Une étude de la complexation du mercure (II) avec Dicysteinyl tétrapeptides par spectrométrie de masse électrospray

L’objectif général de cette procédure est de préparer des complexes de peptides de mercure et de dicystéinyle sous différentes stœchiométries de réaction, et de caractériser les différents complexes formés par ionisation par électronébulisation et spectrométrie de masse à oribitrap. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les tendances de complexation des composés du mercure et des thiols, ce qui améliorera la conception rationnelle des agents chélateurs pour séquestrer les ions mercure. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite l’analyse de complexes d’ions métalliques à fragmentation négligeable.

D’autres incluent un modèle distinct de distribution isotopique du mercure. Facilité dans l’attribution de la charge et l’analyse des pics superposés par spectrométrie de masse en tandem. Bien que cette méthode donne un aperçu des complexes peptidiques de mercure, elle peut également être appliquée à d’autres complexes, en particulier avec des ions métalliques qui existent sous différentes formes isotopiques.

Dégazer un tampon de formiate d’ammonium de cinq millimolaires sous vide pendant 10 minutes et purger avec de l’argon. Répétez deux fois et conservez la solution sous l’argon. Le jour de l’utilisation, filtrez la solution tampon à travers un filtre de 0,2 micron avant utilisation.

Pour préparer des solutions de chlorure de mercure, pesez 0,2375 gramme de chlorure de mercure. Dissoudre dans 25 millilitres de tampon de formiate d’ammonium de cinq millimolaires, pour produire une solution de chlorure de mercure de 0,035 molaire. Ajoutez 0,214 millilitre de la solution de chlorure de mercure à 9,785 millilitres de tampon de formiate d’ammonium à cinq millimolaires, pour créer une solution de 0,75 millimolaire.

Recouvrez la solution obtenue avec du gaz argon. Ensuite, ajoutez 225 microlitres d’une solution mère de CGGC de cinq millimolaires à 1,275 millilitre de tampon de formiate d’ammonium à 5 millimolaires pH 7,5, pour obtenir une solution de CGGC de 0,75 millimolaire. Ensuite, préparez un rapport de un à 0,5 de solution de mercure et de CGGC en plaçant 255 microlitres de tampon de pH 7,5 de formiate d’ammonium millimolaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Ensuite, ajoutez 30 microlitres de solution de chlorure de mercure de 0,75 millimolaire dans le tube. Vortex la solution pendant 10 secondes. Ensuite, ajoutez 15 microlitres de solution de CGGC de 0,75 millimolaire dans le tube.

Agitez la solution pendant 10 secondes supplémentaires, puis laissez reposer la solution pendant 10 minutes avant de l’injecter dans le spectromètre de masse. Pour préparer le spectromètre de masse ESI, ou MS, prélevez 100 microlitres d’étalons dans une seringue en verre de 500 microlitres. Placez la seringue dans le berceau de la pompe MS.

Fixez le tube et injectez-le dans le spectromètre de masse. Configurez le nom de fichier pour l’exécution en sélectionnant l’icône de fichier et en tapant le nom du fichier. Sélectionnez le bouton Acquérir des données dans le module d’acquisition de données et collectez 150 numérisations.

Analysez le chromatogramme pour vérifier les normes d’étalonnage en ouvrant le module de traitement des données du logiciel. Ensuite, allez dans le menu Fichier et sélectionnez Ouvrir, puis le fichier dans la boîte de dialogue. Vérifiez que les pics du chromatogramme sont en corrélation avec les rapports masse/charge des étalons.

Nettoyez la seringue en verre de 500 microlitres en prélevant 500 microlitres de méthanol de qualité HPLC, puis en la distribuant dans un bécher. Prélevez 500 microlitres de méthanol de qualité HPLC dans la seringue en verre et rincez le système. Sélectionnez le module de configuration de méthode du logiciel pour définir les paramètres.

Choisissez le menu du mode de balayage et identifiez les analyseurs FTMS, puis cliquez sur OK. Ensuite, cliquez sur les différentes icônes de la page de vue en temps réel du spectre pour configurer les paramètres comme détaillé dans le protocole texte. Pour faire fonctionner le tampon, placez 500 microlitres de tampon de formiate d’ammonium millimolaire dans la seringue en verre de 500 microlitres.

Placez-le dans le berceau de la seringue de la pompe MS et détachez le tube. Faites passer le tampon dans le tube pendant une à deux minutes. Configurez le nom de fichier pour l’exécution en sélectionnant l’icône de fichier et en tapant le nom du fichier.

Sélectionnez le bouton d’acquisition de données dans le module et collectez 150 numérisations. Cliquez sur le bouton Arrêter l’exécution pour arrêter la collecte après 150 numérisations. Ensuite, ouvrez le module de navigateur de données, allez dans le menu Fichier et sélectionnez Ouvrir, puis le fichier dans la boîte de dialogue.

Vérifiez qu’il n’y a pas de pics de surcharge de masse 483, 683, 1163 et 1363 qui ressemblent aux complexes peptidiques de peptide ou de peptide d’ion mercure. Faites fonctionner la solution de un à 0,5 rapport mercure/CGGC en plaçant 250 microlitres de l’échantillon dans la seringue. Placez la seringue dans le berceau de la pompe MS.

Fixez le tube et amorcez l’appareil. Pour obtenir 150 analyses de données, ouvrez le module de navigateur, allez dans le menu Fichier et sélectionnez Ouvrir. Ensuite, sélectionnez le fichier dans la boîte de dialogue.

Vérifiez que le chromatogramme contient des pics, y compris celui du peptide CGGC seul. Un aspect essentiel de cette procédure consiste à s’assurer que les analytes de l’analyse précédente sont complètement éliminés avant chaque analyse du mélange réactionnel. La minimisation de la contamination de l’échantillon par les analytes de transfert est assurée par un nettoyage minutieux de la ligne d’injection.

Lavez la seringue en aspirant avec 500 microlitres de tampon de formiate d’ammonium, puis en distribuant le tampon dans un bécher. Ensuite, sélectionnez le bouton de déchets sur le MS et rincez le tube trois fois avec 500 microlitres de tampon de formiate d’ammonium. Lavez ensuite la seringue, en aspirant 500 microlitres de méthanol et en la distribuant dans un bécher.

Rincez une fois le tube avec 500 microlitres de méthanol. Ensuite, sélectionnez le bouton du détecteur de charge sur le MS. Après avoir ajouté 500 microlitres de tampon de formiate d’ammonium dans la seringue, placez la seringue dans le berceau de la pompe MS. Fixez le tube et amorcez l’appareil.

Sélectionnez un nom de fichier pour l’exécution de la mémoire tampon comme précédemment et obtenez 150 analyses avant de cliquer sur le bouton d’arrêt de l’exécution. Ouvrez le module de navigation de données pour vérifier que le chromatogramme ne contient pas de pics entre le mercure précédent et le CGGC. Répétez la procédure d’analyse pour les échantillons CGGC restants.

Pour préparer un rapport de un à 0,5 entre le mercure et la solution CEEC, placez 255 microlitres de 5 millimolaires de formiate d’ammonium pH 7,5 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajoutez 30 microlitres de solution de chlorure de mercure de 0,75 millimolaire dans le tube. Après avoir fait tourbillonner la solution pendant 10 secondes, ajoutez 15 microlitres d’une solution CEEC de 0,75 millimolaire dans le tube.

Vortex la solution pendant 10 secondes supplémentaires. Et laissez la solution reposer pendant 10 minutes avant l’injection du spectromètre de masse. Répéter la procédure d’analyse à l’aide d’échantillons CEEC et de mélanges réactionnels d’ions mercure et de CEEC.

Un spectre de masse représentatif est représenté. Après 10 minutes, les différents types de complexes peptidiques de mercure sont visibles pour le mélange réactionnel de un à 0,5 de mercure à CGGC, ainsi qu’un pic peptidique de 339,08 et un dimère peptidique de 677,15. Comme observé dans le spectre précédent, le mélange réactionnel mercure-CGGC contient des pics similaires.

Par exemple, le pic 539.03 indique le complexe un à un de mercure et de peptide. La vue agrandie présente le motif isotopique caractéristique du mercure correspondant aux sept principaux isotopes naturels du mercure. On observe également un ou deux complexes mercure-CGGC, comme indiqué précédemment pour le tripeptide de dicystéinyle de mercure.

Ce complexe apparaît dans les trois mélanges réactionnels de mercure et de CGGC. Il a été facilement analysé par un profil isotopique distinct du mercure avec un pic monoisotopique à 877. Cependant, si le mercure est en excès, comme dans le mélange réactionnel de un à 0,5 mercure à CGC, deux à deux autres complexes de mercure à CGCG sont détectés.

Cette signature isotopique du mercure correspond à un complexe de deux mercure calculé à l’aide du programme chimique. La masse monoisotopique protonée théorique correspond à une valeur de surcharge de masse de 1077, qui est le neuvième pic de l’amas isotopique observé. Un spectre représentatif montrant divers complexes de mercure à PECO est présenté.

Il est intéressant de noter le chevauchement des pics associés au mercure aux adduits CEEC dans la charge plus un montrant un pic monoisotopique à 883. Et dans la charge plus deux, avec une valeur de crête monoisotopique calculée de 1765. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures, si elle est exécutée correctement.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de dégazer vos tampons et de rincer abondamment la ligne pour éviter les analytes de transfert. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire des protons, du carbone 13 et du mercure 199, ou la potentiométrie, peuvent être utilisées pour fournir une détermination plus précise des complexes de contenu dans la phase de solution. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’analyser divers complexes de mercure et leurs modèles de distribution isotopique distincts du mercure et leurs formations de charge à l’aide de la spectrométrie de masse orbitrap avec ionisation par électronébulisation, ainsi que de distinguer les pics qui se chevauchent par analyse MS en tandem.

N’oubliez pas que travailler avec des solutions de mercure peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.