Name: La cartographie du génome à léchelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez la méthode COSMIC pour cartographier les interactions médicament-ADN à l'échelle du génome dans les cellules. Cette technique permet de mesurer directement les liaisons ligand-ADN et d'étudier les mécanismes d'action des polyamides et autres petites molécules ciblant l'ADN.

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Nous remercions les membres du laboratoire Ansari et le professeur Parameswaran Ramanathan pour les discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions NIH CA133508 et HL099773, la bourse de la faculté H. I. Romnes et le prix de recherche médicale W. M. Keck à A.Z.A. G.S.E. a été soutenu par une bourse Peterson du Département de biochimie et de biosciences moléculaires Grant NIH T32 GM07215. A.E. a été soutenu par la bourse d’études supérieures Morgridge et la bourse du Centre de cellules souches et de médecine régénérative, et D.B. a été soutenu par la subvention NSEC de la NSF.

1. La réticulation dans des cellules vivantes <ol><li> Commencer par 2,5x10 ~ 7 cellules H1, ​​ou d&#39;autres cellules en culture. NOTE: Ce nombre de cellules H1 correspond à cinq plats de 10 cm (environ 40% de confluence). </li><li> Produire des cellules dans E8 médias sur des plats revêtus sur une surface qui soutient les cellules souches pluripotentes (voir list des matériaux) et les incuber à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. Cellules de récolte enzymatique (voir liste matériaux). Remarque: Ne laissez pas les cellules de H1 à dépasser 90% de confluence; confluence induit la différenciation spontanée des cellules H1. Pour compter les cellules, de grandir un 10 cm extra plat de cellules, lever les cellules enzymatique tels que décrits dans les sections 1.8-1.10, et les compter avec un hémocytomètre. <ol><li> Préparer E8 milieux de culture comme décrit dans Chen et al. 54 </li></ol></li><li> Avant d&#39;ajouter polyamide, retirez le support de culture passé avec une pipette Pasteur attaché à un piège à vide. Ajouter des médias frais avec commepipette erological et la pipette distributeur (8 ml par 10 cm plat). NOTE: Ajouter des médias sur le côté de la boîte afin d&#39;éviter de perturber les cellules. De ce point en avant de protéger les cellules de la lumière pour éviter prématurée photo-réticulation. </li><li> Ajouter polyamide avec une pipette (8 ul de 400 uM dans du DMSO, polyamide 400 nM concentration finale) directement au milieu de culture de chaque plat. Agiter le plat pour disperser le polyamide uniformément dans les médias. NOTE: La concentration peut être variée, mais veiller à ce qu&#39;aucune toxicité cellulaire est observé pour le traitement choisi. </li><li> Incuber les cellules 24 h 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2, et de veiller à ce qu&#39;ils soient protégés de la lumière. NOTE: Le temps d&#39;incubation peut être modifiée pour mesurer la liaison à travers le temps polyamide. </li><li> Laver chaque plat de 10 cm avec 4 ml de PBS (1,05 mM de phosphate de potassium monobasique, le chlorure de sodium 155,17 mM, 2,97 mM de phosphate de sodium dibasique) en utilisant une pipette et pipette sérologique de disPenser. Aspirer le PBS et ajouter 3 ml E8 milieux de culture. </li><li> Avec les lumières se sont éteintes, retirez le couvercle de 5 boîtes de culture et de placer les cellules sur une surface plane à l&#39;extérieur de la hotte. Placez un filtre de verre au cours des 5 boîtes de culture pour filtrer la lumière avec λ &lt;300 nm. Placer la source UV sur le dessus du filtre. Échantillons de reticulation 30 min à 365 nm irradiation UV (2,4 mW / cm 2). REMARQUE: Le temps de réticulation doit être déterminée de manière empirique. </li><li> Transfert des boîtes de culture de retour à la hotte. Aspirer les médias avec une pipette Pasteur attaché à un piège à vide. Lavez chaque plat de 10 cm avec 4 ml de PBS. Aspirer le PBS. Ajouter 3 ml enzyme pour la dissociation cellulaire (voir liste matériaux) par 10 cm plat pour dissocier les cellules. Incuber 5 min à 37 ° C. REMARQUE: Ne pas préchauffer l&#39;enzyme. </li><li> Étancher l&#39;enzyme avec 3 ml E8 médias par plat. Transfert dissocié cellules dans un tube conique de 15 ml. NOTE: La place des cellules sur la glace partir de ce point. </li><li> CentriFuge dissocié cellules 5 min, 500 g à 4 ° C. Aspirer le surnageant pour éliminer l&#39;enzyme et les médias. NOTE: Mettre en pause le point. Les cellules peuvent être congelées instantanément dans de l&#39;azote liquide, stocké à -80 ° C pour un traitement ultérieur à un moment ultérieur. </li></ol> 2. Isolement de la chromatine <ol><li> Ajouter 1,2 ml de tampon COSMIC (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% de Triton-X100, 0,1% de SDS) et la pipette de haut en bas plusieurs fois pour remettre en suspension le culot de cellules pour chaque échantillon dans 1,2 ml de tampon cosmique. <ol><li> Ajouter 133 ul de chacun des 100 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 100 mM de benzamidine, pepstatine et 150 uM inhibiteurs de la protéase frais jusqu&#39;à une concentration finale de 1 mM de PMSF et de benzamidine et 1,5 pM pour la pepstatine. Solution scission de lysat cellulaire en deux ambre 1,7 ml microtubes. </li></ol></li><li> Soniquer avec sonicateur 35 min (10 sec sur 10 sec éteint, 60% de la puissance) la fragmentation du génome entre 100 unend 500 pb. <ol><li> Maintenir le niveau de solution dans la chromatine microtube parallèle au niveau de l&#39;eau dans le réservoir. Confirmez ce niveau par une inspection visuelle. NOTE:. Vérifiez que l&#39;ADN a été cisaillé avec un gel agarose à 1,5% 55 </li><li> Optimiser le temps de traitement par ultrasons de manière empirique. Utilisez une quantité minimale de la glace dans le réservoir pour refroidir les échantillons, et d&#39;assurer la glace ne se mêle pas entre les échantillons et la corne de tasse. </li></ol></li><li> Centrifugeuse l&#39;échantillon de 12.000 xg 10 min. Enregistrer la solution aqueuse qui contient de la chromatine soluble en le transférant à un nouveau tube à centrifuger ambre avec une pipette. Jeter le culot. </li><li> Transférer 110 pi (10%) de l&#39;échantillon à un nouveau tube et l&#39;étiqueter ADN entrée. Conserver à -80 ° C. Enregistrez le reste de l&#39;échantillon de la chromatine sur la glace pour une utilisation dans l&#39;étape 3.3. </li></ol> 3. La capture de ligand ADN Crosslinks <ol><li> Utiliser une pipette pour distribuer 60 pi streptavidin-billes magnétiques revêtues dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 1 ml de tampon COSMIC et mélanger sur un min nutator 5 à température ambiante. Placez billes magnétiques sur la séparation magnétique en rack 2 min pour capturer perles. Retirer tampon cosmique avec une pipette. NOTE: Ne pas laisser les perles se dessécher. Procéder immédiatement à l&#39;étape suivante. </li><li> Ajouter échantillon chromatine (~ 1 ml) à des billes (60 pi) et remettre les perles. Incuber chromatine avec des billes magnétiques revêtues de streptavidine au moins 4 h sur une rotation, mélangeur à bascule à 4 ° C. Incuber les échantillons O / N, si désiré. </li></ol> 4. Isolement de l&#39;ADN purifié par affinité <ol><li> Lavez perles avec 7 intervalle de minutes à température ambiante avec les tampons de lavage suivantes pour supprimer les interactions non spécifiques. Utilisez un rack de séparation magnétique pour capturer perles après chaque lavage. Remettre en suspension les perles après chaque changement de tampon de lavage. </li><li> Préparer tampons de lavage à l&#39;eau déminéralisée distillée et le filtre (0,2 um) avant utilisation. Tampons de lavage de magasin 1 et 2 à 4 ° C pour slusieurs mois. Préparer le tampon de lavage 3 frais chaque jour. Ajouter et supprimer des tampons de lavage de l&#39;échantillon avec une pipette. Pour 2 et 4, ajouter 1 et 3 (5 mM), respectivement, dans les lavages. Les échantillons peuvent en outre être lavées deux fois avec du tampon COSMIC (une fois 12 heures, une fois 4 heures) avant les lavages ci-dessous. <ol><li> Laver une fois avec du tampon de lavage 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], EDTA 1 mM, 3% de SDS). Laver une fois avec du tampon de lavage 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM de LiCl, 1 mM d&#39;EDTA, 0,5% de NP40, du désoxycholate de sodium à 1%). Laver deux fois avec du tampon de lavage 3 (4 M d&#39;urée, 10 mM de Tris-Cl [pH 7,5], EDTA 1 mM, 0,1% de NP-40). Laver deux fois avec du Tris EDTA (TE) du tampon (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], EDTA 1 mM). </li></ol></li><li> Remettre en suspension les billes dans du tampon TE 200 pi avec une pipette. Cet échantillon de l&#39;ADN capturé est appelé (AP) de l&#39;ADN purifié par affinité. </li><li> Compléter l&#39;ADN d&#39;entrée et AP 10x Crosslink Reprise tampon (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) à 1x concentration finale. 56,57 incuber 30 min à 90 ° C. REMARQUE: 254 nm irradiation UV peut également être utilisé pour inverser la reticulation psoralène, 58 mais cyclobutyle dimères de pyrimidine peuvent être formés à partir d&#39;une irradiation à cette longueur d&#39;onde et d&#39;interférer avec le traitement en aval de l&#39;ADN. </li><li> Pour AP ADN, placer le tube à centrifuger contenant l&#39;échantillon sur la séparation magnétique en rack 2 min à température ambiante et en isolant liquide (ADN) avec une pipette. Transférer l&#39;ADN AP (qui a été libéré par les perles) dans un nouveau tube à centrifuger ambre. NOTE: L&#39;ADN désiré est AP dans le liquide, plus attaché aux billes. </li><li> Neutraliser entrée AP et de l&#39;ADN avec du HCl concentré à pH 7 par addition d&#39;environ 1 ul de HCl 6 N par 100 ul de l&#39;échantillon avec une pipette. Confirmer les échantillons sont neutralisés en ajoutant ~ 0,5 pi sur du papier pH avec une pipette. ATTENTION: HCl concentré est un acide corrosif forte. Poignée selon votre institution217; s lignes directrices pour l&#39;équipement de protection individuelle approprié. </li><li> Ajouter la RNase A (100 mg / ml) à 0,2 pg / pl de concentration finale et à la fois l&#39;entrée AP de l&#39;ADN. Incuber 1 heure à 37 ° C. Ajouter à la protéinase K (20 mg / ml) à 0,2 pg / pl de concentration finale et à la fois l&#39;entrée AP de l&#39;ADN, ajouter. Incuber 1 heure à 55 ° C. </li><li> Purifier l&#39;ADN avec un kit colonne d&#39;ADN de nettoyage (voir la liste des matériaux). 55 Elute ADN dans 58 ul d&#39;ADN de qualité H 2 O. Échantillons d&#39;entrée de magasin et AP à -20 ou -80 ° C </li><li> Analyser AP ADN par réaction quantitative en chaîne par polymerase (PCR quantitative) avec des amorces spécifiques de locus, et / ou par séquençage de nouvelle génération. Pour qPCR, en utilisant 2 ul ADN AP par locus avec les paramètres suivants: 1 cycle de 95 ° C 10 min et 40 cycles de 95 ° C 20 sec, 54 ° C ou 56 ° C 20 sec, 72 ° C 40 sec. REMARQUE: La température de recuit doit être modifiée en fonction de la température de fusion des paires d&#39;amorces utilisées. Sélectionnez une tempéra de recuitre qui minimise le cycle de quantification sans amplification non spécifique. REMARQUE: Pour l&#39;analyse par séquençage de prochaine génération, viser au moins 10 millions mappé lit. Le nombre de lectures mappé peut être augmentée en augmentant la quantité d&#39;ADN AP et en combinant moins d&#39;échantillons dans une course pour le séquençage. Plus lectures améliorer la sensibilité. Ensembles standard pour l&#39;analyse ChIP-seq (par exemple, Homère, 59 MACS, 60 et 61 SPP) travaillent avec des données COSMIC-seq. Comme avec d&#39;autres méthodes qui reposent sur le séquençage de prochaine génération, y compris le séquençage du génome et Chip-Seq, régions répétitives créer des ambiguïtés dans l&#39;alignement et l&#39;assemblage et restent donc un défi technique. </li></ol>

A.Z.A. est l’unique propriétaire de Vista Motif, LLC et WINStep Forward.

L’un des principaux défis de la ChIP conventionnelle est l’identification d’anticorps appropriés. La ChIP dépend fortement de la qualité de l’anticorps, et la plupart des anticorps commerciaux sont inacceptables pour la ChIP. En fait, le consortium ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) a constaté que seulement 20 % des anticorps commerciaux convenaient aux tests ChIP. 50 Avec COSMIC, les anticorps sont remplacés par la streptavidine. Parce que les polyamides sont fonctionnalisés avec de la biotine, la streptav...

Les informations de rendre chaque cellule dans le corps humain est codé dans l&#39;ADN. L&#39;utilisation sélective de l&#39;information régit le destin d&#39;une cellule. Les facteurs de transcription (TF) sont des protéines qui se lient à des séquences spécifiques d&#39;ADN pour exprimer un sous-ensemble particulier de gènes dans le génome, et le mauvais fonctionnement de TFS est liée à l&#39;apparition d&#39;un large éventail de maladies, y compris les défauts de développement, le cancer et le diabète . 1,2 Nous avons été intéressés par le développement de molécules qui peuvent se lier sélectivement à la génomique et de moduler les réseaux de régulation génétique. Polyamides composés de N et N -méthylimidazole -methylpyrrole sont des molécules qui peuvent cibler l&#39;ADN avec des spécificités et des affinités que les facteurs de transcription naturels rival. 3-6 Ces molécules se lient à des séquences spécifiques dans le sillon de l&#39;ADN conçu rationnellement. 4,5,7 -11 polyamides ont été employées à la fois réprimer et activer l&#39;expression de g spécifiqueEnes. 4,12-19 Ils ont aussi intéressants antiviraux et anticancéreux 20-24 12,13,25-30 propriétés. Une caractéristique intéressante de polyamides est leur capacité à accéder à des séquences d&#39;ADN qui sont méthylés 31,32 et enroulé autour de protéines histones 9,10,33. Pour mesurer les spécificités de liaison complets de molécules de liaison à l&#39;ADN, notre laboratoire a créé la méthode apparentée identifiant du site (CSI). 34-39 L&#39;apparition prévue de sites de liaison basées sur des spécificités (genomescapes) in vitro peuvent être affichées sur le génome, parce que la in vitro intensités de liaison sont directement proportionnelles à constantes d&#39;association (K a). 34,35,37 Ces genomescapes donnent un aperçu de polyamide occupation à travers le génome, mais polyamide mesurant la liaison dans les cellules vivantes a été un défi. ADN est bien emballé dans le noyau, ce qui pourrait influer sur l&#39;accessibilité des sites de liaison. Le Accessibilité de ces séquences d&#39;ADN chromatinized à polyamides reste un mystère. Récemment, de nombreuses méthodes pour étudier les interactions entre les petites molécules et les acides nucléiques ont émergé. 40-48 La capture d&#39;affinité chimique et séquençage de l&#39;ADN massivement parallèle (chem-SEQ) est une telle technique. Chem-seq utilise le formaldehyde pour réticuler petites molécules sur une cible génomique d&#39;intérêt et un dérivé biotinylé d&#39;une petite molécule d&#39;intérêt à capter l&#39;interaction ligand-cible. 48,49 Formaldéhyde réticulation conduit à des interactions indirectes qui peuvent produire des faux positifs. 50 Nous avons développé une nouvelle méthode, la réticulation de petites molécules d&#39;isoler la chromatine (COSMIC), 51 avec un photoréticulant pour éliminer ces soi-disant pics &quot;fantômes&quot;. 50 Pour commencer, nous avons conçu et synthétisé des dérivés trifonctionnels de polyamides. Ces molécules contenaient une pol de liaison à l&#39;ADNyamide, un photoréticulant (psoralène), et une poignée d&#39;affinité (biotine, figure 1). Avec polyamides trifonctionnels, on peut de manière covalente capturer interactions polyamide-ADN avec 365 nm irradiation UV, une longueur d&#39;onde qui ne nuit pas à l&#39;ADN ou l&#39;induit non-psoralène à base de reticulation. 51 Ensuite, on fragmente le génome et purifier l&#39;ADN capturé sous stricte, semi -denaturing conditions pour diminuer l&#39;ADN qui est lié de manière non covalente. Ainsi, nous considérons cosmique comme une méthode liée à Chem-seq, mais avec une lecture plus directe de l&#39;ADN de ciblage. Fait important, la faible (K 10 3 -10 4 M -1) affinité pour l&#39;ADN de psoralène ne pas détectable incidence polyamide spécificité. 51,52 Les fragments d&#39;ADN peuvent être analysés enrichies soit par polymérase quantitative réaction en chaîne 51 (COSMIC-qPCR) ou par séquençage de prochaine génération 53 (COSMIC-seq). Ces données permettent une conception impartiale, génome guidée de ligands qui entreagir avec leur loci génomiques désiré et minimiser les effets hors-cible. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figure 1. polyamides bioactifs et plan cosmique. Épingle à cheveux (A) les polyamides 1-2 cible la séquence d&#39;ADN 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Polyamides linéaires 3 - 4 cibles 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Anneaux de N-méthylimidazole sont en gras pour plus de clarté. Les cercles vides et pleins représentent N et N -méthylimidazole -methylpyrrole, respectivement. Place représente 3-chlorothiophène, et les diamants représentent β-alanine. Psoralène et la biotine sont désignés par P et B, respectivement. (B) plan cosmique. Les cellules sont traitées avec les dérivés trifonctionnels de polyamides. Après réticulation par irradiation UV à 365 nm, les cellules sont lADN génomique et ysed est cisaillée. Des billes magnétiques revêtues de streptavidine sont ajoutées à saisir des produits d&#39;addition polyamide-ADN. L&#39;ADN est libéré et peut être analysé par PCR quantitative (qPCR) ou par séquençage de prochaine génération (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>D’autres sources peuvent être utilisées</td></tr><tr><td> : StemPro Accutase, Cell Dissociation Reagent</td>, <td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Nous avons essayé d’autres fabricants de colonnes d’ADN avec succès.</td></tr><tr><td>TruSeq ChIP Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>Ce kit peut être utilisé pour préparer l’ADN COSMIQUE pour le séquençage de nouvelle génération</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Utilisé pour revêtir des plaques afin de cultiver H1 ESCs</td></tr><tr><td>Papier</td> pH <td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation ambrés</td><td>N’importe quelle source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtre pyrex</td><td>toute source</td><td></td> Les <td>plats de cuisson en pyrex sont adaptés</td></tr><tr><td>qPCR master mix</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (6 N)</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture tissulaire de 10 cm</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette</td><td>n’importe quelle source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 ml</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>n’importe quelle source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>n’importe quelle source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnétique rack de séparation</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Source UV</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>D’autres sources UV peuvent être utilisées, mais le temps de réticulation doit être optimisé empiriquement</td></tr><tr><td>Sonicateur Misonix</td><td>Qsonica</td><td>S4000 avec corne de tasse 431C1</td><td>D’autres sonicateurs peuvent être utilisés, mais les conditions de sonication doivent être optimisées empiriquement</td></tr><tr><td>Incubateur CO2 humidifié</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de sécurité biologique avec sortie de vide</td><td>toute source</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la cartographie du génome à l&#39;échelle du médicament-adn interactions dans les cellules avec cosmic (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Le génome est la cible de certains agents chimiothérapeutiques les plus efficaces, mais la plupart de ces médicaments manquer de spécificité de séquence d&#39;ADN, ce qui conduit à la dose-limitant la toxicité et d&#39;effets secondaires indésirables. Le ciblage du génome de petites molécules spécifiques de séquence peut permettre molécules ayant un indice thérapeutique accru et moins d&#39;effets hors cible. -methylpyrrole N / N -méthylimidazole polyamides sont des molécules qui peuvent être rationnellement conçus pour cibler des séquences d&#39;ADN spécifiques avec précision exquise. Et contrairement à la plupart des facteurs de transcription naturels, les polyamides peuvent se lier à l&#39;ADN méthylé et chromatinized sans perte d&#39;affinité. La spécificité de séquence de polyamides a été largement étudié in vitro avec l&#39;identification du site apparenté (CSI) et avec des approches biochimiques et biophysiques traditionnels, mais l&#39;étude de polyamide se lier à des cibles génomiques dans les cellules reste insaisissable. Nous rapportons ici une méthode, la réticulation de petites molécules pour Isolate chromatine (COSMIC), qui identifie les sites de liaison de polyamide à travers le génome. Cosmique est similaire à immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), mais diffère de deux manières importantes: (1) un photoréticulant est utilisé pour permettre sélectif capture, temporellement contrôlée par des événements de liaison de polyamide, et (2) la poignée d&#39;affinité de la biotine est utilisée pour purifier le polyamide -ADN conjugués dans des conditions semi-dénaturantes pour diminuer l&#39;ADN qui est lié de manière non covalente. Cosmique est une stratégie générale qui peut être utilisée pour faire apparaître les événements de liaison du génome entier de polyamides et d&#39;autres agents chimiothérapeutiques du génome de ciblage.

Pour tenir compte des non-uniforme génome fragmentation et d&#39;autres variables, l&#39;ADN purifié doit toujours être normalisé contre une référence de l&#39;ADN d&#39;entrée. Des amorces spécifiques à un locus d&#39;intérêt peuvent être utilisés. Il est utile d&#39;analyser aussi un lieu où ne devrait pas se lier à la molécule, en tant que témoin négatif. Nous voyons une augmentation de&gt; 100 fois en occupation polyamide lors de l&#39;irradiation avec de la lumière de 365 nm (Figure 2). <p clas...

Identifier les cibles directes de molécules du génome ciblage reste un défi majeur. Pour comprendre comment les molécules de liaison à l&#39;ADN engagent le génome, nous avons développé une méthode qui repose sur la réticulation de petites molécules à isoler la chromatine (COSMIC).

La cartographie du génome à l&#39;échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer les profils d'interaction à l'échelle du génome des polyamides et d'autres petites molécules ciblant l'ADN dans les cellules. Cette méthode peut contribuer à faire progresser le domaine de la chimie médicamenteuse de l'ADN en utilisant le génome comme guide pour concevoir des molécules ciblant l'ADN. Le principal avantage de cette technique réside dans la mesure directe des interactions ligand-ADN, ce qui permet d'obtenir des informations sur le mécanisme d'action des ligands agissant sur le génome.Certains des agents thérapeutiques les plus efficaces sont des molécules de petite taille qui se lient à l'ADN et interfèrent avec les transactions génomiques. Bien que cette méthode ait été développée pour étudier les polyamides, elle peut également être appliquée à d'autres classes de molécules ciblant l'ADN. Les cellules utilisées pour cette expérience sont cultivées dans un milieu E8 sur des boîtes de 10 cm, munies d’un revêtement de surface permettant la croissance des cellules souches pluripotentes, à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone.Avant d'ajouter le polyamide, retirez le milieu de culture usagé et ajoutez 8 ml de milieu frais par boîte de Pétri de 10 cm. À partir de ce moment, protégez les cellules de la lumière afin d'éviter un photo-croisement prématuré. À l’aide d’une pipette, ajoutez le polyamide directement dans le milieu de culture de chaque boîte.Faire tourbillonner la boîte pour répartir uniformément le polyamide dans le milieu. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures, en veillant à les protéger de la lumière. Le jour suivant, laver chaque boîte de 10 cm avec 4 ml de PBS à l’aide d’une pipette sérologique et d’un distributeur de pipette.Aspirez le PBS et ajoutez 3 ml de milieu de culture E8. Dans une pièce aux lumières tamisées, placez les cellules sur une surface plane à l’extérieur de la hotte et retirez les couvercles des cinq boîtes de culture. Placez un filtre en verre sur les cinq boîtes de culture afin de filtrer la lumière dont la longueur d’onde est inférieure à 300 nanomètres.Placer la source UV sur le filtre. Réticuler les échantillons pendant 30 minutes avec un rayonnement UVA de 365 nanomètres. Après l'irradiation UVA, replacer les boîtes de culture dans la hotte.Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette Pasteur reliée à un piège sous vide et lavez chaque plaque de 10 cm avec 4 ml de PBS. Aspirez le PBS puis ajoutez 3 ml d’enzyme de dissociation cellulaire par plaque de 10 cm. Incubez cinq minutes à température ambiante.Arrêter l'action de l'enzyme avec 3 ml de milieu E8 par boîte. Transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 ml. Placer les cellules sur glace à partir de ce moment.Centrifuger les cellules dissociées à 500 x g et à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le surnageant afin d'éliminer l'enzyme et le milieu. Pour commencer la procédure d'isolement de la chromatine, préparer le tampon cosmic avec des inhibiteurs de protéases frais.Ajouter 12,1 µL de chacun des inhibiteurs de protéase PMSF à 100 millimolaire, benzamidine à 100 millimolaire et pepstatine à 150 micromolaire, fraîchement préparés, au tampon cosmique basal. Ajouter 1,2 mL du tampon cosmique au culot cellulaire et pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour le resuspendre. Puis répartir la solution cellulaire dans deux tubes micro-centrifuge ambrés de 1,7 mL.Soniquez à l’aide d’un sonicateur afin de fragmenter le génome en fragments de taille comprise entre 100 et 500 paires de bases. Maintenez le niveau de la solution de chromatine dans le tube de microcentrifugeuse parallèle au niveau de l’eau dans le réservoir. Vérifiez ce niveau par inspection visuelle.Le temps de sonication a été optimisé de façon empirique : soniquer à 60 % de puissance, 10 secondes activé et 10 secondes désactivé, pendant 35 minutes. Utiliser une quantité minimale de glace dans le réservoir pour refroidir les échantillons, et s'assurer que la glace n'entrave pas le contact entre les échantillons et le cornet. Une fois la sonication terminée, centrifuger l'échantillon à 12 000 g pendant 10 minutes.Conserver la solution aqueuse contenant la chromatine soluble en la transférant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse brun. Jeter le culot. Transférer 110 microlitres ou 10 % de l'échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.Étiquetez-le comme ADN d'entrée et stockez-le à 80 degrés Celsius. Conservez le reste de l'échantillon de chromatine sur de la glace pour l'utiliser dans les étapes suivantes de ce protocole. Pour capturer les liaisons covalentes ligand-ADN, ajoutez le reste de l'échantillon de chromatine aux billes magnétiques revêtues de streptavidine et remettez le mélange en suspension.Incuber la chromatine avec les billes pendant au moins quatre heures sur un mélangeur rotatif à 4 degrés Celsius. Le tampon de lavage requis doit être préparé dans de l’eau distillée désionisée et filtré à l’aide d’un filtre de 0,2 micromètre avant utilisation. Les tampons 1 et 2 peuvent être conservés à 4 degrés Celsius pendant plusieurs mois, mais le tampon 3 doit être préparé frais chaque jour.Lorsque l'incubation de la chromatine avec les billes magnétiques revêtues de streptavidine est terminée, laver l'échantillon pendant sept minutes avec le tampon de lavage 1. Placer l'échantillon dans un support de séparation magnétique pour capturer les billes et éliminer le tampon de lavage 1. Ajouter le tampon de lavage 2 et laver pendant 7 minutes supplémentaires.Ensuite, laver deux fois avec le tampon de lavage 3 pendant sept minutes par lavage. Enfin, laver deux fois avec le tampon TE. Après le dernier lavage au tampon TE, resuspendre les billes dans 200 microlitres de tampon TE.Cet échantillon d'ADN capturé est appelé ADN purifié par affinité ou ADN AP. Ensuite, ajoutez à l'ADN témoin et à l'ADN AP du tampon de réversion de la réticulation 10x pour obtenir une concentration finale de 1x. Incubez pendant 30 minutes à 90 degrés Celsius.Placer le tube de microcentrifugation contenant l'ADN AP sur le support de séparation magnétique pendant deux minutes à température ambiante, puis transférer le liquide contenant l'ADN AP dans un nouveau tube de microcentrifugation ambré. Après avoir neutralisé l'ADN témoin et l'ADN AP, ajouter la RNase A aux deux échantillons d'ADN à une concentration finale de 0,2 microgramme par microlitre. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius.Ajouter, après une heure, la protéinase K à l'ADN témoin et à l'ADN AP pour obtenir une concentration finale de 0,2 microgramme par microlitre. Incuber pendant une heure à 55 degrés Celsius. Ensuite, l'ADN témoin et l'ADN AP sont purifiés à l'aide d'un kit de purification sur colonne d'ADN et élus dans de l'eau de qualité ADN.Conserver l'ADN à 20 ou 80 degrés Celsius jusqu'à son utilisation pour l'analyse. L'ADN purifié par affinité doit toujours être normalisé par rapport à une référence d'ADN d'entrée. Des résultats représentatifs de PCR quantitative avec des amorces spécifiques du locus montrent un accroissement supérieur à 100 fois de l'occupation par le polyamide après irradiation avec une lumière de 365 nanomètres.L'ADN enrichi peut également être analysé par séquençage de nouvelle génération. Une fois le séquençage effectué, les lectures brutes d'ADN sont alignées sur le génome et des pistes de densité sont générées. Cet exemple montre la piste de densité pour le polyamide linéaire 4 conçu pour cibler les répétitions AAG.Une analyse des distributions des polyamides dans les cellules a révélé que les sites de liaison groupés, couvrant un large éventail d'affinités, prédisent le mieux l'occupation dans les cellules. Un algorithme a été mis au point pour évaluer l'ensemble du génome en matière de liaison à l'aide de données d'identification des sites cognates in vitro. Ces diagrammes en violon montrent les scores prédits pour la liaison du polyamide 2 et du polyamide 4 à travers l'ensemble du génome.Des génomescapes représentatifs pour le polyamide 4 sont également présentés. Cette méthode de notation a révélé que les loci comportant plusieurs séquences de faible et de moyenne affinité montrent une occupation similaire par le polyamide à celle des loci possédant peu de séquences à haute affinité. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement effectuée.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de protéger les échantillons de la lumière jusqu'à ce que l'ADN soit purifié. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la RT-PCR et la RNase C peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'effet de la liaison sur l'expression génique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser cosmic pour cartographier les profils de liaison à l'échelle du génome des polyamides.

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La méthode Salut-C permet l'identification sans parti pris, l'ensemble du génome des interactions chromatine (1). Salut-C couples ligature de proximité et le séquençage massivement parallèle. Les données obtenues peuvent être utilisées pour étudier l'architecture génomique à plusieurs échelles: premiers résultats identifié des caractéristiques telles que les territoires chromosomiques, la ségrégation de la chromatine ouverte et fermée, et la structure de la chromatine à l'échelle mégabase.

Salut-C: une méthode d&#39;étude de l&#39;architecture tridimensionnelle des génomes.

Le piège de chromosomes associés (ACT) dosage est une nouvelle méthode impartiale pour identifier les interactions ADN à longue portée. La caractérisation des interactions ADN à long gamme va nous permettre de déterminer la relation de l'architecture nucléaire à l'expression des gènes dans les deux physiologie normale et dans des états pathologiques.

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Nous décrivons ici un essai en couplant l'identification ADN adénine méthyltransférase (DamID) pour le séquençage à haut débit (DamID-seq). Cette méthode améliorée offre une résolution plus élevée et une plage dynamique plus large, et permet l'analyse des données DamID-Seq en conjonction avec d'autres données de séquençage à haut débit tels que ChIP-seq, ARN-Seq, etc.

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Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

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La cartographie du génome à léchelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine) (Vidéo) | JoVE Journal

La cartographie du génome à l'échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

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