Une stratégie pour valider le rôle des Callose médiée Plasmodesmal Gating dans la réponse Tropic

L’objectif global de cette procédure est de cribler les gènes impliqués dans le déclenchement plasmodesmal médié par la callose pendant la réponse tropique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement des plantes, telles que quels gènes inconnus contrôlent la signalisation de cellule à cellule par les plasmodesmes au cours de la réponse tropique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, qu’elle fonctionne aussi et qu’elle se répète.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à manipuler les hypocotyles étiolés d’Arabidopsis sans aucun dommage pendant tout le processus est un défi. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lors de l’établissement de la règle de GSL8, une glucose synthase en porte plasmodesmale. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les procédures mentionnées dans l’audio n’ont pas expliqué les étapes critiques qui sont difficiles à exécuter car elles nécessitent une configuration et une manipulation spéciales.

Préparez Murashige et Skoog, ou MS medium, un jour avant l’expérience. Autoclavez-le et remplissez des plaques carrées de 125 millimètres avec 50 millilitres de média par plaque. Le lendemain, dotez les graines qui ont été stérilisées avec de l’hypochlorite de sodium à 1,1 % sur des assiettes semi-séchées.

À partir d’une pointe de micropipette de 1 millimètre, parsemez les graines de 200 microlitres d’eau. Disposez les graines en cinq rangées, à 1,8 centimètre de distance, les graines étant espacées d’au moins 0,1 centimètre dans les rangées. Laissez un peu d’eau s’évaporer avant de recouvrir et de sceller les plaques avec du ruban chirurgical.

Enveloppez ensuite les assiettes dans du papier d’aluminium et placez-les dans une boîte. Incuber la boîte à quatre degrés Celsius pendant trois jours. Après trois jours de traitement par le froid, transférez la boîte de graines à 22 degrés Celsius pendant trois jours.

Après trois jours supplémentaires, dans une pièce sombre, vérifiez l’état de germination des graines sous lumière verte. Habituellement, les semis étiolés Col-0 âgés de trois jours atteignent jusqu’à 1,6 centimètre de long. Sous la lumière verte, analysez la réponse phototrope et gravitrope altérée.

À l’aide d’une pioche stérilisée, sélectionnez des semis de taille similaire à croissance droite et verticale. Soulevez doucement les plantules de la partie la plus basse de leur hypocotyle sans toucher d’autres parties. Ensuite, transférez soigneusement les plants sélectionnés dans une plaque de gélose MS fraîche.

Sur la nouvelle plaque, orientez les crochets des plants de la même manière. Sélectionnez au moins 20 semis de chaque patrimoine génétique pour faire chaque rangée, et faites une copie de chaque plaque. Chaque plaque contient deux génotypes sur deux rangées.

Pour vérifier la réponse phototropique, placez les plaques dans une boîte noire de manière à ce que les plantules soient orientées verticalement. Laissez un côté de la boîte ouvert sur le bord des plaques. Ensuite, incubez la boîte dans une chambre de croissance végétale avec une lumière blanche unilatérale.

Pour vérifier la réponse gravitrope, enveloppez les plaques avec du papier d’aluminium et mettez-les dans une boîte noire de sorte que les semis soient horizontaux. À plusieurs moments, généralement à partir de 90 minutes et jusqu’à 12 heures, imagez les plaques dans des conditions de faible luminosité. Utilisez un ensemble de scanners pour collecter des images JPEG de 600 DPI.

Pour mesurer l’angle de flexion des plantules, chargez leurs images dans le logiciel ImageJ. Utilisez l’outil de loupe pour zoomer et faites défiler jusqu’à un semis à analyser. Ensuite, utilisez l’outil d’angle pour mesurer l’angle auquel le plant est plié.

Pour ce faire, double-cliquez avec le bouton gauche sur le point A de la direction de croissance de l’hypocotyle d’origine, puis faites glisser la souris jusqu’au point d’initiation de flexion B.Ensuite, utilisez un clic gauche pour tracer la première ligne. Maintenant, faites glisser la souris du point B à l’extrémité de flexion, point C, et utilisez un clic gauche pour tracer la deuxième ligne, formant un angle, A.L’angle de flexion réel est l’angle B, qui est égal à 180 degrés moins l’angle A.Maintenant, mesurez et enregistrez l’angle A en appuyant sur M sur le clavier. Le fichier de résultat s’ouvrira séparément.

Répétez l’étape précédente pour mesurer le reste des semis et mesurez l’angle moyen de deux arrière-plans différents à l’aide du fichier tableur de l’ensemble de données. La préparation des blocs d’agarose HPTS nécessaires à cet essai est couverte dans le protocole texte. Commencez par préparer les échantillons de plantes.

Dans cet exemple, les mutants avec une limite d’exclusion de taille de plasmodesmes modifiée sont analysés. Tout d’abord, créez une plate-forme pour le test. Placez une lame de couverture de microscope sur une nouvelle plaque de support MS.

Ensuite, à partir de plaques MS avec des semis étiolés de trois jours, utilisez des ciseaux chirurgicaux tranchants pour exciser soigneusement les plants de la base du crochet et les transférer dans le verre de couverture. Transférez au moins cinq plants par patrimoine génétique. Orientez les plantules de manière à ce qu’il ne reste que 0,5 centimètre d’hypocotyle à partir de la position d’excision sur la lame de couverture et que le reste de l’hypocotyle touche le milieu.

Ensuite, placez un bloc d’agarose HPTS sur les semis excisés de sorte que la zone excisée soit en contact avec le bloc HPTS. Assurez-vous que le contact est établi. Laissez le bloc reposer sur les hypocotyles pendant cinq minutes.

Ensuite, transférez les hypocotyles dans une boîte de Pétri de 10 millimètres contenant de l’eau doublement distillée et lavez-les en secouant pendant 15 minutes. Ensuite, transférez les plants lavés sur une lame. Placez chaque mutant à côté d’un contrôle pour faire des comparaisons directes.

Couvrez les hypocotyles avec 100 à 150 microlitres d’eau doublement distillée et appliquez une lame de couverture. Maintenant, analysez la lame à l’aide de la microscopie confocale comme décrit dans le protocole texte. Pour ce test, utilisez un colorant fraîchement préparé, âgé de moins de deux jours et conservé à l’obscurité.

Pour inhiber la synthèse de novo de callose, ajoutez 1,5 millimolaire de 2-désoxy-D-glucose au colorant. Commencez cet essai en sélectionnant des plantules étiolées de trois jours pour la coloration callose, avec ou sans réponse tropique. Coupez les semis de leur zone d’hameçon à l’aide de fines ciseaux chirurgicaux.

Ensuite, à l’aide de la pointe d’un cure-dent, transférez les plants dans une petite boîte de Pétri contenant deux millilitres de tampon de coloration. Incuber les semis dans le tampon de coloration à l’obscurité pendant deux heures en secouant continuellement à 30 tr/min. Après la coloration, lavez les semis avec de l’eau bi-distillée pendant deux minutes pour éliminer l’excès de tampon de coloration.

Une fois lavés, sélectionnez au moins cinq semis de chaque arrière-plan pour une analyse confocale. Mesurez l’intensité du signal callose avec le logiciel ImageJ. Ouvrez le fichier de microscopie confocale déjà enregistré au format JPEG dans le logiciel d’imagerie.

Ensuite, à l’aide de l’outil de sélection rectangulaire, faites glisser le curseur sur l’image et sélectionnez la zone à examiner. Ensuite, mesurez et enregistrez les valeurs numériques de l’intensité du signal en appuyant sur M.Le fichier de résultat s’ouvrira séparément. Dans le fichier de résultats, le terme « Mean » indique l’intensité du signal de la zone sélectionnée, et non la moyenne de plusieurs zones.

Un par un, analysez le signal de cette manière pour chaque plantule. Répétez l’étape ci-dessus pour mesurer le reste des semis et mesurez l’angle moyen de deux arrière-plans différents à l’aide du fichier tableur de l’ensemble de données. À l’aide des protocoles décrits, les lignées ARNi inductibles à la dexaméthasone d’AtGSL8 ont été analysées.

Les plantules de DsGSL8 présentaient des défauts évidents de phototropisme et de gravitropisme. Ils n’ont montré aucune flexion sous l’influence de l’une ou l’autre force. Des altérations du mouvement symplasmique ont montré que le mouvement du colorant HPTSA était nettement plus important dans les knockdowns de l’ARNi dsGSL8 que dans les deux témoins.

Le callose est l’un des principaux régulateurs de la limite d’exclusion de taille des plasmodesmes, et AtGSL8 est une callose synthase connue des plasmodesmes. Ainsi, une coloration au bleu d’aniline callose a été effectuée. Dans le témoin, la callose s’est accumulée au bout de six heures, comme indiqué par des flèches jaunes.

Cependant, après six heures, les mutants avaient des niveaux constamment bas de plasmodesmata callose. Cette absence de synthèse de callose était mesurablement moindre dès trois heures après le phototropisme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de faire un dépistage rapide des gènes dans la variante contrôlant le déclenchement plasmodique en raison de la réponse tropique en modulant purement calleux.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ six heures après trois jours de germination des semis d’Arabidopsis. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’éviter d’endommager les semis lors de leur transfert. De plus, il est important d’établir un bon contact entre la gélose et l’hypocotyle pendant le test de chargement.

Après ce développement, cette technique a ouvert la voie à la biologie du développement pour explorer les gènes, de nouveaux gènes, qui jouent un rôle dans le contrôle de la conductivité symplasmique pendant le tropique