Un nouveau-né de la moelle épinière de souris Compression Modèle de lésion
27 mars 2016
Cet article décrit une méthode permettant de générer une lésion par compression de la moelle épinière (LME) reproductible chez la souris néonatale. Le modèle fournit une plate-forme avantageuse pour étudier les mécanismes de plasticité adaptative qui sous-tendent la récupération fonctionnelle spontanée.
L'objectif général de cette procédure est de réaliser une lésion par compression de la moelle épinière reproductible chez une souris néonatale. Pour ce faire, on commence par anesthésier profondément la souris, puis on effectue une laminectomie dorsale afin de découvrir la moelle épinière.
Et enfin, en provoquant une lésion par compression. Nous avons récemment mis au point un modèle de souris néonatale pour lésion de la moelle épinière et nous avons démontré que les souris néonatales présentent un degré étonnant de plasticité adaptative. L’étude de ce mécanisme sous-jacent à la récupération pourrait fournir des informations importantes, qui pourraient être utilisées dans le traitement des lésions de la moelle épinière.
Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment réaliser une lésion par compression de la moelle épinière chez une souris âgée d'un jour. Cette procédure chirurgicale comprend l'anesthésie, une laminectomie et deux compressions épidurales à l'aide de pinces. Préparation de la chirurgie.
La chirurgie est réalisée sous un microscope stéréo. Placer un tapis chauffant sous le microscope. Il est essentiel de maintenir le petit au chaud afin d'éviter une mort subite pendant l'intervention chirurgicale.
Placer une couverture chirurgicale ou une grande feuille de papier de laboratoire propre et doux sur le tapis chauffant. Pour l'analgésie préchirurgicale, préparer une seringue à insuline de 0,3 millilitre, aiguille de calibre 30, remplie d'anesthésique local, Marcaine, dilué avec du PBS stérile, à une concentration finale de 2,5 milligrammes par millilitre. Pour l'incision cutanée, l'ablation musculaire et la laminectomie, utiliser un microcouteau, des pinces fines et des ciseaux d'iridectomie fins.
Notez qu'ici, nous utilisons également des pinces dont nous avons courbé les extrémités pour former des dents. Celles-ci fonctionnent mieux que les pinces dentées du commerce, car les dents doivent être très petites. Pour la compression de la moelle épinière, utilisez un clip minuscule pour anévrisme temporaire Yasargil modifié spécialement, que nous décrirons plus tard.
Une courte section de tube capillaire en plastique est également nécessaire pour fabriquer un bouchon empêchant la fermeture complète de la pince, ainsi qu’un applicateur de pince pour positionner celle-ci. Pour la suture, utilisez une pince à suture et de petites ciseaux pour couper le fil. Pour le traitement de la douleur, diluez le Temgesic dans du PBS stérile à une concentration de 0,03 milligrammes par millilitre.
La lésion de la moelle épinière implique une compression par clip, à l'aide d'un clip minuscule temporaire pour anévrisme Yasargil. Avant utilisation, le clip doit être modifié mécaniquement en réduisant l'épaisseur des lames à 150 micromètres à l'aide d'une pierre à aiguiser. Juste avant la chirurgie, couper un court segment de tube en plastique et le placer sur l'une des lames du clip.
Le tube agit comme un bouchon pour empêcher la fermeture complète de la pince. Anesthésie et analgésie. Pour l'anesthésie gazeuse, nous utilisons un vaporisateur de suprane relié à une bouteille d'oxygène.
Le isoflurane est l'anesthésique qui est vaporisé dans de l'oxygène pur. Pour administrer le mélange d'isoflurane et d'oxygène à la souris, vous devez construire un masque nasal adapté aux nouveau-nés. Les souris néonatales étant très petites, le masque peut être fabriqué à partir de l'extrémité d'une seringue, qui sert d'entrée pour le tube en plastique relié à la sortie du vaporisateur.
Sur le côté du masque, percer un petit trou afin d'y connecter un tube d'évacuation qui se termine soit par une pompe à vide régulée, équipée d'un dispositif de collecte, soit simplement par une hotte aspirante. Fabriquer une chambre de débordement pour l'anesthésie en utilisant une boîte de Pétri en plastique de 150 par 25 millilitres. Sur un des côtés, pratiquer un trou suffisamment grand pour laisser passer la tête de la souris.
Sur le côté opposé, faites deux petits trous du diamètre du tube en plastique. Enfin, pratiquez un trou d'évacuation, plus petit que les autres, sur le dessus du plat. Coupez l'extrémité d'une pipette de 250 microlitres et insérez-la dans ce dernier trou.
La pointe de pipette fonctionne comme un connecteur pour le tube d'évacuation qui est relié à un dispositif sous vide réglé à une légère pression négative. À l'aide de pâte à modeler, fixez le masque juste à l'intérieur de l'orifice destiné à la tête de la souris. À l'aide de ruban adhésif ou de pâte à modeler, fixez le tube en plastique au plafond de la chambre, en vous assurant que les tubes sont bien positionnés dans les orifices appropriés.
Placer la chambre sur la couverture chirurgicale sous le microscope. L'ensemble du système est représenté dans ce schéma. Un robinet à trois voies est placé à la sortie du vaporisateur.
Ici, le trajet vers la chambre d'endormissement est libre, tandis que celui vers le masque est bloqué, et la souris peut être placée dans la chambre d'endormissement pour initier la sédation. Tourner le robinet trois voies vers la droite permet au gaz de circuler vers le masque et ferme le passage vers la chambre d'endormissement. Dans cette configuration, la souris peut être transférée vers le masque.
La fuite de gaz est éliminée par vide dans la chambre de débordement. Sélectionnez un souriceau ayant récemment bu du lait, comme en témoigne la couleur blanche visible à travers la peau. Placez le souriceau dans la chambre d'endormissement et introduisez de l'isoflurane vaporisé à 4 % pour obtenir une sédation rapide.
Transférez le petit au masque. Positionnez soigneusement le museau de la souris bien à l'intérieur du masque afin d'assurer une exposition suffisante au gaz anesthésique. Tournez le robinet en té, afin de diriger le gaz vers le masque.
Injecter par voie sous-cutanée 50 microlitres de Marcaine à 2,5 milligrammes par millilitre au site chirurgical souhaité. Veiller à ne pas injecter trop profondément, car les vaisseaux sanguins peuvent être facilement endommagés et l'administration de Marcaine dans un vaisseau est létale. Retirer l'excès de Marcaine à l’aide d’un petit compressif stérile.
Laminectomie dorsale. Réduire la concentration d'isoflurane à un à deux pour cent. Après quelques minutes, percer la peau avec un microcouteau et réaliser une ouverture de transfert de huit à neuf millimètres en tirant doucement sur la peau dans un sens rostro-caudal.
Une ouverture par transfert est beaucoup plus pratique et offre un meilleur accès latéral pour réaliser la laminectomie. Rétracter les bords de l'incision cutanée par rapport aux tissus sous-jacents en insérant des morceaux de spongistatine, par voie sous-cutanée, au niveau rostral et caudal de l'incision. Couper les muscles prévertébraux avec des ciseaux fins afin d'exposer la colonne vertébrale.
Remarquez que chez le nouveau-né, le processus épineux n'est pas complètement développé. Identifiez la ligne médiane et sectionnez transversalement la lame avec les ciseaux fins. Veillez à ne pas couper trop profondément, car cela pourrait endommager la dure-mère et même la moelle épinière.
Placez soigneusement une lame d'une pince fine entre la lame et la dure-mère. Saisissez la lame en fermant la pince et soulevez-la délicatement jusqu'à ce qu'elle se détache, en laissant la dure-mère intacte. Répétez cette étape deux à trois fois afin d'obtenir une laminectomie d'un à deux segments.
Contrôler les saignements à l'aide de petits morceaux de spongistatine. En utilisant la pince fine comme rongeur, retirer bilatéralement des parties des articulations facetaires afin de gagner suffisamment d'espace pour placer la mini-pince à anévrisme modifiée dans le canal vertébral. Cette étape provoque souvent des saignements qui peuvent être contrôlés à l'aide de petits morceaux de spongistatine.
Pour améliorer la visibilité, il peut être avantageux de rincer avec du PBS stérile tiède à 37 degrés Celsius. Induction de la lésion par compression de la moelle épinière. Ouvrir la pince et positionner les lames de chaque côté de la moelle épinière, dans les espaces situés entre les articulations facetaires et la moelle.
Veillez à ce que les lames soient insérées suffisamment profondément pour englober la partie ventrale de la moelle épinière. Fermez rapidement le clip tout en maintenant l'appliquateur en place, afin d'éviter que le clip ne glisse vers l'arrière. Après 15 secondes, relâchez rapidement le clip.
Nettoyez la plaie à l’aide de spongistatine. Pour obtenir une compression symétrique, inversez les lames et effectuez une seconde compression pendant 15 secondes dans l’orientation opposée. Suture. Retirez les morceaux de spongistatine placés sous la peau au début de la chirurgie et fermez la peau avec des points de suture 6,0.
Injecter 0,05 millilitres de Temgesic à 0,03 milligramme par millilitre, par voie sous-cutanée à l’aide d’une seringue à insuline de calibre 30, puis placer le petit dans un environnement à température contrôlée à 30 degrés Celsius pendant quelques heures. Pour réduire le comportement maternel agressif envers le petit opéré durant la première nuit suivant l’intervention, préparer une solution de Diazépam diluée dans du PBS propre à 0,1 milligramme par millilitre, destinée à une injection intrapéritonéale à raison de huit grammes par kilogramme. Résultats.
Comme le montre ce graphique, six heures après une compression de la moelle épinière, au niveau thoracique inférieur, les membres postérieurs des souris blessées sont paralysés, tandis que les membres antérieurs ne le sont pas. Dans le cas des animaux contrôles faux-opérés, ayant uniquement subi une laminectomie, les membres postérieurs et antérieurs sont très mobiles. La section de la moelle épinière montre la présence de sang résiduel au site de la lésion.
En outre, le tissu est translucide, ce qui suggère une perte tissulaire, souvent suivie quelques jours plus tard par la formation d'une cavité. Conclusion. À l'issue de cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire une lésion par compression de la moelle épinière chez une souris néonatale. L'avantage de l'utilisation de souris néonatales réside dans la possibilité d'employer des méthodes spécifiques pour étudier la plasticité adaptative, méthodes qui ne peuvent pas être utilisées chez les souris adultes.
En outre, le modèle fournit une plateforme pour tester des approches thérapeutiques, telles que la transplantation de cellules souches.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de provoquer une lésion de compression de la moelle épinière (SCI) reproductible chez des souriceaux néonatals. Ce modèle présente un avantage pour l'étude des mécanismes de plasticité adaptative sous-jacents à la récupération fonctionnelle spontanée.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Neurobiologie
- Modèles de lésions
Contexte
- Les lésions de la moelle épinière peuvent entraîner des troubles fonctionnels importants.
- Les souris néonatales présentent une capacité remarquable de récupération.
- La compréhension de la plasticité adaptative est essentielle pour le développement de traitements.
- Ce modèle permet une expérimentation contrôlée sur les lésions de la moelle épinière.
Objectif de l'étude
- Établir un modèle reproductible de lésion par compression de la moelle épinière.
- Étudier les mécanismes de récupération chez les souriceaux néonatals.
- Fournir des éléments de compréhension pour des approches thérapeutiques potentielles.
Méthodes utilisées
- Anesthésie profonde de souriceaux.
- Laminectomie dorsale pour exposer la moelle épinière.
- Lésion par compression à l’aide d’un miniclamp modifié pour anévrisme temporaire Yasargil.
- Analgésie postopératoire pour la gestion de la douleur.
Résultats principaux
- Le modèle induit avec succès une lésion par compression de la moelle épinière.
- Les souriceaux néonatals montrent une plasticité adaptative importante après la lésion.
- Les connaissances acquises pourraient guider les traitements futurs des lésions médullaires.
- Un protocole chirurgical détaillé assure la reproductibilité du modèle.
Conclusions
- Ce modèle constitue un outil précieux pour l'étude des lésions de la moelle épinière.
- La compréhension des mécanismes de récupération peut conduire à de meilleures thérapies.
- Les recherches futures pourront s'appuyer sur ces travaux fondamentaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce modèle de compression de la moelle épinière chez la souris néonatale permet d'étudier mécanistiquement la plasticité adaptative dans la récupération après une lésion survenue en début de vie, offrant un système pertinent sur le plan pathologique pour évaluer le risque des hypothèses thérapeutiques. En reconstituant la dynamique spontanée de récupération fonctionnelle, ce modèle soutient la validation de cibles thérapeutiques et le criblage phénotypique dans les programmes de neurosciences précliniques. Sa pertinence par rapport aux lésions médullaires pédiatriques et sa possible continuité translationnelle aux indications adultes renforcent la prise de décision à l'échelle du portefeuille dans la découverte de neurothérapeutiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques liées aux mécanismes de plasticité adaptative dans la lésion médullaire.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système biologiquement pertinent pour la validation fonctionnelle de cibles thérapeutiques à l'aide de paramètres comportementaux et d'enregistrements électrophysiologiques.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en reliant les voies de plasticité précoces à des cibles thérapeutiques potentielles.
Élaboration de tests et criblage
- Prêt-à-l'emploi pour les tests : Génère un modèle de lésion standardisé et reproductible, adapté au criblage de composés et aux essais d'interventions thérapeutiques.
- Paramètres quantitatifs : Permet des mesures de variables dépendantes incluant la motricité des membres postérieurs, la connectivité synaptique et l'activité électrophysiologique.
- Évolutivité : Permet l'enregistrement optique à haut débit et l'analyse physiologique ex vivo pour le développement d'essais ultérieurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise une lésion médullaire pédiatrique avec des signes d'atteinte aiguë des membres postérieurs et une récupération fonctionnelle dans les deux semaines.
- Continuité translationnelle : Exploite les mécanismes de plasticité partagés entre la moelle épinière néonatale et adulte pour générer des connaissances transversales selon l'âge.
- Progrès ajusté au risque : Permet l'évaluation de candidats thérapeutiques en utilisant la récupération fonctionnelle et la reconnexion synaptique comme biomarqueurs prédictifs.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le modèle s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'aux tests d'efficacité préclinique, en particulier pour les approches neuroprotectrices et neurorestauratrices.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la plasticité adaptative et les mécanismes de récupération fonctionnelle après une compression de la moelle épinière.
- Essais : Permet le développement de tests pour l'évaluation de composés à l'aide de paramètres comportementaux et physiologiques quantifiables.
- Analytique : Génère des mesures de variables dépendantes telles que la signalisation électrophysiologique et l'enregistrement optique de la connectivité synaptique.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes concernant la plasticité précoce à la lésion médullaire chez l'adulte par le biais de mécanismes biologiques conservés.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour des tests itératifs d'interventions thérapeutiques au cours des phases de découverte et préclinique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la cible en élucidant les mécanismes de la récupération spontanée et de la plasticité adaptative.
- Valeur opérationnelle : Fournit un modèle chirurgical reproductible avec des paramètres de compression standardisés et des soins postopératoires normalisés.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des signaux précoces d'efficacité dans un modèle de lésion à forte plasticité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des neurothérapeutiques fondée sur des biomarqueurs de la récupération fonctionnelle et de la réparation synaptique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation de souriceaux néonatals, en microchirurgie et en techniques d’enregistrement électrophysiologique.
- Dépend d’un équipement spécialisé comprenant un microscope stéréo, un applicateur de mini-pince pour anévrisme et des systèmes de récupération à température contrôlée.
- Exige une standardisation entre les équipes chirurgicales pour réaliser de manière reproductible la laminectomie et l’application de la lésion par compression.
- Implique des considérations d’adaptation lors de la transposition des résultats obtenus chez le néonatal vers des contextes de moelle épinière adulte ou humaine.
- Les limites pratiques incluent la spécificité du modèle aux stades postnataux précoces ainsi que la variabilité potentielle de la gravité de la lésion en fonction du positionnement de la pince.
