Isolement des régions génomiques spécifiques et l'identification des molécules associées par enChIP

L’objectif global de cette procédure est d’isoler une région génomique spécifique en conservant les interactions moléculaires pour l’identification des molécules interagissant avec la région génomique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans les domaines des fonctions génomiques telles que la transcription et la régulation épigénétique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier directement les molécules qui interagissent avec une région génomique spécifique.

La démonstration de la procédure sera faite par Toshitsugu Fujita, professeur adjoint de mon laboratoire. En suivant le protocole de texte, concevez les molécules de liaison à l’ADN d’intérêt. Il s’agit de générer la séquence d’intérêt gBlock et de l’insérer dans un rétrovirus, par exemple pour produire l’ARN guide complexé avec trois FLAG-dCas9.

Alternativement, trois protéines FLAG-TAL reconnaissant la séquence cible peuvent être générées. Ensuite, en suivant le protocole texte, infectez les cellules avec le rétrovirus préparé. Confirmez l’expression des molécules de liaison à l’ADN modifiées et établissez la lignée cellulaire.

Maintenant, procédez en réticulant les cellules avec du formaldéhyde. Suspendre 20 millions de cellules transfectées dans 30 millilitres de milieu de culture régulier et ajouter 810 microlitres de formaldéhyde à 37 % pour une concentration finale de 1 %. Incuber le mélange pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après cinq minutes, tuez la réaction de réticulation en ajoutant 3,1 millilitres de glycine à 1,25 molaire.

Laissez les cellules reposer à température ambiante pendant 10 minutes avant de continuer. Ensuite, centrifugez le tube cellulaire à 300 G pendant cinq minutes dans une centrifugeuse réfrigérée. Jetez soigneusement le surnageant et lavez la pastille cellulaire dans 30 millilitres de PBS par mélange et centrifugation.

Effectuez deux lavages PBS. Si nécessaire, la pastille lavée des cellules fixes peut être stockée à moins 80 degrés Celsius. En continuant, collectez la chromatine des cellules.

Suspendez-les dans 10 millilitres de tampon de lyse et incubez-les sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée, collectez les cellules et jetez soigneusement le surnageant. Maintenant, suspendez la pastille cellulaire dans un tampon de lyse nucléaire et incubez-la sur de la glace pendant 10 minutes.

Toutes les quelques minutes pendant l’incubation, faites brièvement tourbillonner le mélange. Encore une fois, collectez les cellules par centrifugation. Maintenant, lavez le granulé avec 10 millilitres de PBS et retirez la solution de lavage avec une autre centrifugation.

Celle-ci produit la fraction chromatinienne et, si vous le souhaitez, peut être congelée et stockée à moins 80 degrés Celsius. Procédez en suspendant la pastille de chromatine dans 800 microlitres de tampon de lyse modifié trois et transférez la suspension dans un tube plus petit de 1,5 millilitre. Maintenant, mettez sous tension une sonique de niveau trois avec un service continu.

Pour fragmenter la chromatine, effectuez manuellement un cycle entre 10 secondes de sonication et 20 secondes sur glace. Tous les 5 ou 6 cycles, prolongez la phase de glace à deux minutes afin que l’échantillon ne surchauffe pas. Effectuez ce cycle de sonication 10 à 18 fois, en gardant l’extrémité de la sonde hors du fond du tube pour éviter de faire mousser l’échantillon.

Après la sonication, prélever l’échantillon avec une centrifugation réfrigérée rapide. Ensuite, transférez le surnageant contenant la chromatine fragmentée dans un nouveau tube et jetez la pastille. Voir le protocole texte sur la façon d’évaluer la fragmentation.

Pour se préparer à l’immunoprécipitation, conjuguez d’abord les anticorps aux Dynabeads. Cette immunoprécipitation est mise à l’échelle à partir d’échantillons dérivés de 20 millions de cellules. Ajoutez un volume de 1/5 de tampon de lyse modifié trois avec Triton X-100 à la chromatine fragmentée pour obtenir une concentration finale de 1 % de Triton.

Ensuite, ajoutez le mélange aux billes magnétiques conjuguées aux IgG de souris normales. Incuber la réaction pendant une heure sur un rotateur avec réfrigération. Plus tard, tirez les billes de la solution pendant trois minutes sur un support magnétique.

Ensuite, récupérez le surnageant. Transférez le surnageant dans le tube de billes magnétiques conjuguées à des anticorps anti-FLAG. Exécutez cette réaction de conjugaison pendant la nuit sur un rotateur à quatre degrés Celsius.

Le lendemain matin, appliquez un aimant sur le tube pendant trois minutes pour recueillir les billes. Ensuite, pipetez le surnageant et jetez-le. Maintenant, lavez les perles.

Suspendez-les dans un millilitre de tampon à faible teneur en sel et incubez-les pendant cinq minutes sur un rotateur à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, isolez l’aimantation des billes et jetez le surnageant. Répétez cette étape de lavage avec un tampon à faible teneur en sel une fois de plus.

En utilisant la même technique, effectuez deux autres lavages à l’aide d’un tampon à haute teneur en sel. Continuez à utiliser la méthode pour laver deux fois les billes dans un tampon de chlorure de lithium. Enfin, lavez une seule fois les perles avec TBS-IGEPAL CA-630.

Après les sept étapes de lavage, suspendez les billes dans 200 microlitres de tampon d’élution et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, attirez les billes par magnétisation et rassemblez le surnageant dans un nouveau tube. Répétez cette étape d’élution pour augmenter les rendements.

Ensuite, purifiez environ 5 % de l’ADN pour estimer le rendement. Commencez par mélanger la majeure partie de l’éluat dans une réaction de précipitation. Faites précipiter la chromatine pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius.

Le lendemain, centrifugez l’échantillon et jetez le surnageant. Rincez le granulé avec un millilitre d’éthanol à 70 % et répétez la centrifugation pendant 10 minutes. Ensuite, jetez le surnageant et suspendez la pastille dans 40 microlitres de tampon d’échantillon 2x.

Maintenant, faites tourbillonner la suspension pendant cinq minutes complètes. Ensuite, incubez-le à 100 degrés Celsius pendant 30 minutes pour le dénaturer et inverser la réticulation. Après l’ébullition, faites couler 40 microlitres de l’échantillon sur un gel SDS-PAGE.

Habituellement, un gradient de quatre à 20 % est utilisé. Passez le gel jusqu’à ce que le colorant se déplace à un centimètre sous le puits. Ensuite, colorez le gel et coupez-le en cinq morceaux d’environ 2 millimètres de long.

Diluez la protéine des morceaux de gel et utilisez-la pour l’analyse des spécifications de masse. La purification de l’ARN, suivie d’une analyse de séquençage, sont couvertes dans le protocole de texte. Dans l’ensemble, jusqu’à 10 % des régions génomiques cibles peuvent être purifiées à l’aide de l’enChIP.

On voit ici les résultats d’analyses ciblant la région promotrice du gène IRF-1 par rapport au locus non spécifique de Sox2. Un autre exemple est le ciblage des télomères par rapport au locus gamma-satellite non spécifique. enChIP SILAC a identifié plusieurs protéines associées au promoteur IRF-1 d’une manière spécifique à l’interféron gamma.

Les protéines de liaison aux télomères ont également été identifiées par enChIP combinée à la spectrométrie de masse. Le séquençage de l’ARN enChIP a ensuite été utilisé pour identifier les ARN associés aux télomères. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la transcription et de la régulation épigénétique pour explorer de tels mécanismes dans divers systèmes biologiques.