Clonage fonctionnelle en utilisant un Xenopus Système d'expression de l'ovocyte

L’objectif global de cette procédure est de mettre en évidence un ovocyte de xénope, un système de chapeau animal, adapté à l’identification de produits géniques capables d’induire une réponse chez l’ectoderme compétent. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que quels gènes sont nécessaires pour induire une réponse inductive. Le principal avantage de cette technique est son utilisation de l’ovocyte de xénope, comme système d’expression, pour produire et identifier des inducteurs agissant sur un tissu cible, voire des gènes agissant en amont des inducteurs.

La démonstration visuelle de cette méthode est extrêmement utile, car les étapes de dissection et de recombinaison dépendent fortement de l’étape et nécessitent une technique raffinée. Après avoir prélevé du tissu ovarien sur des grenouilles femelles anesthésiées, déchirez le tissu en petits morceaux, chacun contenant environ 10 à 20 ovocytes. Et transférez ces fragments, d’abord dans une solution fraîche d’OR2, puis dans une solution d’OR2 contenant 2,0 milligrammes par millilitre de collagénase A.Continuez en agitant doucement le mélange contenant des tissus sur un agitateur pendant une heure.

Transférez ensuite les fragments dans une solution fraîche de collagénase et agitez pendant une heure supplémentaire. Attendez-vous à observer des ovocytes défloculés à la fin de ce traitement. Procéder au lavage des ovocytes 10 fois dans l’OR2 complet, puis deux fois dans un milieu de culture d’ovocytes, abrégé en OCM.

Ensuite, placez les ovocytes dans de l’OCM frais et inspectez-les visuellement au microscope de dissection. Isolez ceux au stade six en jetant les ovocytes immatures plus petits. Ensuite, placez les ovocytes dans une boîte de Pétri recouverte d’agarose contenant de l’OCM et maintenez-les à 18 à 20 degrés Celsius jusqu’à l’injection.

Pour vous préparer à la microinjection, placez un tube capillaire en verre dans un extracteur d’aiguille, tirez-le, puis cassez les pointes du verre pour générer des aiguilles d’environ 20 micromètres de diamètre. Sur un microscope composé, mesurez les pointes des aiguilles à l’aide d’un micromètre oculaire calibré. Ensuite, poussez l’argile en une couche uniforme au fond d’une boîte de Pétri de 35 x 10 millimètres.

Ensuite, créez des rainures parallèles dans cette couche, à l’aide d’un outil semblable à une sonde de centre commercial. Remplissez le plat tapissé d’argile avec environ 2 millilitres de Ficoll à 3 % dans 1 solution saline de Barth modifiée, ou MBS. Ensuite, transférez-y les ovocytes, à l’aide d’une pipette à large calibre.

Positionnez les ovocytes dans les bosquets de manière à ce qu’ils soient maintenus en place lors de la micro-injection ultérieure. À l’aide d’un micro-injecteur, remplissez une aiguille avec environ deux microlitres d’un pool d’ARNm précédemment généré et ajustez l’équilibre pour produire une légère pression positive, ce qui empêchera le cytoplasme de l’ovocyte d’être aspiré dans l’aiguille pendant l’injection. Ensuite, injectez à chaque ovocyte 20 nanolitres d’ARN dans la région équatoriale.

Ensuite, laissez les ovocytes dans le Ficoll MBS pendant une heure, puis transférez-les doucement dans 1x MBS. Procédez à l’incubation des ovocytes pendant huit à 24 heures à 20 degrés Celsius. Pour commencer l’essai de chapeau animal, prélevez un milieu amphibien 3/4x normal, abrégé en solution NAM, des pinces fines, une boucle de cheveux, des ovocytes précédemment injectés et des embryons de xénope aux stades 11 à 11,5.

Ensuite, séparez les glissières du couvercle en verre en fragments d’environ un millimètre sur deux millimètres et passez ces morceaux à travers une flamme jusqu’à ce que leurs bords soient polis et dessinés. Ensuite, pressez l’argile en une seule couche dans un plat, comme décrit précédemment. Et utilisez une sonde de centre commercial pour créer des empreintes individuelles en forme de tasse dans ce revêtement.

Remplissez le plat avec environ deux millilitres de NAM 3/4x. Et là-bas, transférez les ovocytes injectés, en positionnant plusieurs de manière à ce que chacun soit immobilisé en une seule indentation. Pour préparer les embryons, transférez-les dans un plat contenant une solution de NAM 3/4x.

Sélectionnez un sous-ensemble de gastrula à utiliser comme témoins de stadification pour l’âge de l’ectoderme et transférez-les dans une autre boîte contenant la même solution. Et mettez cette assiette de côté. Pour les embryons qui seront utilisés dans l’assemblage du chapeau animal, retirez leurs membranes vitellines avec deux paires de pinces fines.

Ensuite, transférez la gastrula dans le plat tapissé d’argile avec les ovocytes. Pour commencer, coupez les chapeaux d’animaux des embryons à l’aide de deux paires de préceps fins, en prenant soin d’éviter le tissu équatorial. Pour générer des recombinants à l’aide de la première méthode, positionnez un chapeau d’animal de manière à ce que la surface interne entre en contact avec l’hémisphère animal d’un ovocyte, déjà positionné dans une indentation.

Et répétez ce processus pour plusieurs des ovocytes injectés. Pour vous assurer que ces recombinants sont maintenus ensemble, placez un fragment de lamelle de verre incurvé sur chacun d’eux et appliquez une pression vers le bas jusqu’à ce que l’animal soit aplati et que la lamelle entre en contact avec l’argile. Pour générer des recombinants à l’aide de la deuxième méthode, placez les capuchons et les ovocytes d’animaux ensemble dans des indentations individuelles vides dans l’argile.

Et assurez-vous que les surfaces intérieures des capuchons de l’animal sont face à l’ovocyte. Ensuite, fixez les deux tissus ensemble à l’aide de petites extensions d’argile. Une fois que plusieurs recombinants ont été générés à l’aide de l’une ou l’autre méthode, la culture et le stockage des embryons témoins ont été mis de côté à 20 degrés Celsius.

Lorsque les embryons témoins atteignent le stade souhaité, retirez les lamelles des recombinants et isolez l’ectoderme du chapeau animal à l’aide d’une pince et d’une boucle à cheveux. Procédez à la fixation des fragments ectodermiques et des embryons témoins dans MEMFA pendant une heure. Et transférez-les dans de l’éthanol et stockez ce tissu à moins 20 degrés Celsius.

Ici, des ensembles d’ovocytes ont été injectés avec des pools d’ARNm correspondant à des nombres progressivement plus petits de clones ou de colonies, puis cultivés avec des chapeaux animaux. Par la suite, le nombre de capuchons animaux dans chaque série exprimant foxe3, un marqueur normalement observé dans l’ectoderme présomptif du cristallin depuis les premiers stades de la plaque neurale jusqu’à la formation des vésicules, et utilisé ici, pour évaluer la capacité d’induction du cristallin, a été déterminé. Cette méthode a permis d’identifier le facteur nucléaire codant pour le gène ldb1, qui peut produire une réponse induisant le cristallin dans 50 des 179 cas, soit 28 % des coiffes animales évaluées.

Présentées ici, nos images d’hybridation in situ, représentant le signal foxe3, indiqué par des pointes de flèches, dans des chapeaux d’animaux cultivés avec des ovocytes injectés de ldb1 du stade 11 au stade 23 environ. Aucune expression de foxe3 n’est observée dans les capuchons d’animaux témoins correspondants placés sur des ovocytes non injectés. Lorsque des sections ont été générées à partir de ces calottes animales, l’expression de foxe3 a été observée dans les couches ectodermiques internes et externes.

L’expression dans la couche interne est caractéristique de la réponse d’un verre. Ou, comme indiqué dans les deux couches, est révélateur d’autres structures telles que la placode olfactive. À la suite de cette procédure, des méthodes telles que l’immunohistochimie, l’hybridation in situ ou la détection directe d’un gène rapporteur fluorescent peuvent être réalisées afin d’évaluer une réponse inductive dans l’ectoderme du chapeau animal.