Name: Clonage fonctionnelle en utilisant un Xenopus Système dexpression de lovocyte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez le clonage fonctionnel en biologie du développement utilisant le système d'ovocytes de Xenopus et de chapeau animal. Cette méthode permet d'identifier les gènes inducteurs dans l'ectoderme compétent.

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Ce travail a été soutenu par une bourse de développement professionnel à C.Z.P. de la Fondation de l’Université Shepherd. Les auteurs tiennent à remercier Brett Zirkle et Malia Deshotel pour leurs discussions utiles sur les protocoles, ainsi que la Dre Carol Hurney pour son aide généreuse.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvés par l&#39;Université de Virginie institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. Remarque: La figure 1 montre une vue d&#39;ensemble schématique des modes opératoires expérimentaux. 1. Préparation d&#39;ovocytes <ol><li> X. Pré-prime laevis femelles avec 150 U de jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG) environ une semaine à l&#39;avance de l&#39;isolement de l&#39;ovocyte. Injecter 1 ml 150 U / ml PMSG dans dorsale lymphatique sac avec 1 cc seringue stérile avec aiguille 29 G. </li><li> Préparer des solutions pour l&#39;injection d&#39;ovocytes et le Cap-dosage ovocyte animal. <ol><li> Préparer Ca ++ / Mg ++ exempt OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, 2,5 mM de KCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, HEPES 50 mM pH 7,2. </li><li> Préparer OR2: OR2- plus 1 mM de CaCl2 et 1 mM de MgCl2. </li><li> Préparer OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml de BSA, 100 ug / ml de gentamycine à pH 7,8. </li><li> Pré1x pare MBS: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,7 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO 4, 5 mM de HEPES (pH 7,8), 2,5 mM de NaHCO 3. </li><li> Préparer 3% de Ficoll en 1x MBS. </li><li> Préparer NAM 1x: 110 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO 3) 2, 1 mM de MgSO 4, 0,1 mM d&#39;EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 2 mM de Na 3 PO 4 à pH 7,4. </li></ol></li><li> Anesthésier la femelle dans une solution à 0,03% de sel de méthanesulfonate d&#39;éthyle 3-aminobenzoate (MS222) à 0,1x MBS (première dissoudre 0,3 g dans 10 ml MS222 95% d&#39;éthanol, puis diluer à 1 L 0,1x MBS) en plaçant grenouille solution pour 10 - 15 min ou jusqu&#39;à ce que ne répond pas. <ol><li> Vérifiez que l&#39;anesthésie est complète en tournant grenouille anesthésié sur le dos pour vous assurer qu&#39;il ne répond pas (incomplètement grenouilles anesthésiés déplacer membres ou du corps au verso). </li></ol></li><li> Isoler des fragments de l&#39;ovaire par voie chirurgicale en faisant une incision abdominale à travers la peau et la paroi du corps de lame de scalpel, l&#39;isolement du tissu ovarien avec une pinceet ciseaux. Placez fragments ovariens dans OR2-. Fermez la paroi du corps avec une suture 3-0 en soie sur une aiguille courbe de 24 mm et fermer la peau séparément avec les mêmes points de suture. Permettre la récupération des femmes dans 1 g / L aquarium sel dans l&#39;eau. </li><li> En utilisant des pinces fines, tissu ovarien lacrymogènes dans les petites (10 - 20) pièces ovocytes et transfert à OR2- frais. </li><li> Defolliculate fragments ovariens dans 2,0 mg / ml de collagénase A en agitant doucement par OR2- sur agitateur pendant 1 heure, le transfert de la collagénase fraîche et en agitant pendant une heure supplémentaire. </li><li> Laver ovocytes 10 fois dans OR2 [contenant Ca ++ / Mg ++] en rejetant les petits ovocytes. </li><li> Laver ovocytes dans OCM deux fois et transférer à nouveau OCM. Isoler ovocytes Etape VI selon la taille de l&#39;inspection visuelle des ovocytes immatures et le jeter (plus petits): Etape VI ovocytes sont plus grandes que ovocytes immatures avec même pigmentation dans l&#39;hémisphère des animaux et sont d&#39;environ 1,2-1,4 mm de diamètre. </li><li> Maintenir ovocytes à 18 - 20 ° C in OCM avant l&#39;injection. Remarque: Les boîtes de Petri enrobées d&#39;agarose-peuvent être utilisés pour réduire le collage des ovocytes à plat. </li></ol> 2. Injection d&#39;Bibliothèque Transcriptions <ol><li> Préparer une banque d&#39;ADNc directionnelle 15 en utilisant l&#39;ARN extrait à un stade approprié de développement (par exemple, stade de la plaque neurale 14 10). Achetez une banque d&#39;ADNc ou de construire un utilisant un kit commercial par la liste dans les quatre étapes ci-dessous. <ol><li> Isoler environ 5 pg de l&#39;ARNm en utilisant un produit pour enrichir en poly (A) + ARN (voir le tableau des matériaux) et en suivant les instructions du fabricant. Remarque: Les relevés de notes à être utilisés pour produire la banque d&#39;ADNc peut être limitée à un tissu induire (comme la plaque neurale, après microdissection des tissus désiré), ou peuvent être à partir d&#39;embryons entiers à un stade particulier. </li><li> Produire de l&#39;ADNc avec un kit commercial, suivant les instructions du fabricant. </li><li> Ligaturer environ 20 ng d&#39;ADNc dans un vector inclus avec le kit commercial ou d&#39;un autre vecteur approprié. Un vecteur plasmidique approprié comprend des séquences de stabilité de l&#39;ARNm tel que 5 &#39;et β-globine 3 poly (A) + pCS2 (séquences, pTnT, pCS105). </li><li> Transformez ligature dans des cellules bactériennes compétentes en utilisant le protocole recommandé de fournisseur pour la transformation de choc thermique. Remarque: Alternativement, une collection de cadre de lecture ouvert (ORFéome) clones est disponible dans le commerce et peut être utilisé pour générer des transcriptions pour injection. </li></ol></li><li> Préparer 10 pools de plasmides sur 10 trois à quatre complexité dix (10 quatre à dix complexité de cinq au total). Cela représente 10 plaques avec 1.000 - 10.000 colonies chacun. <ol><li> Bibliothèque de plaque de culture sur 10 plaques de 15 cm LB-ampicilline, grandir 12 - 18 h à 37 ° C, et de recueillir des colonies de chaque par une légère pression avec un épandeur de verre dans 7 ml LB. </li><li> Préparer un stock de glycérol de 0,5 ml (ajouter à 0,2 ml de glycérol stérile et conserver à -20 &amp;# 730; C), et d&#39;utiliser les 6,5 ml restants pour préparer l&#39;ADN avec un standard du commerce kit ADN miniprep en suivant les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Linéariser l&#39;ADN plasmidique groupé (1.0 - 2.0 ug) avec restriction appropriée enzyme digérer 16 à 37 ° C pour les 1 - 1,5 h. Isoler l&#39;ADN linéarisé par extraction au phénol / chloroforme suivie d&#39;une précipitation à l&#39;éthanol et remise en suspension dans de l&#39;eau selon les spécifications de la trousse d&#39;ARN polymérase utilisée. Synthétiser l&#39;ARN sens avec un kit d&#39;ARN polymérase commerciale suivant les instructions du fabricant. </li><li> Préparer aiguilles pour la micro-injection (à l&#39;aide d&#39;un extracteur d&#39;aiguille avec un tube capillaire en verre) d&#39;environ 20 um de diamètre; mesurer pointes d&#39;aiguille sur un microscope composé avec un micromètre oculaire calibré. Remarque: Les paramètres de traction aiguille doit être déterminée empiriquement pour produire une aiguille avec une pointe fine telle que lorsque rompu avec une pince fine donne la taille de la pointe souhaitée. </li><li> Préparer (pousser argile danscouche uniforme sur le fond du plat) argile bordée 35 x 10 mm boîtes de Pétri avec des rainures parallèles pour tenir ovocytes en place lors de la micro-injection; produire des rainures avec une sonde de centre commercial ou pipette Pasteur fusionné à la pointe de la flamme. Comme alternative à l&#39;argile, de préparer des plats agarose faisant indentations avec un moule en élastomère 17. Ovocytes de transfert avec une pipette de gros calibre à 3% de Ficoll dans 1X MBS (environ 2 ml) en rangées dans les plats d&#39;argile bordée. </li><li> Utilisation microinjecteur, remplissez aiguille avec 1 ng / nl ARN et de régler la balance pour produire une légère pression positive (pour empêcher l&#39;élaboration de cytoplasme de l&#39;ovocyte). </li><li> Injecter ovocytes avec environ 20 nl d&#39;ARN dans la région équatoriale. Comptez 1 h pour les ovocytes injectés de rester dans Ficoll-MBS, puis transférer doucement pour 1x MBS. Incuber pendant 8-24 heures à 20 ° C avant l&#39;essai de coiffe animale. </li></ol> 3. Animal Cap Assay <ol><li> Préparer 3 / 4x NAM et obtenir des pinces fines, boucle de cheveux, des fragments de lamelle incurvée, dis d&#39;argile bordéehes avec indentations en forme de coupe de tenir ovocytes. Assurez fragments lamelle courbes par briser des lamelles de verre en petits fragments (environ 1 - 2 mm x 2 - 4 mm) et passant par flamme jusqu&#39;à ce que les bords polonais et statisme, la production d&#39;une pièce courbe. </li><li> Fertiliser X. laevis oeufs 18 in vitro ou par accouplement naturel et de la culture à Gastrula stades (10 - 11 h après la fécondation à la température ambiante) à 0,1x MBS avant le tri par étape; recueillir mi-gastrula (stade de 11 à 11,5) 10 embryons. </li><li> Embryons de transfert à une boîte de Pétri environ à moitié plein avec 3 / 4x Nam. L&#39;utilisation de deux paires de pinces fines, retirez la fécondation (vitelline) membrane de gastrulas. </li><li> Transfert ovocytes à 3 / 4x NAM (environ 2 ml) dans les plats d&#39;argile bordée et d&#39;immobiliser des impressions individuelles dans l&#39;argile, la production d&#39;impressions pour accueillir embryons individuels que des rainures ont été décrits ci-dessus. </li><li> Embryons de transfert aux plats d&#39;argile bordée et coupés calottes animales hors gastrulae utilisant deux paires de pinces fines. Prenez soin d&#39;isoler l&#39;animal bouchon ectoderme seulement et pas les tissus équatoriale 18. </li><li> Placez un bouchon d&#39;animaux sur l&#39;hémisphère animal de chaque ovocyte avec la surface intérieure de la coiffe des animaux en contact avec l&#39;ovocyte. Maintenir recombinants ensemble en appliquant fragment de lamelle de verre incurvée et en appliquant une pression vers le bas sur le verre, aplatissant l&#39;ectoderme que les contacts de la lamelle de l&#39;argile (calottes animales peut rester ouvert avec la couche intérieure exposée à la surface de l&#39;ovocyte pour 6-8 heures ou plus ). Remarque: vous pouvez placer le capuchon de l&#39;animal dans une indentation d&#39;argile avec sa surface intérieure orientée vers le haut et placez un ovocyte sur le bouchon; sécuriser le recombinant avec de petites extensions d&#39;argile. </li><li> Culture à 20 ° C jusqu&#39;à ce que les embryons de contrôle atteignent les désire étape pour le dosage. </li><li> Recombinant séparée en enlevant lamelle / argile et l&#39;isolement de l&#39;ectoderme avec une pince et une boucle de cheveux. </li><li> Fixer fragments ectodermiques pendant 1 h dans MEMFA (3,8%formaldehyde dans du MEM [0,1 M de MOPS, pH 7,4, 2 mM d&#39;EGTA, 1 mM de MgSO et 4]). </li><li> Fragments de transfert (et d&#39;embryons de contrôle) de MEMFA en éthanol et conserver à -20 ° C. </li></ol> 4. Analyse de la réponse dans Ectoderme par hybridation in situ (ISH) <ol><li> Préparer des solutions pour ISH. <ol><li> Préparer 1x PBS: 0,01 M tampon phosphate salin, NaCl 0,138 M, pH 7,4 </li><li> Préparer PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20 </li><li> Préparer la solution de 100x Denhart: BSA 2%, 2% Polyvinylpyrrolidone, 2% de Ficoll </li><li> Préparer tampon d&#39;hybridation: 50% de formamide, 5x SSC, 1 mg / ml torula ARN de levure, 1 ug / ml d&#39;héparine, la solution de 1 x Denhart, 0,1% de Tween-20, 0,1% de CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC H 2 O </li><li> Préparer le tampon acide maléique (MAB): acide maléique 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 </li><li> Préparer MAB + bloc: MAB, 2% de réactif de blocage (la chaleur à 60 ° C pour dissoudre) </li><li> Préparer la phosphatase alcaline (AP) tampon: Tris 100 mMpH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween, dH 2 O </li></ol></li><li> Préparer l&#39;ARN Probe. <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un kit d&#39;ARN polymérase commerciale et de creuser-NTP mélange, ajouter à un tube de 1,5 ml (50 de réaction pi): 25,5 pi DEPC H 2 O, 10 pl Transcription Buffer 5X, 2,5 ul 10x dig-NTP Mix, 5 pl 100 mM TNT, 2 pl RNAsin, 2 pl linéarisé matrice d&#39;ADN (~ 1 ug / ul), 3 pi ARN polymérase et incuber 37 ° C pendant 90 min. </li><li> Ajouter 2 ul ARN polymérase et incuber 37 ° C pendant 60 min. </li><li> Vérifiez 2 pi de réaction sur gel d&#39;agarose 1%. </li><li> Ajouter 1 ul de DNase RQ1 RNase-Free et incuber 37 ° C pendant 20 min. </li><li> Précipiter la sonde en ajoutant 50 ul DEPC-H 2 O, 25 ul d&#39;acétate d&#39;ammonium 10 M et 313 ul d&#39;éthanol. Conserver à -20 ° C pendant la nuit (O / N), puis récupérer l&#39;ARN par centrifugation à 13 800 g pendant 20 min. Laver avec 500 ul 75% d&#39;éthanol, centrifuger brièvement, retirezéthanol et permettre culot sécher à l&#39;air. Ajouter 50 ul DEPC H 2 O. </li><li> Ajouter tampon d&#39;hybridation à une concentration finale de ~ 0,5 pg / pl. </li></ol></li><li> Préparer tissus pour l&#39;hybridation. Sauf indication contraire, remplir les flacons vers le haut à chaque changement de solution décrites (environ 4 ml). <ol><li> Retirer éthanol à partir de flacons et de transfert d&#39;embryons dans 75% d&#39;éthanol / PTW, puis 50% d&#39;éthanol / PTW chacune pendant 10 minutes, à l&#39;horizontale sur rocker. </li><li> Laver trois fois dans PTW pendant 5 min sur chaque bascule. </li><li> Transfert à 10 ug / ul de traitement à la protéinase K dans PTW; tubes de roche à la verticale de 15 min. </li><li> Rincer deux fois 10 minutes dans chacune des 0,1 M pH 7,8 Triéthanolamine - Rock tubes verticalement. </li><li> Ajouter 12,5 pi d&#39;anhydride acétique à des tubes et de la roche verticale 5 min. Répéter l&#39;opération avec 12,5 pi anhydride acétique supplémentaire pour 5 min. </li><li> Laver à PTW 5 min verticalement sur rocker. </li><li> Refixer dans 4% de paraformaldehyde 20 min à bascule. Chaleur tampon d&#39;hybridationà 60 ° C. </li><li> Laver trois fois dans PTW pendant 5 min sur chaque bascule. </li><li> Retirez tous mais ~ 1 ml de PTW de chaque tube et ajouter 250 Buffer Hyb ul; agiter doucement tubes pour mélanger. Tubes Rock verticalement 5 min. </li><li> Remplacez-le par 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) et agiter doucement à 60 ° C 10 min. Remplacer avec le tampon Hyb frais et agiter à 60 ° C de deux à 4 h. </li><li> Sonde thermique (1 ml à 0,5 ug / ul dans du tampon Hyb) à 60 ° C (3 min). Retirer Hyb Buffer et ajoutez sonde pour tubes. Agiter doucement O / N à 60 ° C. </li></ol></li><li> Préparer tissus pour anticorps. <ol><li> Tampons Hyb chaleureux et 2x SSC + 0,1% de Tween-20 solutions à 60 ° C. </li><li> Remplacer solution de sonde avec Hyb Buffer (sauf sondes à -20 ° C pendant 2 - 3x réutilisation). Lavage à 60 ° C pendant 10 min. </li><li> Laver trois fois à 60 ° C dans 2x SSC-Tween (20 min chacun avec agitation). </li><li> Laver trois fois à 60 ° C dans 0,2x SSC-Tween (20 min chacun avec agitation). </li><li> Laver deux fois dans MAB (RT) pendant 15 min sur chaque bascule à l&#39;horizontale. </li><li> Ajouter 1 ml MAB + bloc. Lavez 2 h verticalement sur rocker. </li><li> Transfert à 1 ml MAB + bloc contenant un anti-digoxygénine-AP 1 / 2.000. Roche verticalement à 4 CO / N. </li></ol></li><li> Préparer tissus pour Réactif couleur. <ol><li> Remplacer solution d&#39;anticorps avec le MAB; laver trois fois en 5 min MAB horizontalement sur chaque bascule. </li><li> Laver trois fois dans MAB 1 h chaque horizontalement sur rocker. </li><li> Laver deux fois dans du tampon AP 10 min chaque bascule à l&#39;horizontale sur. </li><li> Transfert tissu à multiples puits plateau en plastique, retirez AP tampon et ajoutez BM réactif Violet (~ 1 ml). Laisser réaction de se dérouler dans l&#39;obscurité 5 min à O / N. </li><li> Lorsque coloration appropriée est atteint, transférer le tissu dans des flacons de PTW. Laver deux fois 10 minutes dans chacune des deux-roues motorisés sur rocker. </li><li> Fixer dans la solution de Bouin à 4 CO / N sur rocker. </li><li> Laver Bouin avec trois éthanol à 70% / 30% lavages PTW à TA. Procéder to capture d&#39;image en utilisant épi-illumination et une caméra de microscope monté, le blanchiment si nécessaire 18. </li></ol></li></ol> 5. Sib sélection et clonage <ol><li> Sélectionnez piscine avec l&#39;activité la plus élevée (plus de réponse dans le tissu ectodermique). </li><li> Titrer (diluer avec LB à une densité adéquate) le stock de glycérol pour la piscine avec l&#39;activité la plus élevée et de la plaque sur dix nouvelles plaques avec environ un dixième des colonies de l&#39;étape précédente (en utilisant l&#39;article 2 dans le protocole ci-dessus). </li><li> Réduire la taille de la piscine jusqu&#39;à ce que l&#39;activité est imputable à une seule colonie. </li><li> Obtenir la séquence d&#39;ADN en utilisant des amorces classiques dans le vecteur. </li></ol>

<ol><li>Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Screens+in+Xenopus.+Using+Transposon-Mediated+Insertional+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).</li>
<li>Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis.+as+a+Model+Organism+for+Genetics+and+Genomics%3A+Past%2C+Present+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).</li>
<li>Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Targeted+Mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51, 835-843 (2013).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Studies+Using+Antisense+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injected+Xwnt-8.+RNA+acts+early+in+Xenopus.+embryos+to+promote+formation+of+a+vegetal+dorsalizing+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center.</a> Cell. 67, 753-765 (1991).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin.%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+in+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+induction+of+anterior+head+ectodermal+properties+in+Xenopus.+embryos+are+mediated+by+transcriptional+cofactor+ldb1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus.+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Development. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+P+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+Siamois.%2C+a+Xenopus.+homeobox+gene+expressed+in+dorsal-vegetal+cells+of+blastulae+and+able+to+induce+a+complete+secondary+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis.</a> Cell. 81, 85-94 (1995).</li>
<li>Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+Xenopus+T.-related+gene+%28Xombi.%29+involved+in+mesodermal+patterning+and+blastopore+lip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation.</a> Development. 122, 4001-4012 (1996).</li>
<li>Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus.+dorsalizing+factor+Gremlin+identifies+a+novel+family+of+secreted+proteins+that+antagonize+BMP+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities.</a> Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).</li>
<li>Lustig, K., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+oocyte+expression+assay+to+reconstitute+inductive+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li>Viczian, A., Zuber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Determination+Using+the+Animal+Cap+Transplant+%28ACT%29+Assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis.</a> J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of.Xenopus+laevis.%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).</li>
<li>Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activation+during+early+stages+of+lens+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus.</a> Development. 125, 3509-3519 (1998).</li>
<li>Medina-Martinez, O., Jamrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxe+view+of+lens+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxe view of lens development and disease.</a> Development. 134, 1455-1463 (2007).</li>
<li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li>
<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le procédé décrit ici pour le clonage fonctionnel de gènes capables d&#39;induire une réponse dans l&#39;ectoderme compétent peut être utilisée pour identifier une vaste gamme de produits de gènes. Cette méthode se développe sur le travail passé en combinant des analyses de tissus induisant avec des techniques d&#39;expression de clonage. Nous utilisons les voies métaboliques de l&#39;ovocyte de Xenopus en tant que source de production de facteurs induisant, directement ou indirectement, suite à l&#39;injection...

Les approches génétiques avancées pour identifier les gènes d’intérêt par leur fonction ou leur perte de fonction1,2 font partie intégrante de la compréhension des événements complexes de structuration du développement. Associé à de puissantes techniques de génétique inverse disponibles pour un éventail toujours plus large de systèmes et de chercheurs3 à 5, il est maintenant possible d’identifier des gènes ayant un rôle fonctionnel clé dans une voie, puis d’élucider cette fonction au niveau cellulaire et en interaction avec d’autres produits géniques. Une approche d’identification fonctionnelle des gènes d’intérêt qui a donné lieu à de nombreuses découvertes clés dans le passé est le clonage d’expression6,7.
Notre objectif récent8 était d’identifier les facteurs précoces d’induction du cristallin, car il a été démontré que les premières étapes du processus d’induction du cristallin chez les vertébrés se produisent dès les stades de gastrula. À cette fin, nous avons utilisé l’ectoderme de la cape animale9 (stade 11-11,510) d’embryons de xénope comme tissu répondant pour l’induction, et l’ovocyte de xénope de stade VI comme source de production des facteurs inducteurs.
Le protocole suivant s’appuie sur les protocoles de clonage d’expression et de sélection de la fratrie de Smith et Harland6,7, également utilisés avec succès par d’autres11-13. Dans notre système d’expression ovocytaire (utilisé pour la première fois pour la production de facteurs inducteurs par Lustig et Kirschner14), des pools de transcrits injectés capables d’amener directement ou indirectement les ovocytes à produire des facteurs qui provoquent une réponse inductive du cristallin dans l’ectoderme du chapeau animal sont sélectionnés et identifiés. Étant donné que le système est utile pour exprimer directement les molécules inductrices sécrétées (l’ARNm INHBB injecté dans l’ovocyte provoque l’induction du mésoderme dans l’ectoderme8 du chapeau animal compétent pour le mésoderme), nous nous attendions à l’origine à ce que la procédure de dépistage soit principalement utile pour l’identification des facteurs paracrines. Cependant, depuis que nous avons identifié un facteur nucléaire dans notre crible (ldb18), il est clair que le système peut être utilisé pour identifier une grande variété de molécules telles que les facteurs régulateurs transcriptionnels ou translationnels, les miARN, les cofacteurs ou les facteurs juxtacrines.

<table><tbody><tr><td>12/101</td><td>Études de développement d’anticorps Banque d’hybridomes</td><td>12/101</td><td>Anticorps monoclonal pour la détection du tissu musculaire</td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Anhydride acétique</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Aurum Plasmid Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>Purification de l’ADN plasmidique</td></tr><tr><td>Réactif de blocage</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>pour</td></tr><tr><td>ISH Boekel Four d’hybridation</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Bouin’s Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>pour OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Collagénase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Défolliculation des ovocytes</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>Dejelly embryons</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Dig-RNA Labeling Mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td>pour sondes ISH</td></tr><tr><td>Pince Dumont #5</td> World <td>Precision Instruments</td><td>500233</td><td>pour enveloppe Vitelline </td></tr><tr><td>élimination Ethyl 3-aminobenzoate</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 anesthésique</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>pour milieu d’injection</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>pour OCM</td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>3,5" de long, I,D, 0,530 mm</td></tr><tr><td>Flacons d’échantillons en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Boucle</td><td></td><td></td> de cheveux <td>Cheveux fixés dans une pipette pasteur pour la manipulation tissulaire</td></tr><tr><td>Héparine sel de sodium</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>pour</td></tr><tr><td>ISH Injecteur Nanoliter 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanoliter 2010</td><td>Microinjecteur contrôlé par microprocesseur</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>Aquarium Sel pour la récupération des grenouilles</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus vérifié caméra pleine longueur ADNc</td><td>Source Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>bibliothèque d’ADNc&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaques d’agar LB avec 100 & micro ; g/ml Ampicilline</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>Plaques LB-Amp pré-coulées de 150 mm pour la sélection de la fratrie</td></tr><tr><td>LB Luria Broth Teknova</td><td></td><td>L8650</td><td>LB pour la collecte de colonies dans la fratrie Sélection de plaques et dilution des cultures Kit d’isolement</td></tr><tr><td>magnétique de l’ARNm</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>pour l’isolement de l’ARN enrichi en poly(A)</td></tr><tr><td>Acide maléique</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Micromanipulateur manuel Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>Micromanipulateur manuel</td></tr><tr><td>Mélangeur à nutation</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>Bascule pour ISH</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco SB33495M</td><td></td><td>Argile pour boîtes d’injection et de dissection</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>pour stimuler le développement des ovocytes</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Extracteur programmable</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Extracteur d’aiguille de micropipette</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>pTnT Vector</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>Construction d’une bibliothèque d’ADNc</td></tr> Système <tr><td>de combinaison de ribosonde Promega</td><td></td><td>P1450</td><td>in vitro transcription</td></tr><tr><td>Exposant Full-Length cDNA Library Construction Kit</td><td>Life Technologies</td><td>18248013</td><td>pour la construction de banques d’ADNc</td></tr><tr><td>Sutures, 3-0 soie</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>Fil de suture et aiguille pour l’ablation post-ovocytaire</td></tr><tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>pour ISH</td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>kit alternatif pour la construction de banques d’ADNc</td></tr><tr><td>Clones Xenopus Full ORF Entry - ORFeome</td><td>Collaboration Source Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome Clones</td></tr><tr><td>XL2-Blue Cellules ultracompétentes</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>cellules pour la transformation de l’ADNc bibliothèque</td></tr></tbody></table>

clonage fonctionnelle en utilisant un<em&gt; xenopus</em&gt; système d&#39;expression de l&#39;ovocyte

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

L’identification des gènes responsables de l’induction embryonnaire pose un certain nombre de défis ; pour n’en nommer que quelques-uns, les molécules d’intérêt sécrétées peuvent être peu abondantes, peuvent ne pas être sécrétées mais attachées à la ou aux cellules de signalisation, ou peuvent nécessiter la présence de partenaires de liaison ou de molécules régulatrices en amont. Ainsi, dans la recherche de produits géniques capables d’induire une réponse inductive précoce du cristallin chez l’ectoderme compétent, nous avons utilisé un système de clonage d’expression qui permettrait d’identifier les facteurs paracrines ou juxtacrines ainsi que les protéines transcriptionnelles ou autres protéines régulatrices. Des flaques d’ARNm ont été injectées dans les ovocytes de xénope, et le tissu répondant a été placé directement sur les ovocytes et co-cultivé. Suite au clonage fonctionnel de ldb1 à partir d’une banque d’ADNc au stade de la plaque neurale basée sur sa capacité à susciter l’expression du marqueur précoce de placode du cristallin foxe3 dans un ectoderme de capuchon animal compétent pour le cristallin, nous avons caractérisé le profil d’expression de l’ARNm et analysé la progression du développement après surexpression ou knockdown de ldb1. Ce système est adapté à une très grande variété de contextes où l’identification d’un inducteur ou de ses molécules régulatrices en amont est recherchée à l’aide d’une réponse fonctionnelle dans un tissu compétent.

En réponse à l&#39;expression de l&#39;ARNm injecté dans des ovocytes, tissu de coiffe animale répondant a été analysé pour déterminer l&#39;expression de otx2 par hybridation in situ (Figure 2 et tableau 1); otx2 est exprimé dans la lentille présomptif ectoderme (PLE) de fermeture du tube neural grâce à lentille placode épaississement 19. Cependant, depuis otx2 est également exprimé dans l&#39;ectoderme neural anté...

Nous décrivons un système d’ovocytes et de coiffes animales de xénope pour le clonage d’expression de gènes capables d’induire une réponse chez l’ectoderme compétent, et discutons des techniques pour l’analyse ultérieure de ces gènes. Ce système est utile dans l’identification fonctionnelle d’un large éventail de produits géniques.

Clonage fonctionnelle en utilisant un<em&gt; Xenopus</em&gt; Système d&#39;expression de l&#39;ovocyte

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer un système d'ovocyte de Xenopus et de cap animal, adapté à l'identification de produits géniques capables d'induire une réponse dans un ectoderme compétent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, comme quels gènes sont nécessaires pour provoquer une réponse inductive. Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation de l'ovocyte de Xen游戏副本La démonstration visuelle de cette méthode est extrêmement utile, car les étapes de dissection et de recombinaison dépendent fortement du stade et nécessitent une technique raffinée. Après avoir prélevé le tissu ovarien de grenouilles femelles anesthésiées, déchirez le tissu en petits morceaux, chacun contenant environ 10 à 20 ovocytes. Transférez ensuite ces fragments, d'abord vers une solution OR2 fraîche, puis vers une solution OR2 contenant 2,0 milligrammes par millilitre de collagénase A. Poursuivez en agitant doucement le mélange contenant le tissu sur un agitateur pendant une heure.Transférez ensuite les fragments dans une solution fraîche de collagénase et agitez pendant une heure supplémentaire. Vous devez observer des ovocytes défloqués à la fin de ce traitement. Procédez ensuite au lavage des ovocytes 10 fois dans du OR2 complet, puis deux fois dans le milieu de culture d'ovocytes, abrégé en OCM.Par la suite, placer les ovocytes dans du milieu OCM frais et les examiner visuellement au microscope stéréoscopique. Isoler les ovocytes au stade six en écartant les ovocytes plus petits et immatures. Ensuite, placer les ovocytes dans une boîte de Pétri recouverte d'agarose contenant du milieu OCM, et les maintenir à une température de 18 à 20 degrés Celsius jusqu'à l'injection.Pour préparer la microinjection, insérez un tube capillaire en verre dans un tireur d'aiguilles, tirez-le, puis cassez les extrémités du verre afin d'obtenir des aiguilles d'environ 20 micromètres de diamètre. Au microscope composé, mesurez les extrémités des aiguilles à l'aide d'un micromètre oculaire étalonné. Ensuite, appliquez de l'argile en une couche uniforme sur le fond d'une boîte de Pétri de 35 par 10 millimètres.Ensuite, créez des sillons parallèles dans cette couche à l’aide d’un outil semblable à une sonde fine. Remplissez le plat recouvert d’argile avec environ 2 millilitres de Ficoll à 3 % dans du sel de Barth modifié 1x, ou MBS. Transférez ensuite les ovocytes dedans à l’aide d’une pipette à large orifice.Placer les ovocytes dans les sillons afin qu'ils soient maintenus en place pendant la microinjection ultérieure. À l'aide d'un microinjecteur, charger une aiguille avec environ deux microlitres d'un pool d'ARNm préalablement préparé et régler l'équilibre de pression pour obtenir une légère pression positive, empêchant ainsi le cytoplasme des ovocytes d'être aspiré dans l'aiguille lors de l'injection. Ensuite, injecter 20 nanolitres d'ARN dans la région équatoriale de chaque ovocyte.Ensuite, laisser les ovocytes dans le MBS Ficoll pendant une heure, puis les transférer délicatement dans du MBS 1x. Incuber les ovocytes pendant huit à 24 heures à 20 degrés Celsius. Pour commencer le test de la calotte animale, préparer la solution de milieu amphibien normal à 3/4x, abrégée en solution NAM, une pince fine, une boucle en cheveu, les ovocytes préalablement injectés et des embryons de Xenopus aux stades 11 à 11,5.Ensuite, briser des lamelles de verre en fragments d'environ un millimètre sur deux millimètres de taille, et passer ces morceaux à travers une flamme jusqu'à ce que leurs bords soient polis et arrondis. Puis, presser de l'argile en une couche unique dans une boîte, comme décrit précédemment. Utiliser une sonde en maillet pour créer des empreintes individuelles en forme de cupule dans ce revêtement.Procédez au remplissage de la boîte avec environ deux millilitres de NAM à 3/4x. Transférez-y ensuite les ovocytes injectés, en plaçant plusieurs ovocytes de manière à ce que chacun soit immobilisé dans une indentation individuelle. Pour préparer les embryons, transférez-les dans une boîte contenant une solution de NAM à 3/4x.Sélectionnez un sous-ensemble de gastrules à utiliser comme témoins de stade pour déterminer l'âge de l'ectoderme, puis transférez-les dans une autre boîte contenant la même solution. Mettez cette boîte de côté. Pour les embryons qui seront utilisés dans le test de calotte animale, retirez leurs membranes vitellines à l’aide de deux paires de pinces fines.Ensuite, transférez la gastrula dans la boîte revêtue d'argile contenant les ovocytes. Pour commencer, découpez les calottes animales des embryons à l’aide de deux paires de fines pinces, en prenant soin d’éviter les tissus équatoriaux. Pour générer des recombinants selon la première méthode, positionnez une calotte animale de sorte que sa surface interne entre en contact avec l’hémisphère animal d’un ovocyte déjà placé dans une indentation.Et répéter ce processus pour plusieurs des ovocytes injectés. Pour s'assurer que ces recombinants restent associés, placer un fragment incurvé de lamelle en verre au-dessus de chacun d'eux, puis exercer une pression vers le bas jusqu'à ce que l'animal soit aplati et que la lamelle entre en contact avec l'argile. Pour générer des recombinants selon la deuxième méthode, placer les calottes animales et les ovocytes ensemble dans des empreintes individuelles vides dans l'argile.Et veiller à ce que les surfaces internes des calottes animales soient orientées vers l'oocyte. Ensuite, fixer les deux tissus ensemble à l'aide de petites extensions en argile. Une fois plusieurs recombinants obtenus par l'une ou l'autre méthode, les mettre en culture ainsi que les embryons témoins mis de côté à 20 degrés Celsius.Lorsque les embryons témoins atteignent le stade souhaité, retirez les lamelles des recombinants et isolez l'ectoderme du cap animal à l'aide de pinces et d'une boucle de cheveu. Procédez ensuite à la fixation des fragments ectodermiques et des embryons témoins dans du MEMFA pendant une heure. Transférez-les ensuite dans de l'éthanol et conservez ce tissu à moins 20 degrés Celsius.Ici, des lots d'ovocytes ont été injectés avec des pools d'ARNm correspondant à des nombres de plus en plus restreints de clones ou de colonies, puis mis en culture avec des calottes animales. Par la suite, le nombre de calottes animales dans chaque lot exprimant foxe3, un marqueur normalement observé dans l'ectoderme présomptif du cristallin depuis les stades de plaque neurale précoce jusqu'à la formation de la vésicule, et utilisé ici pour évaluer la capacité inductrice du cristallin, a été déterminé. Cette méthode a permis d'identifier un gène codant pour un facteur nucléaire, ldb1, capable de produire une réponse inductrice du cristallin dans 50 des 179 calottes animales analysées, soit 28 %.Les images d'hybridation in situ présentées ici, montrant le signal de foxe3, indiqué par des flèches, dans des calottes animales cultivées avec des ovocytes injectés avec ldb1, depuis environ le stade 11 jusqu'au stade 23. Aucune expression de foxe3 n'est observée dans les calottes animales témoins correspondantes placées sur des ovocytes non injectés. Lorsque des coupes ont été réalisées à partir de ces calottes animales, l'expression de foxe3 a été observée dans les deux couches ectodermiques, interne et externe.L'expression dans la couche interne est caractéristique d'une réponse en lentille. Ou, lorsqu'elle est observée dans les deux couches, elle indique la présence d'autres structures telles que la plaque olfactive. Après cette procédure, des méthodes telles que l'immunohistochimie, l'hybridation in situ ou la détection directe d'un gène rapporteur fluorescent peuvent être réalisées afin d'évaluer une réponse inductive dans l'ectoderme du cap animal.

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