques ; par conséquent, il y a plus de protéines par région génomique disponibles pour la SEP. Étant donné que les régulateurs épigénétiques sont de plus en plus reconnus comme des cibles importantes pour les médicaments contre les maladies incurables telles que le cancer, l’enChIP serait un outil utile pour l’identification de cibles médicamenteuses épigénétiques.

L&#39;identification des molécules associées à des régions génomiques spécifiques d&#39;intérêt est nécessaire pour comprendre les mécanismes de régulation des fonctions génomiques telles que la transcription et la régulation épigénétique. Bien que plusieurs techniques ont été développées pour l&#39;analyse biochimique de régions génomiques spécifiques 1-7, ils ne sont pas largement utilisés à ce stade en raison de leurs problèmes intrinsèques telles que l&#39;application limitée (par exemple, seulement pour nombre élevé de copies loci ou loci avec des répétitions) et trop de temps et les efforts nécessaires. Afin d&#39;effectuer une analyse biochimique de régions génomiques spécifiques facilement, nous avons développé deux (Chip) technologies spécifiques locus chromatine immunoprécipitation, à savoir insertion puce (8-13) iChip et ingénierie liaison à l&#39;ADN puce molécule médiation (enChIP) 14-17 . Dans iChip, un locus d&#39;intérêt est marqué par l&#39;insertion des séquences de reconnaissance d&#39;une protéine de liaison d&#39;ADN exogène, tels que LexA. Le locus est ensuite isolé par purification d&#39;affinité en utilisant la protéine de liaison d&#39;ADN marqués. Dans enChIP, ingénierie des molécules de liaison à l&#39;ADN, telles que les protéines en doigt de zinc, protéines (TAL) transcription activateur-like, et en grappes répétitions palindromiques courts régulièrement espacées (CRISPR) complexes, sont utilisés pour marquer un lieu d&#39;intérêt (Figure 1). Par la suite, la région génomique est isolé par purification par affinité des molécules de liaison à l&#39;ADN marquées. L&#39;un des avantages de enChIP sur iChip est que l&#39;insertion de séquences de reconnaissance d&#39;une protéine liant l&#39;ADN exogène est pas nécessaire. Le ciblage des loci CRISPR utilisant des complexes constitués d&#39;une forme d&#39;activité catalytique de cas9 (dCas9) et un ARN de guidage (ARNg) est beaucoup plus facile que de cibler de ces régions par iChip ou enChIP utilisant des protéines Tal et à doigts de zinc. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour enChIP couplée à la spectrométrie de masse et séquençage de l&#39;ARN (ARN-Seq) pour identifier les locus associales protéines et les ARN Ted, respectivement.

<table><tbody><tr><td>Service de synthèse gBlock</td><td>Life Technologies</td><td>Synthèse de gènes par GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Service de synthèse gBlock</td><td>IDT (Integrated DNA Technologies)</td><td>gBlocks Fragments</td><td></td>de gènes</tr><tr><td>pSIR-neo</td><td>Addgene</td><td>51128</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-GFP</td><td>Addgene</td><td>51134</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-DsRed-Express2</td><td>Addgene</td><td>51135</td><td></td></tr><tr><td>pSIR-hCD2</td><td>Addgene</td><td>51143</td><td></td>Service</tr> de <tr><td>synthèse TAL</td> Life <td>Technologies</td><td>GeneArt Precision TALs</td><td></td></tr><tr><td>3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1</td><td>Addgene</td><td>47948</td><td></td></tr><tr><td>3&times ; FLAG-dCas9/pMXs-puro</td><td>Addgene</td><td>51240</td><td></td></tr><tr><td>3&times ; FLAG-dCas9/pMXs-IG</td><td>Addgene</td><td>51258</td><td></td></tr><tr><td>3&times ; FLAG-dCas9/pMXs-I2</td><td>Addgene</td><td>51259</td><td></td></tr><tr><td>3&times ; FLAG-dCas9/pMXs-neo</td><td>Addgene</td><td>51260</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG M2 Ab</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugué anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4049</td><td></td></tr><tr><td>Médium DMEM pour SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89985</td><td>D’autres supports peuvent être achetés auprès de Life Technologies</td></tr><tr><td>Dialysé FBS pour SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89986</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine-2HCl pour SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89987</td><td>Pour moyen léger</td></tr><tr><td>L-Arginine-HCl pour SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89989</td><td>Pour moyen léger</td></tr><tr><td>L-Lysine-2HCl, 13C6 Pour SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89988</td><td>Pour Moyen Lourd</td></tr><tr><td>L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 Pour SILAC</td><td>Life Technologies</td><td>89990</td><td>Pour Lourd</td></tr><tr><td>moyen Complet, mini, </td><td>Roche Diagnostics</td><td>4693159</td><td></td></tr><tr><td>Disrupteur à ultrasons UD-201</td> sans EDTA <td>Tomy Seiko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChIP DNA Clean & Concentrateur</td><td>Zymo Research</td><td>D5205</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads-Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>DB10004</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus Inhibiteur de RNase</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Isogen II</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Composant d’un système nanoLC-MS/MS pour l’analyse MS</td></tr><tr><td>nanoLC</td><td>Advance, Michrom Bioresources</td><td></td><td>Composant d’un système nanoLC-MS/MS pour l’analyse MS</td></tr><tr><td>Échantillonneur automatique HTC-PAL</td>, <td>CTC Analytics</td><td></td><td>Composant d’un système nanoLC-MS/MS pour l’analyse MS</td></tr></tbody></table>

isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enchip

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

L’identification de molécules associées à des régions génomiques spécifiques d’intérêt est nécessaire pour comprendre les mécanismes de régulation des fonctions de ces régions. Pour permettre l’identification non biaisée des molécules interagissant avec une région génomique d’intérêt spécifique, nous avons récemment développé la technique d’immunoprécipitation de la chromatine médiée par des molécules de liaison à l’ADN (enChIP). Nous décrivons ici comment utiliser enChIP pour isoler des régions génomiques spécifiques et identifier les protéines et les ARN associés. Tout d’abord, une région génomique d’intérêt est marquée à l’aide d’une protéine de type activateur de transcription (TAL) ou d’un complexe CRISPR (Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) composé d’une forme catalytiquement inactive de Cas9 et d’un ARN guide. Par la suite, la chromatine est réticulée et fragmentée par sonication. Le locus marqué est ensuite immunoprécipité et la réticulation est inversée. Enfin, les protéines ou les ARN associés à la chromatine isolée sont soumis à des analyses par spectrométrie de masse ou par séquençage de l’ARN, respectivement. Cette approche permet de réussir l’identification de protéines et d’ARN associés à une région génomique d’intérêt.

Dans l&#39;ensemble, 30.1% des régions génomiques cibles peut être purifié en utilisant enChIP. La figure 3 comprend des données représentatives montrant les rendements en enChIP analyses ciblage télomères et le promoteur de l&#39;interféron (IFN) de régulation facteur-1 (IRF-1) gène. Comme exemples de résultats typiques, tableau 1 énumère les protéines associées avec le promoteur IRF-1 d&#39;une manière IFNy spécifique identifié par enChIP-SILAC, tableau 2 énumère les protéines télomères contraignant identifiés par enChIP couplée à la spectrométrie de masse (enChIP-MS) et Tableau 3 énumère les ARN associés aux télomères identifiés par enChIP-ARN-Seq. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de enChIP. enChIP utilisant CRISPR (A, B) et TAL (C, D, E </strong&gt;) est montré. Un locus d&#39;intérêt est étiqueté avec des molécules de liaison à l&#39;ADN d&#39;ingénierie comme une protéine TAL ou le système de CRISPR constitué d&#39;une forme d&#39;activité catalytique de cas9 (DCA) et le guide de l&#39;ARN (ARNg). Les interactions moléculaires sont fixées avec du formaldehyde ou d&#39;autres agents de reticulation, si nécessaire. Par la suite, la chromatine fixe est fragmenté par sonication ou digestion enzymatique. Les régions génomiques marqués sont purifiés par purification par affinité. Enfin, la réticulation est inversée, et des molécules interagissant (régions génomiques, ARN, protéines) et sont identifiés en utilisant le séquençage de prochaine génération et de spectrométrie de masse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53478/53478fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig2.jpg" /> Figure 2. Séquence de gBlock. Le promoteur U6 (en noir), le nucléotide G bvant la séquence de guidage (en bleu), la séquence de guidage (ARNg d&#39;espacement) (en rouge), la séquence d&#39;échafaudage (en vert), et la séquence de terminateur (en orange) sont présentées. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53478/53478fig3.jpg" /> Figure 3. Les rendements des analyses enChIP représentant. Entrées (A) Pourcentage de la cible IRF-1 locus et le locus de Sox2 non-cible. Entrées (B) de pourcentage pour les télomères de cibles et non cibles y-satellites. Les chiffres ont été adaptés et modifiés à partir de publications antérieures 15,16. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Catégories </td><td> Protéines </td></tr><tr><td> Transcription </td><td> DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homologue, PURβ, activé ARN polymérase II activateur transcriptionnel p15, BTF3, Myb contraignantprotéines 1A </td></tr><tr><td> Désacétylation des histones, les composants de co-répresseur </td><td> RBBP4, PA2G4, TBL3 </td></tr><tr><td> Acetyltransferase </td><td> La protéine arginine méthyltransférase N-1 </td></tr><tr><td> ADN topoisomérase </td><td> ADN topoisomérase 2α </td></tr><tr><td> Histones </td><td> Histone H2A.Z, l&#39;histone H3.2 </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Des exemples de protéines associées à l&#39;IRF-1 région du promoteur humain de manière IFNy spécifique identifié par enChIP-SILAC Le tableau a été adapté à partir d&#39;une publication précédente 16. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Catégories </td><td> Protéines </td></tr><tr><td> Protéines télomères contraignant mammifères </td><td> PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 </td></tr><tr><td> Télomères bi-Nding protéines dans la levure ou d&#39;autres organismes </td><td> IMP4 </td></tr><tr><td> Protéines interagissant avec des télomères contraignant protéines [protéines télomères contraignant associé] </td><td> ADN-polymérase α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-POT1], Exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], Exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] </td></tr><tr><td> Protéines de localisation à l&#39;hétérochromatine </td><td> BEND3 </td></tr><tr><td> Les protéines de régulation marques épigénétiques </td><td> KDM5C </td></tr><tr><td> Protéines dont les mutations affectent la fonction des télomères </td><td> Α ADN polymérase (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, Prdx1, TYSY, glutamate-cystéine ligase, la glutarédoxine, SMRC1 </td></tr></tbody></table> Tableau 2:. Des exemples de protéines associées aux télomères de souris identifiées par enChIP-MS Le tableau a été ADAPTEd &#39;une publication précédente 15. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Catégories </td><td> ARN </td></tr><tr><td> Composants de télomérase </td><td> Terc, RMRP </td></tr><tr><td> Télomérique ARN </td><td> Terras </td></tr><tr><td> scaRNAs </td><td> Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 </td></tr><tr><td> H / ACA snoRNAs </td><td> Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a </td></tr><tr><td> C / D snoRNAs </td><td> Snord17, Snord15a, Snord118 </td></tr><tr><td> lncRNA </td><td> Neat1 </td></tr></tbody></table> Tableau 3: Exemples d&#39;ARN associés aux télomères de souris identifiées par enChIP-ARN-Seq Le tableau a été adapté à partir d&#39;une publication précédente 17..

L’identification de molécules associées à des régions génomiques spécifiques d’intérêt est nécessaire pour comprendre les mécanismes de régulation des fonctions de ces régions. Ce protocole décrit les procédures d’imunopréciprécipitation de la chromatine médiée par des molécules de liaison à l’ADN (enChIP) pour l’identification de protéines et d’ARN associés à une région génomique spécifique.

Isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler une région génomique spécifique tout en préservant les interactions moléculaires, afin d'identifier les molécules interagissant avec cette région génomique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine des fonctions génomiques, telles que la transcription et la régulation épigénétique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'identification directe des molécules interagissant avec une région génomique spécifique.Le déroulement de la procédure sera présenté par Toshitsugu Fujita, professeur adjoint de mon laboratoire. Conformément au protocole écrit, concevez les molécules d'interaction avec l'ADN d'intérêt. Cela implique la génération de la séquence gBlock d'intérêt et son insertion dans un rétrovirus, par exemple, afin de produire l'ARN guide associé à trois FLAG-dCas9.Alternativement, trois protéines FLAG-TAL reconnaissant la séquence cible peuvent être produites. Ensuite, selon le protocole indiqué, infecter les cellules avec le rétrovirus préparé. Confirmer l'expression des molécules d'attachement à l'ADN modifiées et établir la lignée cellulaire.Maintenant, procédez au réticulation des cellules à l’aide de formaldéhyde. Suspendez 20 millions de cellules transfectées dans 30 millilitres de milieu de culture ordinaire et ajoutez 810 microlitres de formaldéhyde à 37 % pour obtenir une concentration finale de 1 %. Incubez le mélange pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes, arrêtez la réaction de réticulation en ajoutant 3,1 millilitres de glycine à 1,25 molaire.Laisser les cellules reposer à température ambiante pendant 10 minutes avant de poursuivre. Ensuite, centrifuger le tube de cellules à 300 G pendant cinq minutes dans une centrifugeuse réfrigérée. Éliminer soigneusement le surnageant et laver le culot cellulaire dans 30 millilitres de PBS par agitation et centrifugation.Effectuez deux lavages au PBS. Si nécessaire, le culot de cellules fixées peut être conservé à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, récupérez la chromatine à partir des cellules.Les suspendre dans 10 millilitres de tampon de lyse et les incuber sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée, recueillir les cellules et éliminer soigneusement le surnageant. Puis, suspendre le culot cellulaire dans du tampon de lyse nucléaire et incuber sur de la glace pendant 10 minutes.Toutes les quelques minutes pendant l'incubation, vortexez brièvement le mélange. Rassemblez à nouveau les cellules par centrifugation. Lavez ensuite le culot avec 10 millilitres de PBS et éliminez la solution de lavage par une autre centrifugation.Cela produit la fraction de chromatine et, si désiré, peut être congelée rapidement et stockée à moins 80 degrés Celsius. Poursuivre en suspendant le culot de chromatine dans 800 microlitres de tampon de lyse modifié trois, puis transférer la suspension dans un petit tube de 1,5 millilitre. Ensuite, activer une sonde de sonication au niveau trois de puissance avec un cycle continu.Pour fragmenter la chromatine, alterner manuellement entre 10 secondes de sonication et 20 secondes sur glace. À chaque cinquième ou sixième cycle, prolonger la phase sur glace à deux minutes afin d'éviter toute surchauffe de l'échantillon. Répéter ce cycle de sonication de 10 à 18 fois, en maintenant l'extrémité de la sonde éloignée du fond du tube pour éviter la formation d'écume dans l'échantillon.Après la sonication, recueillir l'échantillon par une courte centrifugation réfrigérée. Ensuite, transférer le surnageant contenant la chromatine fragmentée dans un nouveau tube et éliminer le culot. Consulter le protocole écrit pour savoir comment évaluer la fragmentation.Pour préparer l'immunoprécipitation, commencez par conjuguer les anticorps aux billes Dynabeads. Cette immunoprécipitation est adaptée à des échantillons provenant de 20 millions de cellules. Ajoutez un volume équivalent au tiers du volume initial de tampon de lyse modifié trois contenant Triton X-100 afin d'obtenir une concentration finale de 1 % de Triton.Ensuite, ajoutez le mélange aux billes magnétiques conjuguées à l'IgG de souris normale. Incubez la réaction pendant une heure sur un agitateur rotatif réfrigéré. Par la suite, fixez les billes à partir de la solution pendant trois minutes sur un support magnétique.Ensuite, recueillir le surnageant. Transférer le surnageant dans l'tube contenant les billes magnétiques conjuguées à des anticorps anti-FLAG. Incuber cette réaction de conjugaison toute la nuit sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius.Le lendemain matin, appliquez un aimant sur le tube pendant trois minutes afin de récupérer les billes. Ensuite, aspirez le surnageant à l’aide d’une pipette et jetez-le. Lavez maintenant les billes.Les suspendre dans un millilitre de tampon à faible concentration saline et les incuber pendant cinq minutes sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, isoler les billes par aimantation et éliminer le surnageant. Répéter cette étape de lavage une fois supplémentaire avec le tampon à faible concentration saline.À l’aide de la même technique, effectuez deux autres lavages en utilisant le tampon à haute teneur en sel. Poursuivez en utilisant la méthode pour laver les billes deux fois dans le tampon au chlorure de lithium. Enfin, lavez les billes une seule fois avec du TBS-IGEPAL CA-630.Après les sept étapes de lavage, suspendre les billes dans 200 microlitres de tampon d'élution et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, attirer les billes par aimantation et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Répéter cette étape d'élution afin d'augmenter les rendements.Ensuite, purifiez environ 5 % de l'ADN pour estimer le rendement. Commencez par mélanger la majeure partie de l'éluat dans une réaction de précipitation. Précipitez la chromatine pendant toute la nuit à moins 20 degrés Celsius.Le lendemain, centrifuger l'échantillon et éliminer le surnageant. Rincer le culot avec un millilitre d'éthanol à 70 % et répéter la centrifugation pendant 10 minutes. Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 40 microlitres de tampon d'échantillonnage 2x.Maintenant, vortexer la suspension pendant cinq minutes complètes. Incuber ensuite à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes pour dénaturer et inverser les réticulations. Après l'ébullition, appliquer 40 microlitres de l'échantillon sur un gel SDS-PAGE.On utilise généralement un gradient allant de quatre à 20 %. Faites migrer le gel jusqu'à ce que le colorant descende à un centimètre sous le puits. Ensuite, colorez le gel et découpez-le en cinq morceaux d'environ 2 millimètres de long.Effectuez la dilution de la protéine à partir des morceaux de gel et utilisez-la pour l'analyse par spectrométrie de masse. La purification de l'ARN, suivie de l'analyse par séquençage, est décrite dans le protocole écrit. Dans l'ensemble, jusqu'à 10 % des régions génomiques ciblées peuvent être purifiées à l'aide de l'enChIP.On observe ici les rendements des analyses ciblant la région promotrice du gène IRF-1 par rapport au locus non spécifique Sox2. Un autre exemple est le ciblage des télomères par rapport au locus satellite gamma non spécifique. L'analyse enChIP SILAC a identifié plusieurs protéines associées au promoteur d'IRF-1 de manière spécifique à l'interféron gamma.Des protéines liant les télomères ont également été identifiées par enChIP combiné à la spectrométrie de masse. Le séquençage ARN d'enChIP a ensuite été utilisé pour identifier les ARN associés aux télomères. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la transcription et de la régulation épigénétique pour explorer ces mécanismes dans divers systèmes biologiques.

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