Name: Une stratégie pour valider le rôle des Callose médiée Plasmodesmal Gating dans la réponse Tropic (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Découvrez une méthode de criblage génétique pour étudier la régulation des plasmodesmes par la callose lors des réponses tropiques chez Arabidopsis thaliana. Cette technique simple et reproductible permet d'identifier les gènes contrôlant la signalisation cellulaire.

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Cette recherche a été soutenue par la National Research Foundation de Corée (NRF-2015R1A2A1A10053576), et par une subvention du Programme Next-Generation BioGreen 21 (SSAC, accorder PJ01137901), Administration du développement rural, République de Corée. RK, WS, ABB et DK ont été pris en charge par Brain Korea 21 programme Plus (BK21 +).

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</ol>

Les auteurs ont aucune divulgation.

Dans ce manuscrit, une stratégie pour l&#39;écran mutant / over-expression lignes qui sont défectueux dans les réponses phototrophes et gravitropique en raison de callose modifié PD et, par conséquent, PD SEL est décrite en détail. synthèse de callose PD et à la dégradation est principalement accomplie par synthases callose et β-1,3-glucanases, mais la régulation de ces enzymes est contrôlée par de nombreux facteurs en amont. Pour rechercher ces facteurs en amont ou les candidats qui sont directement impliqués dans la r...

Les plantes, comme les organismes vivants sessiles, ont développé un réseau très sophistiqué de la signalisation de cellule à cellule pour traiter divers stimuli environnementaux. Réponses tropique sont l&#39;un des phénomènes par lequel les plantes répondent à des stimuli environnementaux. Les plantes montrent deux principales réponses trophiques, phototropisme et gravitropisme. plantes photosynthétiques courbent vers la source lumineuse par phototropisme pour récolter un maximum d&#39;énergie. De même, gravitropisme rend les plantes à croître vers le centre de gravité. Le mécanisme fondamental qui conduit à ces réponses tropique implique asymétrique formation de gradient de la phytohormone auxine 1. L&#39;acte de formation de gradient de auxine locale est bien caractérisée; les gènes qui sont impliqués dans ce mécanisme constituent un plan d&#39;action de l&#39; hormone de 2-8. La position spécifique des transporteurs d&#39;efflux auxine, tels que PIN FORMÉ (PIN) et les glycoprotéines P, exécute le mouvement de l&#39; auxine à partir du cytoplasme de la paroi cellulaire des cellules donneuses 9,10. Far ailleurs, par la H + / AAI activité symport active des transporteurs d&#39;afflux auxine, tels que les protéines de la famille LAX AUX1 /, l&#39; auxine est finalement délivré aux cellules réceptrices adjacentes 2,11,12. Ce mouvement directionnel d&#39;auxine est connu comme transport de l&#39;auxine polaire (PAT). PAT conduit à une distribution de l&#39; auxine différentielle à divers stades de développement et en réponse à différents stimuli environnementaux 13,14. En outre, la perturbation de la localisation ou l&#39;expression de l&#39;un de ces transporteurs d&#39;efflux ou afflux auxine conduit à une altération sévère PAT, ce qui entraîne une perturbation du gradient de l&#39;auxine, ce qui conduit à des défauts de développement. Récemment, Han et al. a rapporté que la réglementation plasmodesmal est également nécessaire de maintenir le gradient de auxine 15. À ce jour, plus de 30 protéines plasmodesmal ont été identifiés 16. Parmi ces protéines, AtGSL8 a été rapporté comme une enzyme clé pour la synthèse de callose à plasmodesmes (PD) et joue donc un rôle essentiel dans maintaining la limite PD d&#39;exclusion de taille (SEL). AtGSL8 expression réprimée a donné lieu à un motif de gradient de auxine déformé conduisant à aucune réponse à tropisme contrairement aux plants de type sauvage 15. Dans ce manuscrit, les méthodes d&#39;explorer de nouveaux gènes candidats qui sont impliqués dans la régulation de PD sont fournis. AtGSL8 a été utilisé comme protéine modèle pour tester ces méthodes, il est une enzyme clé qui contribue à la biosynthèse PD callose. En raison de la plantule létalité gsl8 de mutants knock-out 17, la dexaméthasone (Dex) les lignes ont été utilisées inductible par ARNi selon un rapport publié antérieurement 15. La stratégie fournie ici peut être adapté pour cribler des gènes qui sont impliqués dans la réponse hypocotyle tropic commandé par PD SEL.

<table><tbody><tr><td>HPTS (sel trisodique de l’acide 8-hydroxypyrène -1,3,6-trisulfonique)</td><td>Sigma</td><td>H1529-1G</td><td>Colorant fluorescent comme traceur symplasmique</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Dongin-Genomic</td><td>GEL001-500G</td><td>Utilisé pour le bloc d’agarose HPTS</td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>LG-Goldstar</td><td></td><td>Machine pour faire bouillir le gel d’agarose</td></tr><tr><td>100 ml Fiole conique en verre</td><td>Dong Kwang</td><td>A0205</td><td>Utilisé pour faire bouillir l’agarose HPTS boîte</td></tr><tr><td>de Pétri en gel (35 mm x 10 mm)</td><td>SPL sciences de la vie</td><td>SPL10035</td><td>Utilisé pour fabriquer des blocs d’agarose HPTS et laver des échantillons de plantes</td></tr><tr><td>Lames de couverture de microscope et lames de verre (24 mm x 50 mm)</td><td>Verrerie de laboratoire Marienfeld 101222</td><td></td><td>Utilisé pour les blocs d’agarose HPTS et la préparation d’échantillons microscopiques</td></tr><tr><td>Plaques moyennes MS 125 mm x 125 mm x 20 mm</td><td>SPL sciences de la vie</td><td>SPL11125</td><td>Plaques pour la fabrication de gélose MS moyenne</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Allemagne Inox</td><td>HSB 942-11</td><td>Utilisé pour l’excise de la région du crochet d’échantillons</td></tr> <tr><td>de plantesMurashige et Skoog (MS) mélange de sels de base</td><td>Duchefa</td><td>P10453.01</td><td>MS moyen comprenant des vitamines.</td></tr><tr><td>Acide (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) monohydraté</td><td>Bioshop</td><td>3G30212</td><td>Pour fabriquer des milieux MS.</td></tr><tr><td>Gélose végétale</td><td>Duchefa</td><td>P1001.1000</td><td>Pour solidifier les milieux MS.</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>ALP</td><td>CL-40L</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Wise Mix</td><td>SHO-1D</td><td>Pour éliminer le tampon de coloration au bleu d’aniline et le colorant HPTS de manière placide.</td></tr><tr><td>1 ml d’embouts bleus</td><td>Sorenson</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipette</td><td>BioPette</td><td>L-1101-2</td><td></td></tr><tr><td>Ruban chirurgical</td><td>MIcropore</td><td>1530-0</td><td>Pour sceller la plaque MS Bleu d’aniline</td></tr><tr><td>(Bleu de méthyle)</td><td>Sigma</td><td>M5528-25G</td><td>Utilisé pour préparer le tampon de coloration au bleu d’aniline.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td>Utilisé pour préparer le tampon de coloration au bleu d’aniline.</td></tr><tr><td>DDG</td><td>Sigma</td><td>D8375-1G</td><td>Utilisé pour l’inhibition des callose synthases.</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE SIM</td><td>Pour vérifier la coloration au bleu d’aniline et le résultat de chargement du colorant HPTS.</td></tr><tr><td>Agitateur&nbsp ;</td><td>I lab&nbsp ;</td><td>K400</td><td>Pour une solution de mixage.</td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td> Feuille <td></td><td>de cuisson SW</td><td>Pour emballer des assiettes dans l’obscurité.</td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium</td><td>Samjin Industry</td><td></td><td>Aux graines stérilisées en surface</td></tr></tbody></table>

une stratégie pour valider le rôle des callose médiée plasmodesmal gating dans la réponse tropic

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

L&#39;auxine hormone végétale joue un rôle important dans de nombreux processus de croissance et de développement, y compris les réponses tropique à la lumière et la gravité. La mise en place d&#39;un gradient d&#39;auxine est un événement clé menant à phototropisme et gravitropisme. Auparavant, polaire transport de l&#39;auxine (PAT) a été montré pour établir un gradient de auxine dans différents domaines cellulaires des plantes. Cependant, Han et al. , A récemment démontré que , pour la bonne formation du gradient de l&#39; auxine, la connectivité plasmodesmal symplasmique callose à médiation entre les cellules adjacentes est également un facteur critique. Dans ce manuscrit, la stratégie visant à élucider le rôle des gènes particuliers, qui peuvent affecter phototropisme et gravitropisme en modifiant la connectivité symplasmique grâce à la modulation de la synthèse callose plasmodesmal, est discuté. La première étape consiste à filtrer les réponses tropique aberrantes de 3 jours-vieux plants étiolés de mutants ou surexpression lignes d&#39;un gène ainsi que le type sauvage. Cet examen préliminairepeut conduire à l&#39;identification d&#39;une série de gènes fonctionnant en PAT ou contrôlant la connectivité symplasmique. La deuxième sélection comprend le tri des candidats qui montrent les réponses tropique modifiées en affectant la connectivité symplasmique. Pour remédier à de tels candidats, le mouvement d&#39;un traceur symplasmique et le dépôt de callose plasmodesmal ont été examinés. Cette stratégie serait utile d&#39;explorer de nouveaux gènes candidats qui peuvent réguler la connectivité symplasmique directement ou indirectement au cours des réponses tropique et d&#39;autres processus de développement.

Dans la configuration actuelle, la dexaméthasone (dex) inductible par lignes ARNi de AtGSL8 [ci - après dsGSL8 (+ dex / -Dex)] ont été utilisés, comme les mutants d&#39;insertion ADN-T gsl8 homozygotes sont des plantules létale 18. Trois jours-vieux plants étiolés de dsGSL8 et plants de type sauvage avec dex ± ont été exposés à des stimuli phototrophes et gravitropique. Nous avons constaté que dsGSL8 (+ dex) plantules étaient défect...

Cet article décrit les méthodes de criblage des gènes contrôlant la perméabilité plasmodesmal et gradient donc auxine pendant la réponse tropique. Cela inclut la mesure du degré de réponse à tropisme hypocotyle d&#39;Arabidopsis thaliana et de vérifier la perméabilité plasmodesmal par l&#39; acide 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonique (HPTS) le chargement et l&#39; évaluation du niveau finalement callose.

Une stratégie pour valider le rôle des Callose médiée Plasmodesmal Gating dans la réponse Tropic

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

L'objectif général de cette procédure est de cribler les gènes impliqués dans la régulation des plasmodesmes par la callose durant la réponse tropique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement végétal, telles que quels gènes inconnus contrôlent la signalisation de cellule à cellule par les plasmodesmes durant la réponse tropique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est simple, fonctionne également et reproductible.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car la manipulation des hypocotyles étiolés d'Arabidopsis sans les endommager pendant tout le processus est délicate. Nous avons eu l'idée de cette méthode lors de l'établissement du rôle de GSL8, une glucosyltransférase intervenant dans la régulation des plasmodesmes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les procédures mentionnées dans l'audio n'ont pas expliqué les étapes critiques qui sont difficiles à réaliser, car elles nécessitent un dispositif et une manipulation particuliers.Préparez le milieu Murashige et Skoog, ou milieu MS, un jour avant l'expérience. Stérilisez-le en autocl

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