Name: Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez une méthode optique non invasive pour contrôler l'activité électrique des cellules vivantes en utilisant des polymères conjugués photosensibles. Cette technique offre une alternative prometteuse à l'optogénétique sans transfert de gènes.

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Le travail a été soutenu par l’UE dans le cadre du projet FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Téléthon - Italie (subventions GGP12033 et GGP14022), Fondazione Cariplo (subvention ID 2013-0738).

1. Préparation des substrats photoactifs <ol><li> Préparer une P3HT: PCBM solution (1: 1 en poids / poids) dans du chlorobenzène à une concentration de P3HT de 20 g / L. Mélanger la solution avec un agitateur magnétique pendant au moins 4 heures à 60 ° C. Considérons un volume de 150 ul de solution de substrat à chaque être préparé. </li><li> Lames propres de ITO verre (= 10 Ω / m² de R, 18x18 mm 2, 170 um d&#39;épaisseur) avec bains consécutifs d&#39;eau déminéralisée, l&#39;acétone et l&#39;isopropanol dans un appareil à ultrasons (10 min pour chaque étape). Sécher les lamelles avec un pistolet d&#39;azote. Mettre les échantillons dans un nettoyeur à plasma à 100 W pendant 10 min. </li><li> Déposer un film mince de la couche active sur les substrats nettoyés par spin-coating. <ol><li> Avec une pointe de diamant, couper une lame de verre de microscope, (épaisseur ≈ 1 mm) pour les mêmes dimensions latérales des substrats ITO. Retirez le P3HT: PCBM solution de la plaque de cuisson et laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Définir un deux-steps programme spin-coucheuse: i) 30 secondes à 800 tours par minute; ii) 30 secondes à 1600 tours par minute. Placer la lame sur le mandrin de la spin-coucheuse et commencer le vide pour le fixer. Mettre une goutte d&#39;acétone sur la diapositive et ensuite le substrat nettoyé, avec le côté revêtu d&#39;ITO vers le haut. Commencez la rotation de spin-coucheuse pour se débarrasser de l&#39;excès d&#39;acétone. </li><li> Mettez 150 pi de P3HT: PCBM solution sur les substrats et recommencer le spin-coucheuse (utiliser le même protocole décrit dans 1.3.2). </li><li> Après le spin-laqueur a terminé, retirez l&#39;échantillon et détachez soigneusement le substrat revêtu de la lame de verre. Nettoyez l&#39;arrière du substrat avec un tampon de salle blanche trempée dans de l&#39;acétone. Remarque: Les supports photosensibles peuvent être stockés pendant quelques jours dans une boîte sombre jusqu&#39;à utilisation. Pour de plus longues périodes, les maintenir dans une boîte à gants avec un gaz inerte. </li></ol></li></ol> 2. Préparation du milieu de culture cellulaire et l&#39;électrophysiologie Solutions <ol><li> Préparation du milieu de croissance complet (CGM) pourCellules HEK-293: Dulbecco modifié Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) inactivé à la chaleur non, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Stériliser le moyen d&#39;un système de filtration de 0,2 um et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer la solution extracellulaire dans l&#39;eau ultra-pure (concentrations en mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 5 HEPES, 10 glucose, 1,8 CaCl2, MgCl2 1. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser la solution avec un système de filtration de 0,2 um et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer la solution intracellulaire dans l&#39;eau ultra-pure (concentrations en mM): 12 KCl, 125 K-gluconate, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Notez que l&#39;ATP Na 2 est sensible à la chaleur et ajouter en dernier. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser la solution avec un système de filtration de 0,2 um, aliquote de 1 ml tubes et conserver à -20 ° C. </li></ol> 3. Placage des cellules HEK-293sur les substrats actifs <ol><li> Placez le substrat photosensible dans un bécher de verre recouverte d&#39;aluminium ou une boîte de Pétri fermée et mis dans un four à 120 ° C pendant 2 heures pour la stérilisation. Partir de ce moment, effectuer toutes les opérations dans des conditions stériles. Mettre les échantillons dans une hotte stérile et laissez-les refroidir. </li><li> Revêtir le substrat avec une couche photosensible d&#39;adhérence pour réduire le caractère hydrophobe de la surface et pour favoriser l&#39;adhérence cellulaire. <ol><li> Placez les substrats actifs dans une boîte de Pétri de P35 ou une plaque multipuits 6. Compte tenu du caractère hydrophobe de la couche de polymère conjugué, Faites un polydiméthylsiloxane (PDMS) et de fixer l&#39;échantillon et confiner les solutions. <ol><li> Mélanger PDMS et d&#39;un catalyseur à 10: 1 proportion avec une baguette de verre pour obtenir une suspension visqueuse. </li><li> Verser la pâte dans une plaque multi-puits 6, distribution d&#39;un montant suffisant pour couvrir la moitié de chaque puits. </li><li> Attendez pour la polymérisation PDMS à TA. </li><li> Couper les PDMS durcis au milieu pour bénéficier du droit àining une forme carrée de la même dimension de l&#39;échantillon de polymère. </li><li> Stériliser les PDMS puits par immersion dans un mélange éthanol-eau de 70% pendant au moins 30 min. </li></ol></li><li> Si vous utilisez bien les PDMS, gratter la couche photosensible long de la frontière du puits avec des pincettes pointues, afin d&#39;éviter le détachement de la totalité de la couche lors du retrait des PDMS bien après la culture de cellules. </li><li> Couvrir toute la surface de chaque échantillon avec une solution de fibronectine (2 mg / L dans du PBS). Un volume entre 500-750 ul par échantillon est généralement suffisant si un PDMS puits est utilisée (surface claire du bien: 15x15 mm 2). Sans les PDMS ainsi, environ 2 ml d&#39;une solution de fibronectine sont nécessaires pour immerger complètement l&#39;échantillon; attention à ce que le substrat ne flotte pas, tout en ajoutant la solution. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant au moins 1 heure. </li><li> Retirer la solution de fibronectine avec une pipette en verre et laver une fois avec 2 ml de PBS. </li></ol></li><li> Plmangé cellules HEK-293 sur des échantillons de fibronectine traitées à une densité de 15.000 cellules / cm2 dans du milieu de croissance complet. Utiliser un volume de 750-1,000 ul de CGM pour chaque échantillon si un PDMS bien est utilisé, autrement 2-3 ml de CGM sont nécessaires. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 à 48 heures. </li></ol> 4. optique protocole Stimulation et électrophysiologiques Mesures <ol><li> Mettez la solution extracellulaire dans un bain d&#39;eau à 37 ° C à thermaliser; décongeler la solution intracellulaire, le mettre dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 34 gauge et le garder en contact avec de la glace pour éviter la dégradation de l&#39;ATP. </li><li> Prenez un substrat revêtu de cellules de l&#39;incubateur, en enlevant soigneusement les PDMS bien si elle est présente. Retirer le milieu de croissance avec une pipette en verre et rinçage de l&#39;échantillon avec la solution extracellulaire. Procéder lentement pour éviter le détachement des cellules. </li><li> Mettre l&#39;appareil dans le porte-échantillon de la station d&#39;électrophysiologie avec solutio extracellulairen et l&#39;électrode de référence. Préparer micropipettes de verre frais de patch-clamp avec un extracteur (résistance idéale est dans la gamme 2-4 MQ). Remplissez la moitié de la pipette avec la solution intracellulaire et le monter sur le micromanipulateur. </li><li> Cherchez une cellule saine de patcher sur le dispositif. Pour éviter l&#39;excitation involontaire du substrat photosensible, en utilisant un éclairage infrarouge pour l&#39;imagerie, en plaçant un filtre passe-longueur d&#39;onde (par exemple, une longueur d&#39;onde de coupure λ = 750 nm peut être utilisée pour les polymères absorbant dans le visible) devant le dispositif d&#39;éclairage de microscope. </li><li> Patch la cellule sélectionnée et appliquer le protocole souhaité pour la stimulation optique en fournissant la lumière à l&#39;échantillon via le trajet d&#39;excitation de fluorescence du microscope (Figure 1). Une description détaillée du protocole de patch-clamp peut être trouvé dans la référence 20. <ol><li> Positionner la pipette de patch à proximité immédiate de la membrane cellulaire avec un manipulateur micrométrique. Pendant le positionnement, appliquer overpressure à la pipette afin d&#39;éviter la saleté qui adhère à la pointe. La pipette devrait être de quelques microns au-dessus de la cellule. </li><li> Commencer à abaisser la pipette vers la membrane cellulaire tout en contrôlant la résistance de la pipette sur le logiciel de contrôle de patch. Lorsque la résistance de la pipette a augmenté d&#39;environ 1 MQ, éliminer la surpression à partir de la pipette tout en appliquant une légère aspiration, afin de former la gigaseal entre la pipette et la membrane cellulaire (par exemple, la résistance mesurée devrait augmenter à des valeurs supérieures à 1 GQ) . </li><li> Appliquer un potentiel négatif à la pipette à proximité de la cellule attendue potentiel de repos (pour HEK293 cellule un potentiel de -40 mV peut être utilisé) pour aider à stabiliser le joint. Compenser les transitoires capacitifs en raison de la capacité de la pipette avec les commandes relatives à l&#39;amplificateur de patch et / ou le logiciel de contrôle du patch. </li><li> Casser la membrane pour permettre un accès électrique à la cytoplasme de la cellule en appliquant une impulsion d&#39;aspiration brève et intenseà la pipette. Réglez l&#39;amplificateur de patch clamp en mode de courant (I = 0, autrement dit, sans courant injecté dans la cellule) afin de suivre le potentiel de la membrane cellulaire. Attendez quelques minutes pour voir si le potentiel de la cellule est stable. </li><li> Appliquer le protocole d&#39;illumination désirée de la cellule et d&#39;enregistrer l&#39;effet sur le potentiel de membrane. Remarque: L&#39;éclairage peut être expédié à l&#39;échantillon, soit par le bas ou par le haut, en fonction de l&#39;architecture du microscope. <ol><li> Sélectionner une longueur d&#39;onde d&#39;excitation qui est bien absorbé par le matériau actif; pour le P3HT: PCBM mélange, une longueur d&#39;onde dans la gamme 450-600 nm peut être utilisé. Densités de photoexcitation appropriées sont dans la gamme 10-100 mW / mm 2. Remarque: courtes impulsions de lumière (ci-dessous 10-20 msec) résultat dans une dépolarisation transitoire de la cellule, tout avec un éclairage prolongé (plusieurs centaines de millisecondes ou des impulsions plus longues) une hyperpolarisation soutenue est observée jusqu&#39;à ce que la lumière est éteinte. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes critiques du protocole rapporté pour in vitro stimulation optique de cellules concernent principalement le choix du polymère sensible à la lumière, les paramètres de stérilisation thermique, l&#39;intensité et la durée des stimuli lumineux. Un P3HT: PCBM film mince a été choisi ici, car il garantit une bonne stabilité temporelle et électrochimique. Cependant, il faut noter que tous les polymères sensibles à la lumière peuvent offrir des performances analogiques, 22 plus précisément lors de...

La possibilité de manipuler l&#39;activité cellulaire avec une résolution spatiale et temporelle précise représente une stratégie importante dans la recherche neuroscientifique et dans le traitement de troubles neurologiques et psychiatriques. 1 Les méthodes traditionnelles sont basés sur la stimulation électrique des cellules en utilisant des électrodes positionnées à proximité ou en contact avec le système cible, 2 qui peut être différent de complexité (cellule unique, le réseau cellulaire, des tranches de cerveau, in vivo des tissus cérébraux). Au cours du siècle passé, l&#39;utilisation de patch-clamp, le métal et les électrodes de substrat intégré ont fourni une image détaillée de la physiologie et la physiopathologie de neurones simples et des mécanismes de réseaux de neurones de fonctionnement. Toutefois, la stimulation électrique souffre de limitations importantes. Le premier est lié à une résolution spatiale généralement médiocre en raison des dimensions physiques des électrodes et leur géométrie fixe, ce qui ne peut pas être facilement adaptésà des systèmes organisés complexes comme les tissus biologiques. En outre, les problèmes liés à l&#39;impédance des électrodes et de diaphonie entre les systèmes de stimulation et d&#39;enregistrement peuvent se détériorer le rapport signal final à bruit des mesures. 3 D&#39;autre part, l&#39;utilisation de la lumière pour la stimulation peut aider à surmonter de nombreuses limitations de l&#39;approche électrique. Tout d&#39;abord, elle offre sans précédent spatiale (&lt;1 um) et la résolution temporelle (&lt;1 ms), ce qui permet de cibler des types cellulaires spécifiques, voire des compartiments sub-cellulaires. En outre, il est hautement non invasif car il évite tout contact physique avec le tissu d&#39;intérêt et se démêlent stimulation de l&#39;enregistrement. En outre, à la fois l&#39;intensité lumineuse et la longueur d&#39;onde peuvent être précisément réglementés et protocoles de stimulation ainsi diverses peuvent être appliquées. 3,4 Cependant, la grande majorité des cellules animales ne présentent aucun sensibilité particulière à la lumière. Plusieurs stratégies pour stimulatio optiquen ont donc été proposées, soit l&#39;exploitation de médiateurs moléculaires sensibles à la lumière à proximité ou à l&#39;intérieur des cellules, ou en utilisant un dispositif photosensible placé à l&#39;extérieur, à proximité de la cellule. La première catégorie se réfère aux mécanismes endogènes comme la stimulation par l&#39;intermédiaire (IR) lumière visible ou infrarouge, ainsi que l&#39;utilisation soit de composés photoisomérisables / photoclivable ou l&#39;expression génétique des actionneurs moléculaires photosensibles (optogénétique). Cette dernière catégorie comprend les techniques de stimulation exogène obtenue avec l&#39;utilisation de nano / micro-particules inorganiques ou des substrats de silicium photoconducteur. 5 Cependant, tous ces systèmes ont des côtés lumineux et des inconvénients. En particulier, l&#39;absorption endogène de cellules dans le domaine visible est faible et non fiable, et la génération concomitante d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène peut être nuisible à la cellule. En général, les IR est utilisé pour induire chauffage thermique local du fait de l&#39;absorption d&#39;eau, mais le coefficient d&#39;extinction de l&#39;eau est faible, ce qui nécessite stlumière infrarouge rong (de quelques dizaines à des centaines de W / mm 2) qui est difficile à livrer via optique du microscope standard et peut poser des problèmes de sécurité pour les applications in vivo. D&#39;autre part, les composés de cages photo-commutables ont une action limitée dans le temps et nécessitent souvent la lumière UV qui est difficile à remettre en raison de la pénétration tissulaire limitée. De plus, ils souffrent de problèmes de diffusion des composés activés lors de la photolyse en dehors de la zone éclairée. Enfin, des outils optogénétiques ont permis aux scientifiques de cibler sous-population cellulaire spécifique et des sous-compartiments et sont rapidement en train de devenir l&#39;une des technologies clés dans la recherche neuroscientifique. Cependant, l&#39;insertion d&#39;un segment d&#39;ADN exogène via un vecteur viral soulève des questions importantes sur la sécurité, notamment en vue de l&#39;adoption sur des patients humains. 5,6 Pour ces raisons, la recherche sur de nouveaux matériaux et dispositifs capables de manipulation optique de la cellule est un sujet extrêmement chaud. Récemment, un romanapproche basée sur l&#39;utilisation de polymères conjugués sensibles à la lumière, capable de transduire efficacement un stimulus optique en une modulation de l&#39;activité électrique de la cellule, a été proposée. La cellule de stimulation par Polymer photoexcitation (CSPP) technique exploite de nombreuses fonctionnalités clés génériques, typique de semi-conducteurs organiques: ils sont intrinsèquement sensibles à la lumière dans le domaine visible; 7 ils sont biocompatible, souple et adaptable et leur flexibilité mécanique permet une interface intime avec le tissu à la fois in vitro et in vivo 10.8. En dehors de cela, ils peuvent être facilement fonctionnalisés de mieux adapter à l&#39;interface avec les cellules vivantes, et de permettre à excitation spécifique, sonder et de détection des capacités. 11,12 De plus, ils support électronique ainsi que le transport ionique, ce qui les rend idéal pour la combinaison de l&#39;électronique annonce la biologie. 13,14 intéressant, ils peuvent fonctionner en mode photovoltaïque, évitant la nécessité d&#39;appliquer un biais f extérieurou la stimulation de la cellule optique efficace. 15 La fiabilité de la technique CSPP a déjà été démontré dans plusieurs systèmes, y compris les neurones primaires, 15,16 astrocytes, 17 lignées cellulaires secondaires 18 et tissus rétiniens explantées. 16 Dans ce travail, toutes les mesures nécessaires pour fabriquer un bio-polymère sensible à la lumière interface 19 pour la stimulation optique de systèmes in vitro sont décrits en détail. Comme une étude de cas, un système photovoltaïque mélange organique prototypique de la région régulière poly (3-hexylthiophène) (rr-P3HT), fonctionnant comme le donneur d&#39;électrons, et d&#39;ester phényl-C61-butyrique-acide-méthyle (PCBM), agissant en tant que accepteur d&#39;électrons est utilisé. Comme le système biologique, des cellules de rein embryonnaire humain (HEK-293) sont utilisées. Un exemple d&#39;un protocole de photostimulation avec l&#39;enregistrement relatif de l&#39;activité des cellules par l&#39;intermédiaire de mesures électrophysiologiques est fourni. La plate-forme décritest cependant de validité générale, et il peut facilement être étendue à l&#39;utilisation d&#39;autres polymères conjugués (en ajustant convenablement le procédé en solution de préparation et les paramètres de dépôt), différents types de cellules (par correctement changeant le protocole de culture de cellules, la procédure et le temps requis placage pour l&#39;ensemencement et la prolifération cellulaire) et des protocoles de stimulation différentes (longueur d&#39;onde de la lumière, la fréquence et la durée des stimuli, densité de photoexcitation).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>Substrats revêtus d’ITO</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acétone&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>alcool isopropylique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>cellules HEK</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>LGC normes srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Les interfaces hybrides entre semi-conducteurs organiques et tissus vivants représentent un nouvel outil pour les applications in-vitro et in-vivo. En particulier, les polymères conjugués présentent plusieurs propriétés optimales en tant que substrats pour les systèmes biologiques, telles qu’une bonne biocompatibilité, d’excellentes propriétés mécaniques, une technologie de traitement peu coûteuse et facile et la possibilité de dépôt sur des substrats légers, minces et flexibles. Ces matériaux ont été utilisés pour des interfaces cellulaires telles que des sondes neuronales, des transistors pour l’excitation et l’enregistrement de l’activité neuronale, des biocapteurs et des actionneurs pour la libération de médicaments. Des expériences récentes ont également démontré la possibilité d’utiliser des polymères conjugués pour la modulation tout optique de l’activité électrique des cellules. Plusieurs cas d’études in vitro ont été rapportés, notamment des réseaux neuronaux primaires, des astrocytes et des cellules de lignées secondaires. De plus, il a été démontré que la photo-transduction du signal médiée par les polymères organiques restaure la sensibilité à la lumière dans les rétines dégénérées, ce qui suggère que ces dispositifs pourraient être utilisés pour les prothèses rétiniennes artificielles à l’avenir. Dans l’ensemble, les polymères conjugués sensibles à la lumière représentent une nouvelle approche pour la modulation optique de l’activité cellulaire.
Dans ce travail, toutes les étapes nécessaires à la fabrication d’une interface biopolymère pour l’excitation optique de cellules vivantes sont décrites. La fonction de l’interface active est de traduire le stimulus lumineux en une modulation du potentiel de la membrane cellulaire. À titre de cas d’étude, utile pour les études in vitro, un film mince de polythiophène est utilisé comme couche fonctionnelle absorbant la lumière, et les cellules de rein embryonnaire humain (HEK-293) sont utilisées comme composant biologique de l’interface. Des exemples pratiques de contrôle réussi du potentiel de la membrane cellulaire lors d’une stimulation avec des impulsions lumineuses de différentes durées sont fournis. En particulier, il est démontré que des effets dépolarisants et hyperpolarisants sur la membrane cellulaire peuvent être obtenus en fonction de la durée du stimulus lumineux. Le protocole rapporté est d’une validité générale et peut être directement étendu à d’autres préparations biologiques.

Les cellules peuvent être facilement cultivées sur P3HT: PCBM substrats, à condition qu &#39;une couche d&#39;adhérence est déposée convenable (tel que la fibronectine utilisé dans l&#39;étape 3.2 du protocole décrit). P3HT: PCBM pics d&#39;absorption optique dans la partie verte du spectre visible; cependant, d&#39;autres polymères conjugués sensibles à la lumière peuvent être sélectionnés, en fonction de la gamme de longueurs d&#39;onde de photostimulation préféré (figure 2).</...

Une méthode de stimulation de cultures cellulaires in vitro avec l’activité électrique avec la lumière visible, basée sur l’utilisation de polymères semi-conducteurs organiques, est décrite.

Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Le but général de cette méthode est de contrôler le potentiel de la membrane cellulaire lors d'une stimulation par des impulsions lumineuses visibles. Le processus de phototransduction est médié par un polymère conjugué sensible à la lumière. Cette méthode offre un nouvel outil dans le domaine des technologies, car elle constitue une alternative intéressante aux méthodes existantes telles que l'optogénétique et la stimulation thermique pour le contrôle optique de l'activité des cellules vivantes.Les principaux avantages de cette technique sont son intégration rapide à tout type d'électrophysiologiste, sa résolution spatiale et temporelle potentiellement élevée, ainsi que sa réduction de l'invasivité. En outre, elle permet d'éviter un transfert génique requis par l'optogénétique. Notre méthode est décrite ici pour la photostimulation de cultures cellulaires in vitro.Mais cela pourrait également ouvrir des perspectives intéressantes pour des applications in vivo. La procédure sera démontrée par Caterina Bossio et Susana Vaquero Morata, post-doctorantes de nos laboratoires ayant respectivement des formations en biologie et en chimie physique. Pour commencer, préparez une solution du polymère conjugué photosensible en mélangeant du P3HT et du PCBM dans du chlorobenzène à une concentration relative de un à un.Mélanger la solution avec un agitateur magnétique pendant au moins quatre heures à 60 degrés Celsius. Ensuite, nettoyer des lames en verre recouvertes d'oxyde d'étain et d'indium avec des bains successifs d'eau déionisée, d'acétone et d'isopropanol de 10 minutes chacun dans un sonicateur. Sécher les lames avec un pistolet à azote, puis traiter les substrats à l'aide d'un nettoyeur à plasma.Une fois propre, placez la lame sur le plateau du spin-coater, le côté recouvert de ITO tourné vers le haut. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de la solution P3HT:PCBM sur la lame et effectuez le dépôt par rotation. Une fois le spin-coater arrêté, retirez l'échantillon et utilisez un coton-tige de salle propre trempé dans l'acétone pour nettoyer l'arrière du substrat.Stérilisez les substrats photoactifs en les plaçant dans un récipient résistant à la chaleur et couvert, puis en les chauffant à 120 degrés Celsius pendant deux heures. Transférez ensuite les échantillons dans une hotte stérile et laissez-les refroidir. À partir de ce moment, maintenez la stérilité des échantillons.Placer les substrats photoactifs dans une plaque à six puits. Étant donné l'hydrophobicité de la couche de polymère conjugué, créer un puits en polydiméthylsiloxane afin de fixer l'échantillon et de confiner les solutions, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, placer les substrats photoactifs dans les puits de la plaque et recouvrir entièrement la surface de chaque échantillon avec 500 à 750 microlitres d'une solution de fibronectine à deux milligrammes par litre dans le PBS.Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Après l'incubation, utiliser une pipette en verre pour éliminer la solution de fibronectine, puis laver les substrats une fois avec deux millilitres de PBS. Ajouter d'abord un volume total de 750 à 1 000 microlitres de milieu de croissance complet par puits.Ensuite, ensemencez 15 000 cellules AGK293 par centimètre carré de substrat photoactif dans chaque puits. Incubez ensuite les cellules pendant 24 à 48 heures. Les cellules peuvent être facilement cultivées sur les substrats photoactifs, à condition qu'une couche d'adhérence appropriée, comme la fibronectine, soit déposée.Pour commencer, préparez les solutions extracellulaire et intracellulaire comme décrit dans le protocole accompagnant. Stérilisez les solutions en les filtrant à travers un filtre de 0,2 micron. Ensuite, préchauffez la solution extracellulaire en la plaçant dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.Remplir également une seringue d’un millilitre avec la solution intracellulaire et l’équiper d’une aiguille de calibre 34. Maintenir la solution intracellulaire en contact avec de la glace afin d’éviter la dégradation de l’ATP. Ensuite, retirer du incubateur un substrat recouvert de cellules et ôter délicatement le puits en PDMS.Ensuite, retirez le milieu de croissance à l’aide d’une pipette en verre et rincez lentement l’échantillon avec la solution extracellulaire afin d’éviter le détachement des cellules. Ajoutez trois millilitres de solution extracellulaire dans chaque puits, puis transférez la plaque vers le porte-échantillon de la station d’électrophysiologie. Une fois en place, insérez l’électrode de référence dans le puits qui doit être testé.Ensuite, préparez une micropipette en verre fraîche pour le patch clamp à l'aide d'un tireur de micropipettes. Remplissez la moitié de la pipette avec la solution intracellulaire. Utilisez le micromanipulateur pour positionner la pipette de patch à proximité immédiate de la membrane cellulaire sélectionnée.Pendant le positionnement, appliquez une pression excessive sur la pipette afin d'éviter que des impuretés n'adhèrent à l'extrémité. Lorsque la pipette se trouve à quelques microns au-dessus de la cellule, commencez à abaisser la pipette vers la membrane cellulaire tout en surveillant la résistance de la pipette à l'aide du logiciel de contrôle de patch. Lorsque la résistance de la pipette augmente d'environ un mégohm, retirez la pression excessive et appliquez une aspiration douce afin de former le scellement gigaseal entre la pipette et la membrane cellulaire.Ensuite, appliquez un potentiel négatif de moins 40 millivolts à la pipette afin de stabiliser le scellement. Compensez la transitoire capacitive due à la capacité de la pipette à l’aide des commandes appropriées sur l’amplificateur de patch ou/et le logiciel de contrôle du patch. Appliquez une impulsion de succion brève et intense à la pipette afin de rompre la membrane et permettre l’accès électrique au cytoplasme de la cellule.Ensuite, régler l'amplificateur de patch en mode de blocage de courant afin qu'aucun courant ne soit injecté dans la cellule. En mode de blocage de courant, suivre le potentiel de la membrane cellulaire et attendre quelques minutes pour qu'il se stabilise. Une fois stabilisé, appliquer au niveau de la cellule le protocole d'illumination souhaité en éclairant la membrane photoactive située sous la cellule avec une lumière dont la longueur d'onde se situe entre 450 et 600 nanomètres.Enregistrez l'effet de la lumière sur le potentiel membranaire. De brèves impulsions lumineuses d'environ 10 à 20 millisecondes provoquent une dépolarisation transitoire de la cellule, tandis qu'une illumination prolongée de l'ordre de plusieurs centaines de millisecondes entraîne une hyperpolarisation soutenue jusqu'à l'extinction de la lumière. La stimulation optique des cellules, médiée par les substrats photoactifs, peut induire différents effets sur la membrane cellulaire, selon la durée du stimulus lumineux.Un pic rapide, comme celui illustré ici, est suivi par une dépolarisation transitoire de l'ordre de dizaines de millisecondes. Pour de courtes impulsions lumineuses, lorsque la lumière est éteinte, un comportement opposé est observé. Ces signaux ont été attribués à une variation de la capacité membranaire due à un échauffement local consécutif à l'absorption de la lumière.Pour une illumination prolongée, la dépolarisation initiale se transforme en une hyperpolarisation cellulaire. Ce phénomène a de nouveau une origine thermique, mais dans ce cas, il est lié à une variation du potentiel d'équilibre membranaire due à un changement de la conductivité des canaux ioniques induit par l'augmentation de la température. Il est important de noter que cette technique est assez souple et peut être adaptée aux besoins particuliers d'une expérience spécifique, par exemple en modifiant le polymère phototoxique, le procédé de fabrication ou le protocole d'illumination.Cependant, avant de modifier le protocole, on devrait d'abord vérifier les propriétés importantes du polymère actif, telles que sa biocompatibilité, son aptitude au processus de stérilisation, ainsi que sa stabilité électrochimique et temporelle. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser une interface hybride entre des polymères conducteurs et des cellules vivantes, et de la façon de l'utiliser pour le contrôle optique de l'activité cellulaire. Nous pensons que cette technique promet également de devenir un outil complémentaire en neurosciences pour des études in vitro, ainsi que d'ouvrir de nouvelles perspectives pour des applications in vivo.Cependant, afin d'affiner le protocole, un effort fort et conjoint des scientifiques des matériaux, des neuroscientifiques, des physiciens et des médecins est indispensable.

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