Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

L’objectif global de cette expérience est de développer une nouvelle approche pour analyser quantitativement les protéines membranaires au niveau des synapses du ruban rétinien. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie rétinienne, telles que la localisation précise des protéines au niveau des synapses dans le circuit. Le principal avantage de la technique est qu’elle permet d’estimer le nombre, la densité et la rapidité de plusieurs protéines au niveau des synapses du ruban rétinien.

Pour démontrer la procédure de substitution par congélation et la coupe ultra-mince, nous avons les docteurs Ron Petralia et Ya-Xian Wang du NIDCD Advanced Imaging Core. Pour commencer cette procédure, disséquez un globe oculaire au microscope. Pour ce faire, retirez d’abord la cornée.

Retirez ensuite le cristallin et le vitré de la surface inter-rétinienne à l’aide d’une pince. Ensuite, pelez la sclérotique jusqu’à ce que la rétine soit isolée de l’œilleton. Coupez immédiatement la rétine en bandes de 100 à 200 micromètres d’épaisseur avec un rasoir.

Par la suite, mélangez les bandelettes rétiniennes dans 4 % de paraformaldéhyde dans 0,1 molaire de PB. Ensuite, dans 4 % de paraformaldéhyde plus 0,01 % de glutaraldéhyde à température ambiante. Après plusieurs lavages au PB, avec 0,15 millimolaire de chlorure de calcium, cryoprotéger les bandelettes rétiniennes avec du glycérol dans 0,1 molaire de PB, avant la congélation-substitution. Avant de placer le tissu congelé dans les supports d’enrobage plats, découpez un cercle mince dans une feuille de plastique transparent et placez-le au fond de chaque support pour permettre un retrait plus facile de la boîte d’échantillons polymérisés une fois terminé.

Maintenant, réglez la séquence automatique dans l’AFS. Remplissez l’AFS d’azote liquide et placez les supports d’enrobage plats dans l’AFS. Remplissez-les d’acétate d’uranyle à 1,5 % dans du méthanol et pré-refroidissez-les.

Pour congeler les bandes rétiniennes dans du propane liquide à 184 degrés Celsius, à l’aide d’un pinceau fin, placez les échantillons sur de petits morceaux de ruban adhésif double fixés aux bouts de métal à l’extrémité des tiges plongeantes. Après cela, évacuez le tampon supplémentaire à l’aide de la brosse. Plongez les tiges dans le propane liquide pendant environ cinq secondes.

Ensuite, transférez-les dans l’AFS à l’aide d’une petite chambre de transport remplie d’azote liquide. Après avoir placé l’échantillon et les instruments congelés, pinces et scalpel, dans l’AFS, refroidissez les instruments dans la chambre pendant plusieurs minutes avant de toucher le tissu. Ou bien refroidissez-les en plaçant les pointes des instruments pendant quelques secondes dans la petite chambre de transport remplie d’azote liquide.

Après cela, retirez l’échantillon et le ruban adhésif du talon à l’aide d’un scalpel fin. Ensuite, placez deux morceaux de sections congelées dans chacun des sept puits du support en aluminium à enrobage plat avec 1,5 % d’acétate d’uranyle dans du méthanol. Gardez-les à 90 degrés Celsius pendant au moins 32 heures dans l’AFS.

Ensuite, augmentez progressivement la température jusqu’à 45 degrés Celsius dans la séquence automatique. Après cela, lavez les échantillons trois fois dans du méthanol pré-refroidi. Ensuite, infiltrez progressivement les échantillons avec des résines d’enrobage à basse température comme milieu d’enrobage.

Le lendemain, changez à nouveau la résine et ajustez le niveau de résine pour atteindre le bord supérieur des puits. Installez la lumière UV sur l’AFS et polymérisez les échantillons avec de la lumière UV dans l’AFS jusqu’à la fin de la séquence automatique. Ensuite, retirez les échantillons de l’AFS.

En règle générale, les blocs d’échantillons présentent encore un peu de rose et de couleur. Placez les échantillons près de la lumière fluorescente dans la hotte chimique à température ambiante pendant la nuit, ou jusqu’à ce qu’ils apparaissent complètement clairs. Dans cette étape, coupez des sections ultra-minces de 70 nonomètres d’épaisseur avec un ultramicrotome, et collectez-les sur les grilles de nickel recouvertes de carbone formvar.

Lavez les grilles à l’eau distillée une fois, puis trois lavages de TBS. Ensuite, incubez les grilles dans 20 microlitres de BSA à 5 % dans du TBS pendant 30 minutes, puis dans 20 microlitres d’un mélange contenant de l’anti-CTB de chèvre et un anticorps contre une sous-unité NMDAR pendant la nuit à température ambiante. Après cela, lavez les grilles trois fois avec 20 microlitres de TBS à chaque fois à pH 7,6.

Par la suite, lavez les grilles une fois avec du TBS à pH 8,2 pendant cinq minutes. Incuber les grilles pendant deux heures avec 20 microlitres d’un mélange contenant de l’IGG anti-lapin d’âne couplé à des particules d’or de 10 nanomètres, et de l’IGG anti-chèvre d’âne couplé à des particules d’or de 18 nanomètres. Après deux heures, lavez les grilles dans 20 microlitres de TBS, à pH 7,6 trois fois, puis faites sécher les grilles à l’air libre.

Ensuite, contre-colorez les grilles avec de l’acétate d’uranyle à 5 % dans de l’eau distillée pendant huit minutes, puis du citrate de plomb à 0,3 % dans de l’eau distillée pendant cinq minutes dans l’obscurité. Pour des expériences de triple marquage, incubez les grilles pendant la nuit à température ambiante avec 20 microlitres d’un mélange de CTB anti-chèvre, de PSD-95 anti-souris et d’UN2A anti-lapin. Ensuite, incubez les grilles pendant deux heures avec 20 microlitres d’un mélange d’IGG couplé à des particules d’or de 18, 10 et cinq nanomètres.

Dans cette section, réglez d’abord la barre d’échelle. Mesurez ensuite la longueur de la PSD de dendrites RGC individuelles avec le logiciel ImageJ. Ensuite, comptez les particules d’or à moins de 10 nanomètres de la membrane sur la base d’une épaisseur moyenne de sept à neuf nanomètres pour la membrane plasmique.

Calculez la densité des particules en nombre de particules d’or par micromètre linéaire. Ensuite, mesurez la distance entre le centre de chaque particule d’or et le milieu de la PSD pour la localisation synaptique, ou le bord de la PSD, pour la localisation extra-synaptique. Cette image montre le double marquage immuno-or de GluA2/3 et CTB.

Il s’agit du ruban pré-synaptique et les petites particules d’or sont regroupées dans la PSD des processus RGC. Cette image montre le double marquage immuno-or de GluN2B et CTB. Les petites particules d’or se trouvent sur la membrane plasmique extra-synaptique.

Et cette image montre le double marquage immuno-or de GluN2A et CTB. Comme pour GluA2/3, les petites particules sont regroupées dans le PSD. Le triple marquage immuno-or de GluN2A, PSD-95 et CTB est présenté ici.

Les particules d’or GluN2A et les particules d’or PSD-95 sont co-localisées dans la PSD sur des dendrites RGC CTB-positives individuelles. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de fixer le tissu très doucement, car certaines antigénicités protéiques, telles que celles des récepteurs NMDA, diminuent nettement avec une forte fixation prolongée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter et d’analyser les protéines membranaires avec une grande précision au niveau des synapses du ruban rétinien.