Name: Une approche semi-automatique pour la préparation des anticorps Cocktails pour immunophénotypique Analyse de sang périphérique humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Apprenez une méthode semi-automatisée pour préparer des cocktails d'anticorps destinés à l'immunophénotypage du sang périphérique humain. Cette technique améliore la précision de la pipette et réduit les erreurs de préparation manuelle.

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Nous remercions Hannah Puzas pour son aide à la conception et à la configuration du système, et Kevin Khovananth pour ses conseils techniques. Le financement de ce travail a été fourni par les Fondations Hearst et la Fondation médicale Providence Portland.

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YK, ILG, TLM, WLM, DPH, et KSB: Aucun intérêts financiers concurrents. ANT est un employé de Beckman Coulter, Inc. publication de cet article vidéo est sponsorisée par Beckman Coulter, Inc.

Immunophénotypage du sang périphérique est d&#39;une importance cruciale pour gagner un aperçu des réponses individuelles à l&#39;immunothérapie. Le défi réside dans la normalisation d&#39;épreuves pour contrôler expérience à expérience variabilité 1,14. Une source principale de la variabilité réside dans la manipulation humaine des échantillons. Par conséquent, il est concevable que l&#39;automatisation partielle ou totale du traitement de l&#39;échantillon de faciliter une réduction spectaculaire dans l&#39;expérience à 1,14 variabilité expérience. Dans ce protocole, nous rapportons notre effort réussi à minimiser la variabilité essai en introduisant un manipulateur de liquide automatisé équipé 2D lecteur de code à barres pour l&#39;échantillon coloration dans immunophénotypage de sang total. Dans la conception, notre méthode est polyvalent et peut surveiller d&#39;autres sous-ensembles immunitaires en ajoutant supplémentaires &quot;Cocktails base&quot; pour les définir. De tels sous-ensembles comprennent des cellules T auxiliaires, des cellules T régulatrices, les cellules B, les cellules NK, les cellules dendritiques et les monocytes (manuscrit enpréparation) 18. Nous avons adapté panneaux anticorps recommandées par le consortium en introduisant des marqueurs supplémentaires 1. populations cellulaires ont été identifiés à l&#39;aide &quot;Cocktail de base&quot; conjugué à fluorochromes avec une émission minimale dans la violette brillant 421 (BV421), la phycoérythrine (PE), et l&#39;allophycocyanine (APC) détecteurs, car nous voulions réserver ces canaux pour la détection d&#39;antigènes inductibles. Cette caractéristique assure non seulement la sensibilité la plus élevée pour surveiller l&#39;état d&#39;activation des cellules immunitaires, mais permet également le logement souple des nouveaux marqueurs d&#39;activation étant donné que ces trois fluorochromes sont le plus souvent conjugués avec des anticorps contre des marqueurs inductibles. Par conséquent, notre procédé est non seulement approprié pour la préparation de cocktail pour l&#39;immunophénotypage de sang entier, mais est également utile pour la coloration d&#39;autres échantillons y compris les cellules et les cellules mononucléaires du sang périphérique à partir de tissus récupérés ventilées (par exemple, une tumeur). introduction réussieproduction de notre méthode nécessite une attention particulière aux étapes dans la préparation de matériel de laboratoire, et de la programmation et de l&#39;exécution de la méthode. Préparation des tubes de codes à barres 2D comprend l&#39;étiquetage avec des étiquettes lisibles et le transfert des anticorps aux tubes désignés. Pour éviter l&#39;introduction d&#39;erreurs, nous vous recommandons de le faire avec deux personnes. Chaque fois que la modification des feuilles de calcul, les enquêteurs doivent vérifier si la méthode fonctionne correctement. Le choix des méthodes de pipetage appropriées au cours de la programmation assure un transfert de liquide succès. LLS permet pipetage sans obtenir débris précipité du fond de tubes d&#39;anticorps, pour lesquels nous utilisons soit P50 ou P200 pointes conductrices. LLS peuvent ne pas être une bonne option pour obtenir des conseils de P1000 comme LLS est plus sensible aux pointes de P1000 et parfois déclenché faussement par la présence de bulles. Heights dans la définition de matériel de laboratoire doivent être ajustés pour chaque instrument de transfert de liquide comme sous-optimale pourrait se produire, par exemple, s&#39;il n&#39;y a pas assez d&#39;espace entre le bord de conseilset le fond de tubes. Comme le montre la Figure 12, si le «cocktail de base&quot; et / ou &quot;cocktail d&#39;activation&quot; ne sont pas bien au vortex, il peut en résulter une coloration optimale. Nous avons pensé à l&#39;aide de réactifs lyophilisés pour la coloration de la cellule comme une approche alternative pour réduire la variabilité liée avec le réactif de distribution 19. Cependant, les conjugués de polymère de colorants violets brillants sont connus pour interagir les uns avec les autres signaux non spécifiques provoquant. En tant que tel, en ajoutant plus de deux conjugués polymères (par exemple, BV421 et BV650 etc.) dans les réactifs lyophilisés peuvent provoquer la signalisation non spécifique (par exemple, augmentation du signal de BV650 de fond dans BV421 + population) 20. En outre, les réactifs lyophilisés manquent de souplesse pour inclure une nouvelle coloration. Ils sont généralement plus coûteux et nécessitent une commande groupée. Pour ces raisons, nous avons choisi d&#39;utiliser le gestionnaire de liquide automatisé équipé avec les tubes de codes à barres 2D. Bien qu&#39;il tflocons de temps pour mettre en place et implique un investissement initial d&#39;acheter l&#39;instrument, dans le long terme, ces facteurs seront compensées par l&#39;augmentation de la productivité et la reproductibilité des tests. En fait, quelques groupes précédemment rapporté l&#39;intégration réussie du gestionnaire de liquide automatisé dans leur flux de travail d&#39;immunophénotypage ou applications similaires 21,22. solutions automatisées pour l&#39;analyse de cytométrie en flux sont également disponibles auprès de sources commerciales (FACS SPA III, Cocktail Préparation automatique de postes de travail, et FlowStainer). Cela indique en outre il y a un grand besoin pour la préparation de cocktail automatisé pour immunophénotypage. Après la maîtrise de cette technique, nous envisageons que le développement de l&#39;immunophénotypage entièrement automatisé de sang total permettra de réduire davantage la variabilité expérience à l&#39;expérience et pourrait faire immunophénotypage de sang total possible même dans un cadre 23 étude clinique multicentrique. Nous avons déjà commencé à utiliser une lyse étaith assistant pour automatiser la lyse et des étapes de lavage. Nous envisageons également que la détermination automatique de la quantité d&#39;anticorps dans les tubes de codes à barres 2D et le suivi de réactif distribution permettra d&#39;améliorer grandement l&#39;inventaire d&#39;anticorps et le contrôle de qualité sur notre méthode, respectivement.

Immunophénotypage de sang périphérique humain détermine changements quantitatifs et qualitatifs dans des sous-ensembles de cellules immunitaires 1. Il permet de mieux comprendre les mécanismes d&#39;action et de résistance, aides découverte de biomarqueurs prédictifs, et facilite le développement d&#39;immunothérapies combinés. Par conséquent, la validation et la normalisation des immunophénotypage est une zone de grand intérêt pour les chercheurs universitaires, des laboratoires cliniques, et les industries. Bien immunophénotypage du sang périphérique par des méthodes de cytométrie en flux est actuellement utilisé pour la gestion clinique des hémopathies malignes 2,3 et le virus de l&#39;immunodéficience humaine (VIH) 4,5, immunophénotypage fiable de sang périphérique pour les demandes d&#39;immunothérapie des considérations spécifiques à la validation et la normalisation, car il exige une couverture plus étendue sur des sous-ensembles de cellules immunitaires et l&#39;activation / récepteurs inhibiteurs 1,6-8. succeimmunophénotypage ssful nécessite normalisation soin de minimiser la variabilité expérience à l&#39;expérience liée à la configuration de l&#39;instrument et la coloration des cellules procédure 9,10. Si la normalisation des paramètres de l&#39;appareil pour la cytométrie en flux est bien établie pour traiter l&#39;ancienne préoccupation 9,11,12, on ne sait pas comment minimiser la variabilité liée à la coloration des cellules, sans restreindre la couverture de sous-ensembles de cellules immunitaires et de leur état ​​d&#39;activation. Comme le nombre d&#39;antigènes à détecter augmente, il en va de la possibilité d&#39;erreur et la variabilité en raison des sous-optimale distribution de réactif et la contamination croisée. Méthodes d&#39;analyse phenoptypic de sang total anticoagulé ont été établis à la fin des années 1980 pour une utilisation dans des essais de laboratoire clinique. Ces mêmes méthodes servent les besoins du laboratoire de recherche pour la préparation des échantillons. Surtout, les cocktails d&#39;anticorps utilisés dans les laboratoires cliniques sont généralement moins complexe et avapré-titré ilable et pré-mélangée chez le fabricant. Un seul transfert du cocktail d&#39;anticorps pré-mélangé est nécessaire. Dans le cadre de la recherche, des cocktails d&#39;anticorps de 10-16 anticorps sont typiques. Chaque cocktail doit être validée pour la stabilité par le laboratoire ou fraîchement préparé avant chaque essai. Préparer plusieurs cocktails d&#39;anticorps pour un échantillon pourrait entraîner le pipetage de 50-80 anticorps individuels, une tâche qui est à la fois fastidieux et source d&#39;erreurs. L&#39;automatisation de la préparation du cocktail a plusieurs avantages par rapport à la préparation manuelle des cocktails tels que le moins d&#39;erreurs, une plus grande précision de pipetage, et peut-être même diminué le gaspillage réactif. Nous rapportons ici l&#39;introduction réussie d&#39;un manipulateur de liquide automatisé équipé d&#39;un à deux dimensions (2D) lecteur de code barre dans le processus cellulaire coloration des immunophénotypage pour minimiser la variabilité liée à la préparation des échantillons.

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cytomètre en flux</td></tr><tr><td>NXp Span-8 Station de travail d’automatisation de laboratoire&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31839</td><td>Poste de travail d’automatisation de laboratoire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Insert, Tube, 11 mm, Blanc, pour Tubes Microfuge de 1,5 ml (caisse de 25)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>373696 Accessoire pour Rack de Tubes à 24 Positions pour accueillir des Tubes Microfuge.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit LLS</td><td>Beckman Coulter</td><td>719262</td><td>Fixez le bas du pont dans le poste de travail d’automatisation de laboratoire pour permettre la détection de niveau de liquide</td></tr><tr><td>Rack de tubes à 24 positions</td><td>Beckman Coulter</td><td>373661</td><td>Rack de tubes pour contenir des tubes microfuge pour cocktails d’anticorps ou de sang</td></tr><tr><td>SACS D’AUTOCLAVE POUR RISQUES BIOLOGIQUES 12 x 24 POUCES RED</td><td>LabMart</td><td>M111416</td><td>Sacs d’autoclave jetables pour le poste de travail</td></tr> <tr><td>d’automatisation de laboratoireVisionMate Lecteur de codes-barres 2D haute vitesse</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1850</td><td>Lecteur de codes-barres 2D</td></tr><tr><td>8 canaux Boucheuse/décapeuse/décapeuse à vis portable</td><td>Thermo Scientific</td><td>4105MAT</td><td>Pour le débouchage et le bouchage des tubes de codes-barres 2D.</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-335</td><td>Pour la préparation de cocktails ou l’approvisionnement en échantillons de sang du poste de travail d’automatisation de laboratoire</td></tr><tr><td>CoolRack XT CFT24</td><td>biocision</td><td>BCS-534</td><td>Pour contenir des tubes d’échantillons.</td></tr><tr><td>Tubes ambrés Matrix ScrewTop de 1,0 ml dans des racks à loquet</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741AMB</td><td>Tubes à code-barres 2D pour stocker des anticorps fluorescents conjugués à un colorant</td></tr><tr><td>Biomek Span-8 P1000 Tips, conducteurs, pré-stériles avec barrière, 1 025 & micro ; l</td><td>Beckman Coulter</td><td>987925</td><td>conseils pour le poste de travail d’automatisation de laboratoire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Embouts Biomek Span-8 P50, conducteurs, pré-stériles avec barrière, 50 & micro ; l (Caisse de 10 racks)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B01091</td><td>Conseils pour poste de travail d’automatisation de laboratoire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pointes Biomek Span-8 P250, conductrices, pré-stériles avec barrière (caisse de 10 racks)</td><td>Beckman Coulter</td><td>394627</td><td>pointes pour poste de travail d’automatisation de laboratoire&nbsp ;</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution 10x Concentré</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Lyse RBC</td></tr><tr><td>Falcon Tubes en polystyrène à fond rond</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-5</td><td>Tubes d’échantillons</td></tr><tr><td>Anti-CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td>Effecteur Panneau de cellules T (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD3 Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0038-42</td><td>Effecteur Panneau de cellules T (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD4 PerCPCy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>341654</td><td>Panneau de cellules T effecteur (base)Panneau de cellules T</td></tr> <tr>effectrices <td>564156</td> <td>anti-TCRgd BV650</td><td>BD Biosciences</td> (<td>base)Panneau de cellules T effectrices (base)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Anti-560179 CCRabs</td> BV786 BD Biosciences 563825 Panneau de cellules T effectrices (base)<td>Panneau de cellules T effectrices</td></tr> (<tr><td></td><td></td><td></td><td>base)</td></tr><tr><td>Anti-CCR7 PE-CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562381</td><td>Panneau de cellules T effectrices (base)</td></tr><tr><td>Anti-CD45RA PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337167</td><td>Panneau de cellules T effectrices (base)</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562804</td><td>Panneau de cellules T effectrices (activation)</td></tr><tr><td>Anti-CD278(ICOS) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557802</td><td>Panneau de cellules T effectrices (activation)</td></tr><tr><td>Anti-CD38 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340439</td><td>Panneau de cellules T effecteur (activation)</td></tr><tr><td>Anti-CD279(PD1) BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562516</td><td>Panneau de cellules T effecteur (activation)</td></tr><tr><td>Anti-CD357(GITR) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5875-42</td><td>Panneau de cellules T effectrices (activation)</td></tr><tr><td>Anti-CD137(41BB) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>550890</td><td>Panneau de cellules T effectrices (activation)</td></tr><tr><td>Anti-CD69 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562884</td><td>Panneau de cellules T effecteur (activation)</td></tr><tr><td>Anti-CD314(NKG2D) PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557940</td><td>Panneau de cellules T effecteur (activation)</td></tr><tr><td>Anti-CD134(OX40) APC</td><td>BioLegend</td><td>350008</td><td>Panneau de cellules T effectrices (activation)</td></tr><tr><td>Tubes de prélèvement de sang en plastique BD Vacutainer avec héparine de sodium : Bouchon conventionnel</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-689-6</td><td>Pour la collecte de sang</td></tr><tr><td>Albumine, sérum bovin, fraction V, RIA et ELISA EMD</td><td>Millipore</td><td>126593</td><td>Pour tampon de lavage à flux</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td>Pour tampon de lavage à flux</td></tr><tr><td>Héparine, sel de sodium</td><td>Affimetrix</td><td>16920</td><td>Pour tampon de lavage à flux</td></tr><tr><td>Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS), 1x, avec calcium, magnésium, sans rouge de phénol</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30588.02</td><td>Pour tampon de lavage par écoulement</td></tr></tbody></table>

une approche semi-automatique pour la préparation des anticorps cocktails pour immunophénotypique analyse de sang périphérique humain

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophénotypage de sang périphérique par cytométrie de flux détermine des changements dans la fréquence et l&#39;activation des leucocytes périphériques état pendant la maladie et le traitement. Il a le potentiel de prédire l&#39;efficacité thérapeutique et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Toute coloration du sang utilise sang non manipulée, ce qui minimise les artefacts qui peuvent se produire lors de la préparation de l&#39;échantillon. Cependant, la coloration du sang total doit également être effectuée sur le sang fraîchement prélevé afin d&#39;assurer l&#39;intégrité de l&#39;échantillon. En outre, il est préférable de préparer des cocktails d&#39;anticorps sur le même jour pour éviter l&#39;instabilité potentielle de TanDEM-colorants et d&#39;empêcher l&#39;interaction de réactif entre les colorants violets brillants. Par conséquent, la coloration de sang total nécessite normalisation soin de contrôler la variabilité intra et inter-expérimentale. Ici, nous rapportons le déploiement d&#39;un manipulateur de liquide automatisé équipé d&#39;un à deux dimensions (2D) lecteur de codes barres dans un processus standard de fabrication Antibodcocktails y pour la cytométrie de flux. Des anticorps ont été transférés dans des tubes à code-barres 2D disposés dans un format à 96 puits et leur contenu compilées dans une base de données. Le manipulateur de liquide pourrait alors localiser les flacons d&#39;anticorps source en faisant référence à des noms d&#39;anticorps au sein de la base de données. Notre méthode éliminé coordination fastidieuse pour le positionnement des tubes d&#39;anticorps source. Il a fourni une polyvalence permettant à l&#39;utilisateur de changer facilement un certain nombre de détails dans le processus de distribution d&#39;anticorps comme un anticorps spécifique à utiliser, le volume et la destination en modifiant la base de données sans avoir à réécrire le script de la méthode logicielle pour chaque test. Une preuve de concept expérience réalisée exceptionnelle précision de dosage inter et intra, démontrée par la préparation d&#39;une réplique 11 couleurs, l&#39;écoulement de 17 anticorps essai de cytométrie. Ces méthodes ont augmenté le débit global de cytométrie en flux des essais et de faciliter la préparation quotidienne des cocktails d&#39;anticorps complexes nécessaires pour le phéno détailléecaractérisation typic du sang périphérique anticoagulé fraîchement prélevé.

Sang total L’immunophénotypage est indispensable pour surveiller le système immunitaire humain. Cependant, le nombre de réactifs nécessaires et l’instabilité de fluorochromes spécifiques dans les cocktails prémélangés nécessitent une préparation quotidienne des réactifs. Nous montrons ici que la préparation semi-automatisée d’un cocktail d’anticorps de coloration permet d’établir un immunophénotypage fiable en minimisant la variabilité de la distribution des réactifs.

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Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

L’objectif global de ce protocole de préparation semi-automatisée de cocktail d’anticorps de coloration est d’établir une méthode d’immunophénotypage fiable pour minimiser la variabilité de la distribution des réactifs. Cette méthode peut aider à résoudre des problèmes clés dans le domaine de l’immunosurveillance, tels que : comment contrôler la variabilité intra et inter-expérimentale de la distribution de réactifs. Le principal avantage de cette technique est que l’automatisation de la préparation du cocktail augmente la précision du pipetage, tout en réduisant les erreurs de préparation manuelle du cocktail. La démonstration de la procédure sera faite par Iliana Gonzalez, une technicienne de mon laboratoire. Avant de commencer la procédure, appliquez des étiquettes lisibles par l’homme sur les tubes de code-barres 2D. Ensuite, transférez tout le contenu de chaque flacon d’anticorps dans les tubes à code-barres 2D correspondants appropriés, en prenant soin d’éviter les bulles. Lorsque les anticorps ont été transférés, utilisez le lecteur de codes-barres 2D pour lire les tubes. Ensuite, créez une feuille de calcul contenant les noms des anticorps et les lectures de code-barres, puis enregistrez la feuille de calcul sous forme de fichier de valeurs séparées par des virgules. Maintenant, lancez le lecteur de codes-barres 2D, puis le manipulateur de liquide automatisé. Pour amorcer les seringues du manipulateur de liquide automatisé, sous Instrument, sélectionnez Accueil Tous les axes.Vérifiez qu’aucune des seringues ne contient de bulles d’air visibles. Lorsque les seringues sont amorcées, ouvrez les méthodes de préparation du cocktail de base et du cocktail d’activation dans le logiciel de manipulation automatique des liquides. Ensuite, placez les tubes microfuges dans le petit rack de tubes microfuges pour le cocktail de base et le cocktail d’activation, en fonction du nombre de cocktails de base et d’activation à fabriquer. Utilisez le schéma de configuration de l’instrument comme référence pour placer les supports de tubes sur le pont. Placez le réservoir tampon dans la section appropriée du plateau et utilisez un décapsuleur à vis à huit canaux pour déboucher les tubes de code-barres 2D contenant les anticorps. Pour éviter la contamination croisée, placez chaque capuchon dans un plateau de maintien des bouchons au fur et à mesure qu’ils sont retirés, afin de maintenir les bouchons dans l’ordre approprié. Placez ensuite les pointes filtrantes P50 LLS, les pointes filtrantes P200 LLS, les pointes P1000 et le porte-tubes Matrix 1 ml sur le pont dans leurs positions appropriées. Cliquez sur l’icône de démarrage pour démarrer la méthode. Lorsque la fenêtre contextuelle s’affiche, vérifiez que tous les éléments de la platine correspondent au schéma de configuration de l’instrument pour la méthode. Si tout est en place, cliquez sur OK. Le manipulateur de liquide automatisé transférera le tampon du réservoir aux tubes de microfuge. Le support de tube Matrix 1 ml passera au lecteur de codes-barres 2D, et les codes-barres seront lus. Lorsque tous les codes-barres ont été lus, cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle pour commencer le transfert d’anticorps. Une fois le transfert terminé, utilisez le décapsuleur à vis à huit canaux pour reboucher les tubes de code-barres 2D et remettez les tubes à 4

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Immunologie et infection

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