Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée

L'objectif général de ce protocole est d'examiner les cochlées de souris mutantes ciliées afin d'analyser les phénotypes de polarité cellulaire planaire. Ces techniques permettent une description détaillée du phénotype cochléaire, conduisant ainsi à une compréhension plus précise du rôle des cils dans l'établissement de la signalisation PCC (polarité cellulaire planaire) chez les vertébrés. Le principal avantage de ce protocole réside dans le fait que, une fois maîtrisé, l'épithélium cochléaire disséqué peut être utilisé pour divers types d'analyses phénotypiques.

Après avoir préparé les réactifs et les tissus provenant des animaux expérimentaux, au stade de développement E16,5 à p3, utilisez une lame de scalpel ou une petite paire de ciseaux pour disséquer la tête le long de la ligne médiane sagittale, en partant du nez et en allant jusqu'au condyle. Retirez le cerveau de chaque moitié du crâne à l’aide d’une pince. Ensuite, identifiez les os temporaux qui contiennent les labyrinthes osseux en développement de l’oreille interne.

Lors de la manipulation de l'échantillon au microscope stéréoscopique, utilisez une pince pour détacher délicatement les labyrinthes osseux du crâne en glissant la pince doucement sous les labyrinthes osseux. Après la dissection, utilisez la pointe de la pince de dissection pour dégager les fenêtres ovale et ronde et pratiquer un petit trou au sommet de la spirale cochléaire. Ensuite, fixez les labyrinthes osseux dans 1,5 millilitre de paraformaldéhyde à 4 % pendant cinq minutes sur de la glace afin de faciliter le retrait de la membrane tectoriale.

Maintenant, placez les labyrinthes osseux dans une boîte de dissection recouverte d’un élastomère de silicone noir contenant du PBS afin de faciliter la dissection. Utilisez une pince n°5 pour enlever le cartilage externe, exposant ainsi le canal cochléaire. Commencez par la fenêtre ovale, insérez l’extrémité inférieure de la pince dans la fenêtre ovale, puis soulevez délicatement le cartilage en remontant progressivement vers l’apex.

Ensuite, utilisez une pince fine pour pincer la membrane de Reissner à la base du canal cochléaire et retirez-la par un mouvement ascendant. Visualisez l'aspect dorsal du canal cochléaire, y compris l'épithélium sensoriel. Puis, utilisez une pince n°55 pour pincer la membrane tectoriale à la base de la cochlée, et décollez-la vers le haut en direction de l'apex.

La suppression complète de la membrane tectoriale est nécessaire pour obtenir les meilleures images en immunohistochimie et est essentielle pour la microscopie électronique à balayage. Après avoir exposé l'organe de Corti, fixez davantage le tissu et effectuez l'immunohistochimie, ou préparez-le pour la microscopie électronique à balayage, comme indiqué dans la partie écrite du protocole. Une fois le tissu coloré, placez l'échantillon dans une boîte en élastomère silicone noir contenant du PBS.

À l’aide de pinces fines, retirez la région vestibulaire de la spirale cochléaire. Ensuite, retirez très soigneusement le cartilage sous-jacent et le mésenchyme de la spirale cochléaire. La spirale cochléaire restante contient le sillon interne, l’organe de Corti et le sillon externe.

Transférez la spirale cochléaire dans une goutte de PBS placée sur une lame de microscope. Absorbez le PBS à l’aide d’un papier absorbant ou d’un morceau de papier filtre, puis repositionnez délicatement la spirale cochléaire si l’épithélium s’est déplacé et se chevauche. Ajoutez une goutte de milieu de montage directement sur l’échantillon de cochlée, puis placez doucement une lamelle sur l’échantillon, en prenant soin d’éviter les bulles d’air.

Utilisez un microscope épifluorescent ou un microscope confocal à balayage laser équipé d'objectifs à fort grossissement et à haute ouverture numérique pour capturer des images de la surface apicale des cellules ciliées cochléaires. Utilisez des objectifs de plus faible grossissement pour acquérir des images en chevauchement de la spirale cochléaire afin de quantifier la longueur du canal cochléaire. Les images suivantes montrent une coloration immunofluorescente d'une cochlée de type tournant basal, au jour postnatal un.

La phalloïdine marque l'actine filamenteuse dans les stéréocils et l'actine corticale au niveau de la périphérie cellulaire. La myosine VIIA est un marqueur des cellules ciliées internes et externes. ZO_1 marque les jonctions serrées situées entre les cellules, ce qui en fait un excellent marqueur pour distinguer les limites cellulaires.

La tubuline alpha acétylée est utilisée comme marqueur du kinocilié au sommet du faisceau, comme indiqué par la flèche blanche. Les microtubules internes sont également marqués par la tubuline alpha acétylée, particulièrement abondante dans les cellules pilier, comme indiqué par les astérisques blancs. Cette image de conduits cochléaires disséqués à E18,5, colorés avec la tubuline acétylée, montre un raccourcissement marqué des conduits cochléaires chez les souris knock-out conditionnel pour IFT20 par rapport aux témoins.

L'image suivante montre une préparation en montage entier du tour basal de la cochlée chez des souris knock-out pour BBS8, au jour postnatal zéro. Les faisceaux stéréociliaires des cochlées de souris knock-out BBS8 présentent une rotation variable, indiquée par la flèche de droite, ou sont aplatis et mal localisés, comme l'indique la flèche centrale. Les kinocils sont mal localisés ou leurs axonèmes sont absents, comme le montre la flèche de gauche.

Lors de la préparation du phénotype cochléaire pour l'analyse, il est important de garder à l'esprit que les différences de fond génétique peuvent modifier le phénotype cochléaire. Par conséquent, il est essentiel d'utiliser des témoins provenant de la même portée pour l'analyse. D'autres analyses comprennent les tests audiométriques et la culture d'explantats cochléaires, ce qui permet un traitement par divers activateurs ou inhibiteurs de signalisation, contribuant ainsi à une compréhension mécanistique des processus développementaux impliqués.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation du tissu cochléaire pour analyser le rôle des composants ciliaires et leurs effets spécifiques sur la signalisation du PCP.