Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

L’objectif global de cette méthode est de contrôler le potentiel de la membrane cellulaire lors de la stimulation par des impulsions de lumière visible. Le processus de phototransduction est médié par un polymère conjugué sensible à la lumière. Cette méthode fournit un nouvel outil dans le domaine des technologies car elle représente une alternative précieuse aux méthodes existantes telles que l’optogénétique et la stimulation thermique pour le contrôle optique de l’activité des cellules vivantes.

Les principaux avantages de cette technique sont l’intégrabilité rapide avec n’importe quel type d’électrophysiologiste, la résolution spéciale et temporelle potentiellement élevée, ils réduisent l’invasivité. De plus, cela permet d’éviter un transfert de gènes qui est requis par l’optogénétique. Notre méthode est décrite ici pour la photostimulation de la culture cellulaire in vitro.

Mais cela pourrait également ouvrir des opportunités intéressantes pour des applications in vivo. Caterina Bossio et Susana Vaquero Morata feront la démonstration de la procédure à des post-doctorants de nos laboratoires ayant respectivement une formation en chimie biologique et physique. Pour commencer, préparez une solution du polymère conjugué sensible à la lumière en mélangeant le P3HT et le PCBM dans de la chlorobenzine à une concentration relative de un à un.

Mélangez la solution avec un agitateur magnétique pendant au moins quatre heures à 60 degrés Celsius. Ensuite, nettoyez les lames de verre recouvertes d’oxyde d’indium et d’étain avec des bains consécutifs de 10 minutes d’eau déminéralisée, d’acétone et d’isopropanol dans un sonicateur. Séchez les lamelles à l’aide d’un pistolet à azote, puis traitez les supports à l’aide d’un nettoyant plasma.

Une fois propre, placez la glissière sur le mandrin d’une spincoater, côté revêtu d’ITO vers le haut. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de la solution PCBM P3HT à la lame et essorez l’échantillon. Une fois que la spincoater est finie, retirez l’échantillon et utilisez un écouvillon de salle blanche trempé dans de l’acétone pour nettoyer le dos du substrat.

Stérilisez les substrats photoactifs en les plaçant dans un récipient couvert résistant à la chaleur et en les chauffant à 120 degrés Celsius pendant deux heures. Transférez ensuite les échantillons dans une hotte stérile et laissez-les refroidir. À partir de ce moment, maintenez la stérilité des échantillons.

Placez les substrats photoactifs dans une plaque à six puits. Étant donné l’hydrophobicité de la couche de polymère conjuguée, faites un puits de polydiméthylsiloxane pour fixer l’échantillon et confinez les solutions comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Ensuite, placez les substrats photoactifs dans les puits de la plaque et couvrez toute la surface de chaque échantillon avec 500 à 750 microlitres d’une solution de fibronectine de deux milligrammes par litre de PBS.

Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après l’incubation, utilisez une pipette en verre pour retirer la solution de fibronectine, puis lavez les substrats une fois avec deux millilitres de PBS. Tout d’abord, ajoutez un volume total de 750 à 1 000 microlitres de milieu de croissance complet par puits.

Ensuite, plaquez 15 000 cellules AGK293 par centimètre carré de substrat photoactif dans chaque puits. Ensuite, incubez les cellules pendant 24 à 48 heures. Les cellules peuvent être facilement cultivées sur les substrats photoactifs, à condition qu’une couche d’adhésion appropriée, comme la fibronectine, soit déposée.

Pour commencer, préparez les solutions extracellulaires et intracellulaires comme décrit dans le protocole textuel d’accompagnement. Stérilisez les solutions en les faisant passer à travers un filtre de 0,2 micron. Ensuite, préchauffez la solution extracellulaire en la plaçant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Remplissez également une seringue d’un millilitre avec la solution intracellulaire et équipez-la d’une aiguille de calibre 34. Maintenir la solution intracellulaire en contact avec la glace pour éviter la dégradation de l’ATP. Ensuite, retirez un substrat recouvert de cellules de l’incubateur et retirez soigneusement le PDMS.

Retirez ensuite le milieu de croissance à l’aide d’une pipette en verre et rincez lentement l’échantillon avec une solution extracellulaire pour éviter le détachement cellulaire. Ajoutez trois millilitres de solution extracellulaire dans chaque puits, puis transférez la plaque dans le porte-échantillon de la station d’électrophysiologie. Une fois en place, placez l’électrode de référence dans le puits à tester.

Ensuite, préparez une micropipette en verre fraîche pour pince à patch à l’aide d’un extracteur de micropipette. Remplissez la moitié de la pipette avec une solution intracellulaire. À l’aide du micromanipulateur, positionnez la pipette patch à proximité de la membrane cellulaire sélectionnée.

Lors du positionnement, appliquez une pression excessive sur la pipette afin d’éviter que la saleté ne colle sur la pointe. Avec la pipette à quelques microns au-dessus de la cellule, commencez à abaisser la pipette vers la membrane de la cellule tout en vérifiant la résistance de la pipette sur le logiciel de contrôle du patch. Lorsque la résistance de la pipette augmente d’environ un mégaohm, supprimez la surpression et appliquez une légère aspiration afin de former le gigaseal entre la pipette et la membrane cellulaire.

Ensuite, appliquez un potentiel négatif de moins 40 millivolts à la pipette pour aider à stabiliser le joint. Compensez la fugacité capacitive due à la capacité de la pipette avec les commandes correspondantes sur l’amplificateur de patch et/ou le logiciel de contrôle de patch. Appliquez une impulsion d’aspiration brève et intense à la pipette afin de briser la membrane et de permettre l’accès électrique au cytoplasme cellulaire.

Ensuite, réglez l’amplificateur de patch en mode pince de courant afin qu’aucun courant ne soit injecté dans la cellule. En mode pince actuelle, suivez le potentiel de la membrane cellulaire et attendez quelques minutes qu’il se stabilise. Une fois stable, appliquez le protocole d’éclairage souhaité à la cellule en éclairant la membrane photoactive sous la cellule avec une lumière dans la gamme de 450 à 600 nanomètres.

Enregistrez l’effet de la lumière sur le potentiel de membrane. De courtes impulsions lumineuses d’environ 10 à 20 millisecondes entraînent une dépolarisation transitoire de la cellule, tandis qu’avec un éclairage prolongé de l’ordre de centaines de millisecondes, une hyperbolisation est observée jusqu’à ce que la lumière soit éteinte. La stimulation optique des cellules médiée par les substrats photoactifs peut entraîner différents effets sur la membrane cellulaire, en fonction de la durée du stimulus lumineux.

Un pic rapide, comme celui illustré ici, est suivi d’une dépolarisation transitoire de l’ordre de quelques dizaines de millisecondes. Pour de courtes impulsions lumineuses lorsque la lumière est éteinte, un comportement opposé est observé. Ces signaux ont été attribués à une variation de la capacité de la membrane due à un échauffement local suite à l’absorption de la lumière.

Pour un éclairage prolongé, la dépolarisation initiale se transforme en hyperpolarisation cellulaire. Ce phénomène a à nouveau une origine thermique, mais dans ce cas, il est lié à une variation du potentiel d’équilibre membranaire due à une modification des conductivités du canal ionique induite par l’augmentation de la température. Il est important de noter que cette technique est assez flexible et peut être adaptée aux besoins particuliers d’une expérience spécifique, par exemple, en changeant le polymère photoxique, le processus de fabrication ou le protocole d’éclairage.

Cependant, avant de changer le protocole, il faut d’abord vérifier les propriétés importantes du polymère actif comme sa biocompatibilité, son adéquation au processus de stérilisation, sa stabilité électrochimique et temporelle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser une interface hybride entre les polymères conjonctifs et les cellules vivantes et comment l’utiliser pour le contrôle optique de l’activité cellulaire. Nous pensons que cette technique promet également de devenir un outil complémentaire en neurosciences pour les investigations in vitro et aussi d’ouvrir une nouvelle perspective d’applications in vivo.

Cependant, pour affiner le protocole, un effort fort et conjoint des scientifiques des matériaux et des neuroscientifiques, des physiciens et des médecins est obligatoire.