Préparation et essai d'impédance basée sur biopuces fluidiques avec des cellules RTgill-W1 pour l'évaluation rapide des échantillons d'eau potable pour la toxicité

L’objectif général de cette procédure est de démontrer comment utiliser un biocapteur pour évaluer la toxicité d’échantillons d’eau potable. Ceci est accompli en créant des biopuces qui contiennent une monocouche de cellules branchiales de truite arc-en-ciel, puis en les utilisant dans le cadre d’un biocapteur basé sur l’impédance. Cette procédure permet de détecter rapidement la toxicité chimique dans les approvisionnements en eau potable à des niveaux pertinents pour la santé humaine.

Les principaux avantages de cette technique sont que les biopuces peuvent être utilisées dans des conditions de terrain, qu’elles peuvent être stockées au froid jusqu’à neuf mois sans aucun soin ni entretien des cellules, et qu’elles sont prêtes à être testées et peuvent être utilisées à tout moment après leur sortie du réfrigérateur. Jordan McNairn, un étudiant de premier cycle de notre laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. La veille de l’ensemencement cellulaire, retirez les biopuces de leur emballage et placez-les dans des boîtiers d’instruments en plastique stérilisés.

Fixez l’un des ensembles de tubes à la seringue et aspirez une solution d’eau de Javel à 20 % dans une seringue de 20 millilitres. Injectez deux millilitres de solution dans chaque canal de la biopuce. Une fois terminé, laissez les biopuces reposer pendant une heure avec la solution d’eau de Javel.

Après une heure, utilisez une seringue stérile d’un millilitre équipée d’un ensemble Luer à glissement mâle fixé à une conduite de vide pour aspirer la solution d’eau de Javel des deux canaux. Après avoir aspiré l’eau de Javel de la biopuce, fixez un ensemble de tubes stériles avec des luers coulissants mâles à chaque extrémité à la biopuce pour l’utiliser comme drain pendant le rinçage des biopuces. Ensuite, aspirez de l’eau stérile dans une seringue de 20 millilitres et rincez chaque canal de la puce avec cinq millilitres d’eau.

Aspirez l’eau sous vide comme précédemment. Et remettez les biopuces dans les boîtiers d’instruments en plastique. Laissez les biopuces dans le capot de biosécurité jusqu’au lendemain.

Une heure avant l’ensemencement des biopuces, injectez deux millilitres d’une solution de fibronectine de 10 microgrammes par millilitre dans chaque canal de la biopuce. Incuber les biopuces dans la hotte de biosécurité pendant 60 minutes, puis aspirer sous vide la solution de fibronectine. Enfin, placez deux ensembles de tubes de biopuces stériles sur les ports des biopuces et mettez les biopuces de côté jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour l’ensemencement.

Retirez de l’incubateur une fiole confluente T-175 contenant des cellules épithéliales branchiales de truite arc-en-ciel et placez-la dans le capot de biosécurité. Une fiole Confluent T-175 pourra ensemencer environ 16 biopuces. Aspirez les fluides des cellules.

Rincez-les avec du PBS et aspirez le PBS. Ensuite, ajoutez six millilitres de solution de trypsine-EDTA à la couche cellulaire. Incuber le ballon à température ambiante pendant environ cinq minutes.

Ensuite, ajoutez 15 millilitres de milieu de culture cellulaire L-15 complet dans chaque flacon, pour désactiver la trypsine. Prélever une petite aliquote de la suspension cellulaire et utiliser un hémocytomètre pour mesurer la concentration des cellules. Visualisez les cellules à l’aide d’un microscope à champ clair équipé d’un objectif 10x.

Ensuite, calculez la concentration actuelle des cellules et ajustez la suspension cellulaire à une concentration d’un quart de million de cellules par millilitre. Ensuite, utilisez une seringue stérile de 20 millilitres pour injecter 2,5 millilitres de suspension cellulaire dans l’orifice extérieur de chaque canal de la biopuce. Laissez la suspension cellulaire supplémentaire s’écouler du tube dans un conteneur à déchets.

Créez ensuite une boucle fermée pour chaque canal de biopuce en insérant l’extrémité libre du tuyau avec un raccord Luer dans l’orifice extérieur de chaque canal. Ensuite, humidifiez une serviette en papier avec de l’éthanol à 70 % et utilisez-la pour essuyer tout excès de support sur les boucles fermées. Ensuite, remettez les biopuces dans une boîte en plastique.

Les quatrième et septième jours, retirez les biopuces de l’incubateur. Et changez le milieu dans les biopuces avec un milieu de culture cellulaire L-15 complet à température équilibrée. Après le septième jour d’alimentation, retirez et jetez les tuyaux des copeaux et insérez les bouchons de vidange de l’autoclave dans les biopuces.

Placez les biopuces dans une boîte dans un incubateur à six degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour les tests. Retirez le lecteur de test ECIS et les consommables de la mallette de transport, puis allumez le lecteur. Sortez également l’une des biopuces préparées de l’incubateur à six degrés Celsius et placez-la sur une serviette en papier.

À l’aide d’une seringue de 10 millilitres, versez 10 millilitres d’eau de contrôle dans un bocal de contrôle en plastique transparent étiqueté de 0,5 once. Assurez-vous d’éliminer les bulles pour une mesure précise. Ensuite, utilisez une seringue séparée et distribuez 10 millilitres de l’échantillon de test dans un bocal de test en plastique transparent de 0,5 once.

Ensuite, retirez deux flacons de milieu en poudre. Ouvrez l’un des flacons de milieu en poudre et versez tout le contenu d’un flacon dans le bocal avec l’eau de contrôle, en laissant tomber tout le flacon dans la solution également. Répétez cette procédure avec le bocal de test.

Ensuite, bouchez et secouez les bocaux pour vous assurer que la poudre est complètement dissoute. Remplissez la seringue bleue de 10 millilitres avec neuf millilitres de la solution de contrôle. Et la seringue rouge de 10 millilitres avec neuf millilitres de la solution de test de leurs flacons respectifs.

Retirez toutes les bulles d’air existantes des seringues. Ensuite, retirez les bouchons des ports de la biopuce et fixez le drain. Placez la biopuce dans le plateau en plastique amovible du lecteur ECIS, fermez le couvercle, puis fixez les seringues remplies aux ports extérieurs de la biopuce.

Enfin, fixez les pistons de la seringue. À partir de l’écran principal du lecteur, sélectionnez Suivant pour lancer le pré-test. Le logiciel vérifiera ensuite les impédances initiales.

Si les impédances sont à portée de main, l’écran enregistrera Cartouche passée et indiquera à l’utilisateur de sélectionner Suivant. Entrez ensuite des exemples d’informations à l’aide d’un clavier logiciel, puis sélectionnez Accepter lorsque vous avez terminé. À ce stade, deux minutes de données d’impédance seront collectées à partir de la biopuce insérée, et une minuterie à l’écran comptera le temps d’arrêt.

Au bout de deux minutes, appuyez sur Suivant. Lorsqu’une boîte verte clignotante vous demande d’injecter des échantillons maintenant, injectez simultanément le milieu de contrôle et le milieu de test des seringues attachées dans les canaux de la biopuce. Laissez les seringues en place sur les biopuces lorsque vous avez terminé.

Si le logiciel de lecture ECIS détermine que le canal de traitement est statistiquement différent du canal de contrôle à n’importe quel moment de l’essai, l’affichage à l’écran indiquera que l’échantillon est contaminé. Dans le cas contraire, il indiquera qu’aucune contamination n’est détectée à la fin de la période de surveillance. Inscrivez les résultats d’analyse comme étant « contaminés » ou « non contaminés » pour chaque échantillon.

À la fin de la série d’essais, retirez et jetez la biopuce. Rincez et faites sécher à l’air libre les seringues, les flacons de test et le plateau en plastique amovible qui abritait la biopuce pendant les tests. 13 produits chimiques, présentés ici, ont été sélectionnés pour être testés en tant que représentants d’un large éventail de composés industriels toxiques qui pourraient être des contaminants possibles de l’eau potable.

Au cours des essais, neuf des 13 ont été détectés par détection d’impédance du substrat de la cellule électrique en l’heure, à des concentrations pertinentes pour la santé humaine. Les sorties typiques qui seraient observées après un test de détection d’impédance de substrat de cellule électrique sont présentées ici. Les échantillons contaminés finissent par avoir des niveaux d’impédance nettement inférieurs, par rapport aux échantillons d’eau propre de contrôle.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer une biopuce avec une monocouche de cellules épithéliales branchiales de truite arc-en-ciel et d’utiliser ensuite cette biopuce dans un essai de toxicité basé sur l’impédance pour l’évaluation de la toxicité de l’eau potable. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler de manière aseptique dans la préparation des biopuces, et également de conserver les biopuces au réfrigérateur jusqu’à ce qu’elles soient utilisées. Chaque biopuce ne peut être utilisée qu’une seule fois et doit ensuite être jetée.

Une fois maîtrisée, la préparation de la biopuce peut se faire en 10 minutes environ. Il s’agit d’une estimation, car les chips sont préparées par lots. Le test d’impédance d’échantillon, y compris la préparation de l’échantillon, prend environ une heure et 10 minutes s’il est effectué correctement.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la chimie analytique, peuvent être appliquées sur un échantillon qui a produit un résultat contaminé, afin d’identifier le ou les produits chimiques suspectés. Le développement de cette technique ouvre la voie aux chercheurs qui s’intéressent à la détection de la toxicité de l’eau pour utiliser la technologie utilisant la truite arc-en-ciel, les cellules épithéliales branchiales et la détection d’impédance. Nous espérons que vous trouverez les techniques utiles et nous attendons avec impatience les innovations futures que ces nouvelles capacités pourraient contribuer à faciliter.

Merci et bonne journée.