Name: Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Apprenez l'immunomarquage immunogold post-embedding pour analyser quantitativement les récepteurs membranaires au niveau des synapses ruban rétiniennes. Cette méthode haute résolution permet d'étudier la localisation précise des protéines synaptiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par les programmes intra-muros de l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NINDS) et l&#39;Institut national sur la surdité et d&#39;autres troubles de la communication (NIDCD), des National Institutes of Health (NIH). Nous remercions l&#39;installation NINDS EM et l&#39;avancée noyau NIDCD d&#39;imagerie (Code # ZIC DC 000081-03) pour l&#39;assistance.

Soin et la manipulation des animaux étaient conformes aux NIH de protection des animaux et les lignes directrices utilisation Comité. jour postnatal (P) 15-21 Les rats Sprague-Dawley, injectés avec 1-1,2% CTB bilatéralement par le colliculus supérieur, ont été maintenus sur un 12: la lumière de 12 h: cycle d&#39;obscurité. 1. Fixation de tissu rétinien <ol><li> Assembler les matériaux et outils suivants: Un microscope à dissection, 2 pinces avec des pointes très fines, des ciseaux, du papier filtre de cellulose, pipette en plastique et une lame de microscope. </li><li> Anesthésier le rat dans une chambre fermée avec 2,0 ml halothane (e anesthésique pour inhalation). Déterminer anesthésie suffisante par ces méthodes: l&#39;absence de retrait de la patte arrière après pincement de l&#39;orteil, ou le manque de réflexe de clignement. Puis décapiter immédiatement avec une guillotine. Retirez les yeux avec une paire de ciseaux de l&#39;iris et les placer dans un plat en verre contenant du paraformaldéhyde 4% dans 0,1 M de tampon phosphate (PB) à pH 7,4. </li><li> Utilisation du microscope à dissection, retirez le maïsea en coupant l&#39;avant du globe oculaire. Retirer la lentille et vitré de la surface de la rétine interne avec une pince. </li><li> Peler la sclérotique avec les deux pinces jusqu&#39;à ce que la rétine est isolé de la bonnette. </li><li> Couper la rétine immédiatement en 100 - 200 bandes um d&#39;épaisseur avec un rasoir, et sous réserve de la fixation de changement de pH. </li><li> Fixer des bandes de la rétine dans 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de PB à pH 6,0 pendant 20 à 30 minutes, puis dans du paraformaldehyde à 4%, plus 0,01% de glutaraldéhyde à un pH de 10,5 pendant 10 à 20 min à température ambiante. </li><li> Après plusieurs lavages dans du PB avec 0,15 mM de CaCl2 (pH 7,4 à 4 ° C), cryoprotect les bandes de la rétine avec la glycérine (60 minutes à chaque fois dans 10%, 20%, 30%, O / N à 30%) dans 0,1 M PB avant le gel substitution. </li></ol> 2. Gel de substitution NOTE: Cette méthode de congélation-substitution est modifié à partir d&#39;un protocole publié plus tôt 19,20. En outre, il est crucial que les instruments sont très froids (porter des gants); oinon, le tissu peut décongeler partiellement au toucher avec les instruments. Toutes ces étapes sont effectuées dans la chambre AFS et les instruments ne sont jamais autorisés à se déplacer au-dessus du bord de la chambre. De même, le refroidissement correct de tous les produits chimiques utilisés dans l&#39;AFS est nécessaire. <ol><li> Plongez-geler les bandes de la rétine dans le propane liquide à -184 ° C dans un instrument EM de cryoconservation (PCC). L&#39;utilisation d&#39;un pinceau fin, placer les échantillons sur de petits morceaux de ruban adhésif double-bâton attachés aux moignons métalliques qui vont à l&#39;extrémité des tiges plongeant (évacuent tampon en utilisant la brosse). </li><li> Plongez les tiges dans le propane liquide et y maintenir pendant environ 5 secondes, puis transfert à l&#39;instrument de gel-substitution automatique (AFS) en utilisant une chambre de transport petite qui est rempli avec de l&#39;azote liquide ( &#39;LN 2 refroidi récipient de transfert de cryo&#39;). </li><li> Après avoir placé l&#39;échantillon congelé et instruments (forceps et scalpel) dans l&#39;AFS, refroidir les instruments dans la chambre pour soiminutes sieurs avant de toucher le tissu, ou les refroidir en plaçant les pointes des instruments pendant quelques secondes dans la petite chambre de transport (rempli d&#39;azote liquide ( &#39;LN 2 refroidi récipient de transfert de cryo&#39;)). </li><li> Une fois dans l&#39;AFS, retirer l&#39;échantillon et la bande du stub à l&#39;aide d&#39;une amende scalpel. Aussi, gardez le contrôle de flux d&#39;azote gazeux, TF (TF est décrit comme une «commande de régulateur pour LN 2 vaporisateur &#39;) ouverte au cours de ces procédures. </li><li> Avant de placer le tissu congelé dans les supports plats-enrobage (avant la mise en place de la SPA), découper un cercle mince à partir d&#39;une feuille de plastique transparent et placez-le dans le bas de la porte de manière à recouvrir le fond de chaque puits. Ceci permet l&#39;élimination relativement plus facile des blocs d&#39;échantillons polymérisés lorsque vous avez terminé. NOTE: Auparavant, nous avons utilisé une méthode alternative pour les détenteurs d&#39;incorporation plats, et en utilisant des capsules doubles Reichert + gélatine (voir Petralia et Wenthold, 1999) &lt;sup&gt; 20. </li><li> Utilisez la séquence suivante automatique dans l&#39;AFS (en utilisant la terminologie de l&#39;instrument): T1 = -90 ° C pendant 32 h, S1 = augmenter la température de 4 ° C / h (11,3 h), T2 = -45 ° C pendant 50 h, S2 = augmenter la température de 5 ° C / h (9 h), T3 = 0 ° C pendant 40 heures (total = 142.3 h). Il peut prendre de deux à quatre heures pour placer les échantillons dans l&#39;AFS (à -90 ° C) avant de commencer la séquence chronométrée. </li><li> Immerger les coupes congelées à 1,5% d&#39;acétate d&#39;uranyle dans le méthanol à -90 ° C pendant&gt; 32 h dans l&#39;AFS. Placez deux morceaux de tissus (généralement) dans chacune des sept puits dans le support en aluminium plate-enrobage (trois insèrent dans les AFS). <ol><li> Placez le tissu + bande dans l&#39;acétate d&#39;uranyle / méthanol dans les puits et enlever la bande plus tard, juste avant de commencer l&#39;intégration moyen (comme Lowicryl HM20) infiltration, si elle est trop difficile à enlever le tissu de la bande. </li></ol></li><li> Puis augmenter progressivement la température à -45 ° C (+ 4 ° C par heure; dans la séquence automatique). </li><li> Laver les échantillons trois fois dans le méthanol préalablement refroidi, en utilisant une pipette à pointe fine en plastique pour enlever l&#39;ancienne solution de chaque détenteur plate-enrobage, puis en utilisant une autre pipette en plastique standard pour ajouter le méthanol frais préalablement refroidi. </li><li> Puis, en utilisant la même méthode, infiltrer les échantillons au fur et à des résines de température enrobage faibles telles que l&#39;incorporation moyen (HM20 / méthanol à 1: 1 et 2: 1, chacun pendant 2 heures, suivi par de la résine pure pendant 2 heures, puis modifier les résines et de garder O / N). </li><li> Modifier à nouveau la résine, le lendemain, en ajustant le niveau de la résine pour atteindre juste le bord supérieur du puits. </li><li> Polymériser les échantillons (-45 ° C à 0 ° C en séquence automatique, + 5 ° C par heure) avec une lumière UV pendant 40 heures. </li><li> Ensuite, retirer les échantillons provenant de l&#39;AFS. Typiquement, les blocs échantillons montrent encore un peu de couleur rose en couleur. Placer les échantillons proches de la lumière fluorescente dans la hotte pour émanation chimique, à la température ambiante O / N ou plus jusqu&#39;à ce qu&#39;ils apporeille tout à fait clair. </li></ol> 3. Postembedding EM immunomarquage Immunocytochimie NOTE: Postembedding immunocytochimie est effectuée comme décrit 23,24,25. <ol><li> Coupez 1 um sections avec ultramicrotome, sections de tache avec 1% toluidine-bleu, et de les examiner pour la section orientation; orienter le bloc de tissu pour réaliser le plan transversal optimal de la coupe. </li><li> Couper 70 coupes ultrafines nm d&#39;épaisseur avec ultramicrotome et les recueillir sur Formvar carbone revêtues de nickel grilles à sous. </li><li> Grilles lavage une fois dans de l&#39;eau distillée 2 O, suivie par une solution saline tamponnée au Tris (TBS trois fois, du tampon Tris 0,05 M, NaCl 0,7%, pH 7,6) lavage. </li><li> Incuber grilles dans 20 gouttes ul de 5% de BSA dans du TBS pendant 30 minutes, puis à 20 gouttes ul d&#39;un mélange contenant de chèvre anti-CTB (1: 3000) et un anticorps dirigé contre une sous-unité de récepteurs NMDA (anti-lapin GluN2A 01:50 , GluN2B 1:30), ou un anticorps anti-lapin GluA2 / 3 (1:30)dans du TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) avec 2% de BSA et 0,02 M NaN 3 O / N à température ambiante. </li><li> Laver les grilles sur trois gouttes séparées (20 pi) du TBS (pH 7,6) pour 10, 10 et 20 min, suivi par du TBS (pH 8,2) pendant 5 min. </li><li> Incuber grilles pendant 2 heures sur des gouttes (20 pi) d&#39;un mélange contenant âne IgG anti-lapin (1:20) couplé à 10 nm particules d&#39;or et d&#39;âne anti-IgG de chèvre (1:20) couplés à des particules d&#39;or de 18 nm dans TBST (pH 8,2) avec 2% de BSA et 0,02 M de NaN3. </li><li> Lavez les grilles dans des gouttes de 20 pi de TBS (pH 7,6) pour 5, 5 et 10 min, puis dans l&#39;eau ultra-pure, puis les sécher. </li><li> Grilles Counterstain avec 5% d&#39;acétate d&#39;uranyle et 0,3% de plomb citrate de H 2 O distillée pour 8 et 5 min dans des conditions sombres, respectivement. </li><li> Pour les expériences triple marquage, incuber grilles O / N à température ambiante avec 20 gouttes ul d&#39;un mélange d&#39;anticorps anti-chèvre de CTB (1: 3000), anti-souris PSD-95 (1: 100) et anti-lapin GluN2A (1 : 50). Puis incuber grilles pendant 2 heures sur 20 ul gouttes d&#39;un mélange d&#39;IgG couplé à 18, 10, 5 et des particules d&#39;or de la nm dans du TBST (pH 8,2) avec 2% de BSA et 0,02 M de NaN3. Gardez les mêmes procédures que le double marquage pour le lavage et contre-coloration entre et après les anticorps incubation. </li><li> Les témoins ont été effectuées dans lesquelles les anticorps secondaires ont été appliqués seuls. </li><li> Voir les grilles sur un EM et numériser des images. Traiter les chiffres définitifs dans Adobe Photoshop 6.0 ​​uniquement pour la luminosité et le contraste si nécessaire 24. </li></ol> 4. Quantification <ol><li> Sélectionnez manuellement les zones de la couche plexiforme interne (IPL) sans trous ou des fissures à 8,000X grossissement, puis photomontage au hasard sur toute la profondeur de l&#39;IPL à 25,000X grossissement. </li><li> Identifier les dendrites RGC au cône dyades bipolaires quand ils a) contenir le signal CTB rétrograde transporté (grandes particules d&#39;or), b) présentent bien définie membranes, Fentes, et des densités postsynaptiques, c) contiennent au moins deux petite partie de l&#39;oricles au sein du PSD, ou plus d&#39;une petite particule d&#39;or le long de la membrane plasmique extrasynaptique. </li><li> Recueillir 45 - 55 dendrites RGC, sur la base de critères ci-dessus, pour l&#39;analyse quantitative. </li><li> Mesurer les longueurs de la PSD et la membrane plasmique extrasynaptique RGC de dendrites individuelles avec le logiciel NIH ImageJ. Nombre de particules d&#39;or de 10 nm à l&#39;intérieur de la membrane associée à la membrane comme, par rapport à une épaisseur moyenne de 7-9 nm pour la 26 membrane plasmique. </li><li> Calculer la densité des particules en nombre de particules d&#39;or par micromètre linéaire (or / um). Mesurer la distance entre le centre de chaque particule d&#39;or et au milieu de la PSD (pour la localisation synaptique) ou le bord de la PSD (pour la localisation extrasynaptique). </li><li> Effectuer une analyse statistique par le logiciel. Utilisez bilatéral tests t pour comparer les moyennes. Conclure importance lorsque P &lt;0,05. Sauf indication contraire, les valeurs de rapport sous forme de moyenne ± SEM 18. </li></ol>

<ol><li>Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+endogenous+excitatory+amino+acids+from+turtle+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors.</a> Nature. 341, 536-539 (1989).</li>
<li>Wässle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).</li>
<li>Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+activation+of+two+types+of+glutamate+receptor+mediates+excitation+of+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 428, 175-197 (1990).</li>
<li>Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+inner+retina%3A+paired+recordings+of+bipolar+cells+and+neurons+of+the+ganglion+cell+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer.</a> J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+NMDA+and+non-NMDA+receptors+to+the+light-evoked+input-output+characteristics+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells.</a> Neuron. 11, 725-738 (1993).</li>
<li>Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA-preferring+receptors+mediate+excitatory+synaptic+inputs+to+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells.</a> J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).</li>
<li>Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake+limits+synaptic+excitation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells.</a> J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).</li>
<li>Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+excitatory+synaptic+currents+in+salamander+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells.</a> J. Physiol. 486, 207-221 (1995).</li>
<li>Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+PDZ+%28DHR%2C+GLGF%29+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains.</a> Trends. Biochem. Sci. 20, 350(1995).</li>
<li>Kim, E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ+domain+proteins+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PDZ domain proteins of synapses.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).</li>
<li>Migaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+long-term+potentiation+and+impaired+learning+in+mice+with+mutant+postsynaptic+density-95+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein.</a> Nature. 396, 433-439 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+immunocytochemical+detection+of+PSD-95%2C+PSD-93%2C+SAP-102%2C+and+SAP-97+at+postsynaptic%2C+presynaptic%2C+and+nonsynaptic+sites+of+adult+and+neonatal+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex.</a> Synapse. 40, 239-257 (2001).</li>
<li>Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+members+of+the+PSD-95+family+of+MAGUK+proteins+at+the+synaptic+region+of+inner+and+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Synapse. 40, 258-268 (2001).</li>
<li>Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+developmental+expression+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR2A+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina.</a> J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+subcellular+distribution+of+NMDA+receptor+subunit+NR2B+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina.</a> J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).</li>
<li>Ottersen, O. P., Landsend, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+glutamate+receptors+at+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of glutamate receptors at the synapse.</a> Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetralia%2C+RS+%22Receptor+Localization%3A+Laboratory+Methods+and+Procedures%22">Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures</a>. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).</li>
<li>Petralia, R. S., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry of NMDA receptors.</a> Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).</li>
<li>Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+and+NMDA+receptors%3A+similarities+and+differences+in+their+synaptic+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).</li>
<li>Qin, P., Pourcho, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+AMPA-selective+glutamate+receptor+subunits+in+the+cat+retina%3A+a+light-+and+electron-microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study.</a> Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).</li>
<li>Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+GABAergic+amacrine+cells+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Visual.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina.</a> Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+perisynaptic+and+synaptic+localization+of+NMDA+and+AMPA+receptors+on+ganglion+cells+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-+and+Pathway-Specific+Localization+of+NMDA+Receptors+and+Scaffolding+Proteins+at+Ganglion+Cell+Synapses+in+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina.</a> J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).</li>
<li>Peters, A., Palay, S., Webster, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22The+fine+structure+of+the+nervous+system%3A+neurons+and+their+supporting+cells%2C+3rd+ed%22">The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabotropic+glutamate+receptor+%28mGluR1%29+is+concentrated+at+perisynaptic+membrane+of+neuronal+subpopulations+as+detected+by+immunogold+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction.</a> Neuron. 11, 771-787 (1993).</li>
<li>Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-substitution+and+Lowicryl+HM20+embedding+of+fixed+rat+brain%3A+Suitability+for+immunogold+ultrastructural+localization+of+neural+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hist.+Cyt%22%5BJournal%5D)">Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens.</a> J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).</li>
<li>Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+AMPA+receptor+subunits+at+a+glutamate+synapse%3A+A+quantitative+immunogold+analysis+of+hair+cell+synapses+in+the+rat+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti.</a> J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).</li>
<li>Petralia, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+NMDA+receptors+at+extrasynaptic+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations.</a> Neuroscience. 167, 68-87 (2010).</li>
<li>Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMerighi%2C+A+%22Electron+Microscopic+Immunocytochemistry%3A+Principles+and+Practice%22">Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice</a>. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).</li>
<li>Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+a+type+of+peripheral+glutamate+synapse%3A+the+afferent+synapses+of+hair+cells+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear.</a> Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).</li>
<li>Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21, 545-559 (1998).</li>
<li>Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+expression+of+AMPA+and+NMDA+receptors+in+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses.</a> Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).</li>
<li>Grimes, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+inhibitory+microcircuitry+regulates+retinal+signaling+near+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold.</a> J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).</li>
<li>Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+ionotropic+glutamate+receptors+at+dendrodendritic+synapses+in+the+rat+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Nous avons décrit quatre techniques pour la réussite de l&#39;intégration post-immuno EM quantitative: 1) à court et à faible fixation, 2) de gel-substitution, 3) post-intégration immunomarquage, et 4) la quantification. EM immunologique permet la détection de protéines spécifiques dans des coupes de tissus ultraminces. Des anticorps marqués avec des particules d&#39;or peuvent être directement visualisées en utilisant EM. Bien que puissante dans la détection de la localisation subsynaptic d...

Le glutamate est le neurotransmetteur excitateur majeur dans la rétine 1. Ganglionnaires rétiniennes de cellules (CGR), recevoir une entrée synaptique glutamatergique de cellules bipolaires 2, les neurones de la rétine de sortie qui envoient des informations visuelles au cerveau. Des études physiologiques ont montré que l&#39;excitation synaptique du CGR est médiée par postsynaptique récepteurs NMDA (de NMDARs) et les récepteurs AMPA (AMPA) 3,4,5. Bien que les courants post-synaptiques excitateurs (de EPSCs) dans CGR sont médiés par des récepteurs AMPA et NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs miniatures spontanés (mEPSCs) sur CGR présentent seulement une composante AMPA médiation 4,5,9. Toutefois, la réduction glutamate absorption révélé une composante de NMDAR dans EPSCs spontanées 5, ce qui suggère que NMDARs sur dendrites RGC peuvent être situés à l&#39;extérieur des synapses excitateurs. guanylate kinase associée à la membrane (de MAGUKs) tels que PSD-95 que les récepteurs de neurotransmetteurs grappe, y compris les récepteurs de glutamate et de canal ioniques sur les sites synaptiques, présentent également des profils d&#39;expression subsynaptic distinctes 10,11,12,13,14. Au cours des dernières décennies, l&#39;immunohistochimie confocale et-enrobage pré microscope électronique (EM) immunohistochimie ont été employés pour étudier l&#39;expression du récepteur de la membrane. Bien immunocoloration confocal révèle les grandes tendances de l&#39;expression du récepteur, sa résolution inférieure, il est impossible d&#39;utiliser de distinguer localisation subcellulaire. Pré-enrobage des études de Em In rétine des mammifères indiquent que les sous-unités NMDAR sont présents dans les éléments post-synaptiques à cônes bipolaires synapses à ruban de cellules 15,16,17. Ceci est en contraste apparent à l&#39;évidence physiologique. Toutefois, la diffusion du produit de réaction est un artefact bien connue dans la méthode de pré-enrobage immunoperoxydase. Par conséquent, cette approche ne donne généralement pas de données statistiques fiables et peut exclure distinction entre la localisation de membrane synaptique par rapport extrasynaptique 18,19,20,21 de la membrane. SurD&#39;autre part, les données physiologiques et anatomiques sont compatibles avec une localisation synaptique des récepteurs AMPA sur CGR 3,5,7,9,22. Ainsi, les récepteurs du glutamate et à la rétine MAGUKs ruban synapse sont localisés, non seulement pour le post-synaptiques, mais aussi dans les compartiments membranaires ou périsynaptiques extrasynaptiques. Cependant, une analyse quantitative à haute résolution de ces protéines membranaires dans un ruban synapse rétine est encore nécessaire. Ici, nous avons développé une technique postembedding EM immunologique d&#39;examiner la localisation subsynaptic de sous-unités NMDAR, sous-unités AMPAR et PSD-95 puis en estimant le nombre, la densité et la variabilité de ces protéines au niveau des synapses SUR DES CGR de rat marquée en utilisant la sous-unité de la toxine cholérique B (CTB) méthodes de traçage rétrograde.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>EMS</td><td>16019</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-8106</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>JT Baker</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lowicryl HM 20</td><td>Polysciences</td><td>15924-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>04997-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GluN2A</td><td>Millipore</td><td>AB1555P</td><td>Dilution 1/50</td></tr><tr><td>Anti-GluN2B</td><td>Millipore</td><td>AB1557P</td><td>Dilution 1/30</td></tr><tr><td>Anti-GluA2/3</td><td>Millipore</td><td>AB1506</td><td>Dilution 1/30</td></tr><tr><td>Anti-PSD-95</td><td>Millipore</td><td>MA1&ndash ; 046</td><td>Dilution 1/100</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin IgG-10 nm particules d’or</td><td>EMS</td><td>25704</td><td>Dilution 1/20</td></tr><tr><td>Âne anti-souris IgG-10 nm particules</td><td>d’or EMS</td><td>25814</td><td>Dilution 1/20</td></tr><tr><td>Âne anti-souris IgG-5 nm particules</td><td>d’or EMS</td><td>25812</td><td>Dilution 1/20</td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre IgG-18 nm particules d’or</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-215-147</td><td>Dilution 1/20</td></tr><tr><td>Grilles en nickel revêtues de carbone Formvar.</td><td>EMS</td><td>FCF2010-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>EMS</td><td>22400-1</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>EMS</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de plomb</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AFS</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM CPC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEOL 1200 EM</td><td>Azote liquide JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Roberts Oxygène</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propane</td><td>Roberts Oxygène</td><td></td><td></td></tr><tr>Liste<td>CTB</td><td>Laboratoires biologiques</td><td>104</td><td>1 - 1,2 %</td></tr><tr><td>Liste anti-CTB</td><td>Laboratoires biologiques</td><td>703</td><td>Dilution 1/4 000</td></tr></tbody></table>

haute résolution quantitative immunomarquage analyse des récepteurs membranaires au rétiniennes synapses ruban

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) reçoivent un apport glutamatergique excitateur des cellules bipolaires. L’excitation synaptique des CGR est médiée postsynaptiquement par les récepteurs NMDA (NMDAR) et les récepteurs AMPA (AMPAR). Les données physiologiques ont indiqué que les récepteurs du glutamate au niveau des CGR sont exprimés non seulement dans les compartiments membranaires postsynaptiques, mais aussi dans les compartiments membranaires périsynaptiques ou extrasynaptiques. Cependant, les emplacements anatomiques précis des récepteurs du glutamate au niveau des synapses RGC n’ont pas été déterminés. Bien qu’une analyse quantitative à haute résolution des récepteurs du glutamate au niveau des synapses centrales soit largement utilisée, cette approche n’a eu qu’un succès limité dans la rétine. Nous avons développé une méthode d’immuno-intégration post-encastrable pour l’analyse des récepteurs membranaires, permettant d’estimer le nombre, la densité et la variabilité de ces récepteurs au niveau des synapses du ruban rétinien. Nous décrivons ici les outils, les réactifs et les étapes pratiques nécessaires pour : 1) la préparation réussie de la fixation rétinienne, 2) la substitution par congélation, 3) l’immunocytochimie post-intégration au microscope électronique (EM) Immunogold et 4) la visualisation quantitative des récepteurs du glutamate au niveau des synapses en ruban.

Les résultats présentés ici montrent remarquablement différents modèles de localisation de subsynaptic Glua 3.2 et NMDARs dendrites sur RGC dans la rétine de rat, comme décrit précédemment 24,25. 77% de particules de 2/3 Glua immunomarquage dans RGC profils dendritiques étaient situés au sein de la PSD (figure 1A), similaire à la plupart des synapses centrales. Cependant, NMDARs étaient situées soit synaptique ou extrasynaptically. 83% de particules de GluN2A ...

La méthode de post-intégration immunogold est l’un des moyens les plus efficaces de fournir des analyses à haute résolution de la localisation subcellulaire de molécules spécifiques. Nous décrivons ici un protocole permettant d’analyser quantitativement les récepteurs du glutamate au niveau des synapses du ruban rétinien.

Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

L'objectif général de cette expérience est de développer une nouvelle approche permettant d'analyser quantitativement les protéines membranaires aux synapses en ruban de la rétine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie rétinienne, comme la localisation précise des protéines au niveau des synapses au sein du circuit. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'estimer le nombre, la densité et la rapidité de plusieurs protéines aux synapses en ruban de la rétine.La procédure de substitution à froid et de microtome ultramince est démontrée par Ron Petralia et Ya-Xian Wang du centre d'imagerie avancée du NIDCD. Pour commencer cette procédure, disséquez un globe oculaire au microscope. Pour ce faire, retirez d'abord la cornée.Ensuite, retirez le cristallin et le vitré de la surface inter-rétinienne à l’aide d’une pince. Puis, épluchez la sclérotique jusqu’à ce que la rétine soit isolée de la cupule oculaire. Découpez immédiatement la rétine en bandes de 100 à 200 micromètres d’épaisseur à l’aide d’un rasoir.Ensuite, mélanger les bandes de rétine dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du tampon phosphate 0,1 molaire. Puis, dans du paraformaldéhyde à 4 % additionné de glutaraldéhyde à 0,01 %, à température ambiante. Après plusieurs lavages dans le tampon phosphate contenant du chlorure de calcium à 0,15 millimolaire, cryoprotéger les bandes rétiniennes avec du glycérol dans du tampon phosphate 0,1 molaire, avant la substitution à froid. Avant de placer le tissu congelé dans les porte-échantillons plats, découper un fin cercle dans une feuille de plastique transparent et le placer au fond de chaque porte-échantillon afin de faciliter le retrait de la boîte d'échantillon polymérisée une fois terminé.Maintenant, configurez la séquence automatique dans le SFA. Remplissez le SFA avec de l'azote liquide et placez les porte-échantillons plats dans le SFA. Remplissez-les avec de l'acétate d'urayle à 1,5 % dans du méthanol et prérefroidissez-les.Pour congeler rapidement les bandes rétiniennes dans du propane liquide à 184 degrés Celsius, utilisez un pinceau fin pour placer les échantillons sur de petits morceaux de ruban adhésif double face fixés sur les supports métalliques situés à l'extrémité des tiges de trempe. Ensuite, absorbez l'excès de tampon à l'aide du pinceau. Plongez les tiges dans le propane liquide pendant environ cinq secondes.Ensuite, transférez-les vers le SAF à l’aide d’une petite chambre de transport remplie d’azote liquide. Après avoir placé l’échantillon congelé ainsi que les instruments, tels que la pince et le scalpel, dans le SAF, laissez refroidir les instruments dans la chambre pendant plusieurs minutes avant de toucher le tissu. Sinon, refroidissez-les en plongeant les extrémités des instruments pendant quelques secondes dans la petite chambre de transport remplie d’azote liquide.Ensuite, retirez l'échantillon et le ruban adhésif du porte-objet à l’aide d’un scalpel fin. Puis, placez deux morceaux de sections congelées dans chacun des sept puits du porte-échantillon en aluminium avec de l'acétate d'urayle à 1,5 % dans le méthanol. Conservez-les à 90 degrés Celsius pendant au moins 32 heures dans le AFS.Ensuite, augmentez progressivement la température jusqu'à 45 degrés Celsius selon la séquence automatique. Après cela, lavez les échantillons trois fois dans du méthanol prérefroidi. Puis, imbibez progressivement les échantillons de résines d'inclusion à basse température en tant que milieu d'inclusion.Le jour suivant, changez à nouveau la résine et ajustez le niveau de résine afin d'atteindre le bord supérieur des puits. Placez la lampe à lumière UV sur le AFS et polymérisez les échantillons à l'aide de la lumière UV dans le AFS jusqu'à la fin de la séquence automatique. Ensuite, retirez les échantillons du AFS.Typiquement, les blocs d'échantillons présentent encore une certaine teinte rose et de la couleur. Placer les échantillons près de la lumière fluorescente dans la hotte chimique à température ambiante pendant la nuit, ou jusqu'à ce qu'ils apparaissent complètement transparents. À cette étape, couper des sections ultrafines de 70 nanomètres d'épaisseur à l'aide d'un ultramicrotome, et les récupérer sur des grilles en nickel recouvertes de formvar et de carbone.Lavez les grilles une fois à l'eau distillée, puis effectuez trois lavages au TBS. Incubez ensuite les grilles dans 20 microlitres de BSA à 5 % dans le TBS pendant 30 minutes, puis dans 20 microlitres d'un mélange contenant un anticorps anti-CTB de chèvre et un anticorps dirigé contre une sous-unité de NMDAR, toute la nuit à température ambiante. Par la suite, lavez les grilles trois fois avec 20 microlitres de TBS à chaque fois, à un pH de 7,6.Ensuite, laver les grilles une fois avec du TBS à pH 8,2 pendant cinq minutes. Incuber les grilles pendant deux heures avec 20 microlitres d'un mélange contenant une IgG d'âne anti-lapin couplée à des particules d'or de 10 nanomètres et une IgG d'âne anti-chèvre couplée à des particules d'or de 18 nanomètres. Après deux heures, laver les grilles trois fois avec 20 microlitres de TBS à pH 7,6, puis effectuer un lavage à l'eau ultra-pure et laisser sécher les grilles à l'air.Ensuite, contre-colorer les grilles avec de l'acétate d'uranyle à 5 % dans de l'eau distillée pendant huit minutes, suivies par du citrate de plomb à 0,3 % dans de l'eau distillée pendant cinq minutes à l'abri de la lumière. Pour les expériences de triple marquage, incuber les grilles toute la nuit à température ambiante avec 20 microlitres d'un mélange d'anticorps anti-chèvre CTB, anti-souris PSD-95 et anti-lapin UN2A. Puis, incuber les grilles pendant deux heures avec 20 microlitres d'un mélange d'IgG couplées à des particules d'or de 18, 10 et 5 nanomètres.Dans cette section, commencez par régler la barre d'échelle. Ensuite, mesurez la longueur de la PSD des dendrites individuelles des cellules ganglionnaires de la rétine à l'aide du logiciel ImageJ. Puis, comptez les particules d'or situées à moins de 10 nanomètres de la membrane, en tenant compte d'une épaisseur moyenne de sept à neuf nanomètres pour la membrane plasmique.Calculez la densité de particules comme étant le nombre de particules d'or par micromètre linéaire. Ensuite, mesurez la distance entre le centre de chaque particule d'or et le milieu de la PSD pour une localisation synaptique, ou le bord de la PSD, pour une localisation extrasynaptique. Cette image montre le marquage double par immunogold de GluA2/3 et de CTB.Voici la ribbon pré-synaptique et les petits grains d'or sont regroupés dans la PSD des prolongements des cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Cette image montre le double marquage immuno-or de GluN2B et de CTB. Les petits grains d'or se trouvent sur la membrane plasmique extrasynaptique.Cette image montre le marquage immunogold double de GluN2A et de CTB. De façon similaire à GluA2/3, de petites particules sont regroupées au sein de la PSD. Le marquage immunogold triple de GluN2A, de PSD-95 et de CTB est présenté ici.Les particules d'or marquant GluN2A et les particules d'or marquant PSD-95 sont co-localisées au sein de la PSD sur les dendrites individuelles des cellules ganglionnaires rétiniennes positives pour CTB. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de fixer le tissu très délicatement, car l'antigénicité de certaines protéines, comme celle des récepteurs NMDA, diminue nettement en cas de fixation prolongée et intense. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de détecter et d'analyser avec une grande précision les protéines membranaires au niveau des synapses en ruban de la rétine.

high-resolution-quantitative-immunogold-analysis-membrane-receptors

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Dans cette vidéo, nous démontrons comment étiqueter et de visualiser seule exocytose des vésicules synaptiques et la traite des cellules rétiniennes bipolaires poissons rouges en utilisant la fluorescence totale internes réflectance (FRBR) microscopie.

L&#39;exocytose imagerie dans les cellules bipolaires rétine par microscopie TIRF

Ce protocole de détails comment quantifier le numéro de synapses neuronales dans la culture à la fois dissociées et dans les sections du cerveau en utilisant l'immunocytochimie. En utilisant des anticorps spécifiques du compartiment, nous appelons les terminaux présynaptiques ainsi que des sites de spécialisation post-synaptiques. Nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux générés par ces marqueurs.

Synapses Quantifier: un dosage à base d&#39;immunocytochimie Quantifier Nombre Synapse

Source : Schönherr, S., et. al. Immunomarquage combiné de l’optogénétique et de la réplique de congélation-fracture pour examiner l’arrangement spécifique à l’entrée des récepteurs du glutamate dans l’amygdale de la souris. J. vis. exp. (2016)Cette vidéo démontre l’immunomarquage de répliques de tissu cérébral de souris fracturées par congélation pour la microscopie électronique. Les répliques fracturées et enrobées sont digérées pour exposer les récepteurs. Des anticorps primaires et...

Immunomarquage de protéines membranaires neuronales dans un échantillon de tissu cérébral de souris fracturé par congélation

Source : Zhang, J., et al. Analyse quantitative immunogold à haute résolution des récepteurs membranaires au niveau des synapses du ruban rétinien. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une technique de microscopie électronique pour visualiser la localisation des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses rétiniennes. Les coupes rétiniennes contiennent des cellules ganglionnaires rétiniennes qui présentent des récepteurs de neurotransmetteurs liés à la membrane et sont marquées avec...

Imagerie à haute résolution des récepteurs de neurotransmetteurs au niveau des synapses rétiniennes

Le protocole décrit ici concerne l’évaluation structurelle d’une préparation rétinienne entière. Cela comprend des descriptions de dissection tissulaire, de montage sur un insert de membrane en polytétrafluoroéthylène (PTFE) hydrophilisé, de chargement en bolus avec des marqueurs fluorescents et une comparaison de la fixation avec du carbodiimide et du paraformaldéhyde pour l’analyse immunohistochimique des composants cellulaires et synaptiques.

Protocole optimisé pour la rétine Wholemount Préparation pour l&#39;imagerie et immunohistochimie

protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

Immunohistochimie et calcium méthodes d&#39;imagerie dans Wholemount Rat Retina

Cet article illustre comment l’expression des récepteurs des neurotransmetteurs peut être quantifiée et le modèle analysé au niveau des synapses avec des éléments pré et postsynaptiques identifiés en utilisant une combinaison de transduction virale d’outils optogénétiques et la technique d’immunomarquage de la réplique de congélation-fracture.

Combiné optogénétiques et Cryo-fracture Replica immunomarquage examiner l&#39;aménagement spécifique à l&#39;entrée de Glutamate Receptors dans l&#39;amygdale Souris

Ici, nous présentons un protocole pour adapter la méthode CLARITY des tissus cérébraux pour les rétines de montage entier afin d’améliorer la qualité de la coloration immunohistochimique standard et de l’imagerie à haute résolution des neurones rétinins et de leurs structures subcellulaires.

Immunomarquage de rétines à monture entière avec la méthode de nettoyage tissulaire CLARITY

Ce protocole décrit en détail les étapes de la pré-intégration de l’immunomicroscopie électronique, en mettant l’accent sur l’exploration des circuits synaptiques et la localisation des protéines dans la rétine.

Étude des circuits rétiniens et de la localisation moléculaire par immunomicroscopie électronique pré-intégrée

Ce protocole fournit une procédure de préparation optimisée et élaborée pour les échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission. Il convient aux applications qui impliquent l’analyse des synapses dans les organoïdes rétiniens matures.

Préparation d’échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus &lt; 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les...

En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

Apprenez l'immunomarquage immunogold post-embedding pour analyser quantitativement les récepteurs membranaires au niveau des synapses ruban rétiniennes. Cette méthode haute résolution permet d'étudier la localisation précise des protéines synaptiques.

Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

Explorer plus de vidéos