Analyse comparative de l'hormone de croissance dans le sérum en utilisant SPRi, Nano-SPRi et dosages ELISA

L'objectif général de cette étude est d'évaluer le potentiel diagnostique des dosages d'imagerie par résonance plasmonique de surface directe et amplifiée, ou SPRi, dans la détection de biomarqueurs dans le sérum, et de les comparer directement au kit d'immunodosage enzymatique disponible commercialement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical, telles que la mise en évidence d'un stade précoce d'une maladie et la fourniture de moyens permettant de surveiller l'efficacité thérapeutique. Le principal avantage de la SPRi est qu'elle permet une surveillance et une visualisation en temps réel, sans marquage, des interactions biomoléculaires, en enregistrant les variations de l'indice de réfraction adjacent à la surface du capteur.

Les implications de cette technique s'étendent à l'analyse des taux d'hGH dans le sérum, car l'hGH endogène a été associée à de nombreux troubles médicaux affectant la croissance et le développement humains. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de préparation de la chimie de surface de la puces biochimique sont difficiles à maîtriser, et toute erreur peut fortement affecter les résultats. Après avoir préparé les solutions et les échantillons protéiques conformément au protocole décrit, utiliser 120 millilitres de solution piranha stabilisée pour nettoyer la puce dorée par sonication à 50 degrés Celsius pendant 90 minutes.

Utilisez de l'eau pour rincer la puce, puis placez-la dans un bain ultrasonique d'eau pendant cinq minutes. Rincez ensuite la puce avec de l'éthanol et séchez-la à l'aide d'un flux d'azote. Placez la puce en or dans une chambre à ozone UV pendant 30 minutes afin d'éliminer toute contamination.

Ensuite, ajoutez 150 milligrammes d'acide 11-mercaptoundecanoïque à 20 millilitres d'éthanol dans un tube à essai contenant un bouchon en plastique pour supporter la puce, ainsi qu'une barrette d'agitation, afin d'homogénéiser la solution. Placez la puce dans le tube à essai et fermez-le. Puis, chauffez le tube au micro-ondes à 50 watts et 50 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Avec de l'éthanol, rincez la puce et faites-la tremper dans de l'éthanol pendant cinq minutes. Répétez le rinçage à l'eau et faites tremper pendant cinq minutes. Ajoutez 150 milligrammes de 1-Éthyl-3-carbodiimide à 20 millilitres d'eau dans un tube à essai contenant une barre d'agitation.

Transférez la puce dans le tube à essai et faites chauffer au micro-ondes comme vient de l'être démontré. Rincez la puce à l'eau et faites-la tremper pendant cinq minutes dans l'eau. Ajoutez ensuite 150 milligrammes de N-hydroxysuccinimide à 20 millilitres d'eau dans un tube à essai contenant un barreau d'agitation.

Ajouter la puce dans l'ampoule, la sceller avec un bouchon et passer au micro-ondes. Après avoir rincé et trempé la puce dans l'eau comme précédemment, ajouter 250 micromolaire de polyéthylène glycol dans 20 millilitres d'eau dans une ampoule contenant un barreau d'agitation. Ajouter la puce et passer au micro-ondes, puis rincer et tremper dans l'eau comme auparavant.

Préparez une solution d'anticorps anti-hGH à raison de 15 microgrammes par millilitre, ainsi qu'un anticorps anti-IgG comme témoin négatif, puis ajoutez 10 microlitres de chaque solution dans des puits distincts d'une plaque de 384 puits. Concevez le motif de dépôt dans le microdispenseur et, à l’aide d’un embout en téflon de 500 micromètres, déposez les anticorps sur la puce. Incubez la puce imprimée à température ambiante et à 75 % d'humidité pendant deux heures.

Après avoir configuré l'expérience de SPRi et bloqué la puce conformément au protocole décrit, préparez une solution de rhGH à l'aide de la série de concentrations suivante dans du PBS contenant 10 % de sérum et un milligramme par millilitre de BSA. Il est important d'insister sur le type de molécule de blocage choisie à cette étape, étant donné que l'objectif est de minimiser les interactions non spécifiques.

Préparez une solution deux pour un en ajoutant un microlitre d'anticorps de détection anti-hGH marqués à la biotine (six micromolaires) à trois microlitres de points quantiques proches du domaine infrarouge, conjugués à la streptavidine (un micromolaire), dans un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre. Injectez 150 microlitres de solution de sérum humain additionné d'hGH dans la boucle d'injection. Une forte augmentation du signal sera suivie d'une diminution lente due au rinçage de l'adsorption non spécifique du sérum à la surface.

Une fois que le signal est stabilisé, utilisez une solution de chlorure de sodium à 450 millimolaire, ajoutée au tampon de lavage, pour laver la surface. Diluez à l’aide du tampon de lavage la solution d’anticorps de détection anti-rhGH et de points quantiques à une concentration de 10 nanomolaire, puis injectez-la dans la cellule d’écoulement. Importez les données dans un logiciel d’analyse.

Ensuite, tracez le signal SPRi en fonction du temps et déterminez la différence entre les taches d'anticorps anti-rhGH et celles de l'anticorps témoin négatif après le lavage au sel concentré. Pour réaliser le ELISA, après avoir préparé les réactifs, les puits revêtus d'anticorps et les étalons conformément au protocole décrit, préparez les échantillons d'hormone rhGH dans un sérum humain à 10 % aux concentrations suivantes. Ajoutez 50 microlitres de chaque étalon, témoin et échantillon dans chaque puits en triple exemplaire.

Scellez ensuite les puits et incubez à quatre degrés Celsius avec agitation douce toute la nuit. Le jour suivant, retirez la plaque de l'agitateurs et laissez-la atteindre la température ambiante. Portez l'anticorps anti-rhGH marqué à la peroxydase, le tampon de conjugué, le tampon de lavage, le chromogène tétraméthylbenzidine (TMB) et le réactif d'arrêt à température ambiante.

Pour préparer les réactifs de travail, utilisez le tampon de conjugaison pour effectuer une dilution 40x de l'anti-rhGH HRP. Utilisez de l'eau distillée pour diluer le tampon de lavage 200x. Ajoutez 50 microlitres de conjugué anti-rhGH HRP dans chaque puits.

Sceller les puits et incuber à température ambiante pendant 30 minutes avec agitation douce. Verser la solution des puits, retourner la plaque et tapoter pour sécher sur du papier absorbant. Ajouter 200 microlitres de tampon de lavage dans chaque puits, puis verser à nouveau et tapoter pour sécher.

Répétez le lavage trois fois. Il est important de tapoter la plaque de 96 puits afin d'éliminer les agents accessoires, car se fier uniquement à la pipette n'est pas efficace. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de chromogène dans chaque puits, dans les 15 minutes suivant l'étape de lavage.

Incuber à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 30 minutes en agitant doucement. Les solutions incolores deviendront bleues. Ajouter 100 microlitres du réactif d'arrêt dans chaque puits.

Les solutions passeront du bleu au jaune. Utilisez un lecteur de plaque à 450 nanomètres pour mesurer immédiatement l'absorbance de chaque puits. Enfin, tracez la courbe standard pour les étalons fournis, puis reportez la densité optique du rhGH dans les échantillons contenant 10 % de sérum, en fonction de la concentration de chaque échantillon.

Dans cette vidéo, les performances de la SPRi et de la nano-SPRi ont été comparées à celles du test ELISA pour la détection de l'hormone de croissance recombinante (rhGH). Cette figure représente la courbe de titrage de la rhGH ajoutée à un sérum humain à 10 %, tracée en fonction de la D.O. obtenue à 450 nanomètres. Une bonne réponse linéaire a été observée, et la limite de détection a été déterminée à un nanogramme par millilitre.

Ici, la détection de l'hGH recombinante a été évaluée par SPRi. Chaque point de la courbe de gradient de concentration représente la valeur moyenne de la différence de réflectivité calculée à partir de trois courbes cinétiques SPRi pour chaque concentration. La limite de détection, ou LoD, a été déterminée à 3,61 nanogrammes par millilitre.

Pour augmenter la sensibilité du biosenseur SPRi, des nano-amplificateurs ont été introduits séquentiellement sur le capteur. Dans cette expérience, les nano-amplificateurs ont amplifié la réponse du biosenseur jusqu'à 7,9 %, tout en provoquant une variation de signal minimale sur le témoin. La praticabilité du biosenseur nano-SPRi a été évaluée en mesurant une gamme de rhGH allant de 0,25 à 30 000 picogrammes par millilitre.

La DL a été calculée à 9,2 picogrammes par millilitre, et le coefficient de variation était de 20 %. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure pour une détection directe, et en deux heures pour la nano-SPRi, si elle est correctement effectuée. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de se souvenir d'optimiser les conditions à chaque étape, et après cette optimisation, les résultats peuvent être facilement reproduits en une durée plus courte. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la multi-tuff ou l'analyse maspeck peuvent être réalisées directement sur la puce après une expérience de SPRi, afin de vous fournir des informations supplémentaires sur la molécule capturée.

Après son développement, cette technique devrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine du diagnostic médical pour explorer la détection simultanée de plusieurs biomarqueurs liés aux troubles cancéreux, neurologiques et cardiovasculaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mettre en place un test SPRi, un nano-SPRi et un test ELISA pour la détection des niveaux de GH humaine dans le sérum humain. N'oubliez pas que manipuler des réactifs peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.