Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée

L’objectif général de ce protocole est d’examiner la cochlée de souris mutante ciliaire pour les phénotypes de polarité cellulaire planaire. Ces techniques permettent d’obtenir un détail approfondi du phénotype cochléaire, ce qui conduira à une compréhension plus précise de l’implication ciliaire dans l’établissement de la signalisation PCP des vertébrés. Le principal avantage de ce protocole est qu’une fois maîtrisé, l’épithélium cochléaire disséqué peut être utilisé pour une variété de différents types d’analyses phénotypiques.

Après avoir préparé des réactifs et des tissus provenant d’animaux de laboratoire, aux stades de développement E16.5 à p3, utilisez une lame de scalpel ou une petite paire de ciseaux pour disséquer la tête le long de la ligne médiane sagittale en commençant par le nez et en étendant le cotyle. Retirez le cerveau de chaque moitié du crâne à l’aide d’une paire de pinces. Ensuite, identifiez les os temporaux qui contiennent les labyrinthes osseux en développement de l’oreille interne.

Tout en travaillant avec l’échantillon sous un microscope de dissection, utilisez une paire de pinces pour éloigner les labyrinthes osseux du crâne en passant doucement la pince sous les labyrinthes osseux. Après la dissection, utilisez la pointe de la pince à dissection pour dégager les fenêtres ovales et rondes et faites un petit trou dans l’apex de la spirale cochléaire. Ensuite, fixez les labyrinthes osseux dans 1,5 millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant cinq minutes sur de la glace pour permettre une élimination facile de la membrane tectorale.

Maintenant, placez les labyrinthes osseux dans un plat de dissection recouvert d’élastomère de silicone noir contenant du PBS pour faciliter la dissection. Utilisez la pince numéro cinq pour retirer le cartilage externe, exposant le canal cochléaire. Commencez par la fenêtre ovale, insérez l’extrémité inférieure de la pince dans la fenêtre ovale et ouvrez doucement le cartilage, en remontant lentement vers l’apex.

Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces fines, pincez la membrane de Reissner à la base du canal cochléaire et décollez-la dans un mouvement ascendant. Visualisez la face dorsale du canal cochléaire, y compris l’épithélium sensoriel. Ensuite, à l’aide de la pince numéro 55, pincez la membrane tectoriale à la base de la cochlée et décollez vers le haut vers l’apex.

L’ablation complète de la membrane tectoriale est nécessaire pour obtenir les meilleures images avec l’immunohistochimie, et est essentielle pour la microscopie électronique à balayage. Après avoir exposé l’organe de Corti, fixez davantage le tissu et effectuez une immunohistochimie, ou préparez-vous pour la microscopie électronique à balayage, comme détaillé dans la partie écrite du protocole. Une fois le tissu coloré, placez l’échantillon dans une boîte en élastomère de silicone noir, contenant du PBS.

À l’aide d’une pince fine, retirez la région vestibulaire de la spirale cochléaire. Ensuite, retirez très soigneusement le cartilage et le mésenchyme sous-jacents de la spirale cochléaire. La spirale cochléaire restante contient le sillon interne, l’organe de Corti et le sillon externe.

Transférez la spirale cochléaire dans une goutte de PBS placée sur une lame de microscope. Évacuez le PBS avec un mouchoir absorbant ou un morceau de papier filtre, et repositionnez doucement la spirale cochléaire si l’épithélium s’est déplacé et se chevauche sur lui-même. Ajoutez une goutte de support de montage directement sur l’échantillon de cochlée et placez délicatement une lamelle directement sur l’échantillon, en prenant soin d’éviter les bulles d’air.

Utilisez un microscope confocal à balayage épifluorescent ou laser équipé d’objectifs à fort grossissement et à grande ouverture numérique pour capturer des images de la surface apicale de la cellule ciliée cochléaire. Utilisez des objectifs inférieurs pour prendre des images superposées de la spirale cochléaire afin de quantifier la longueur du canal cochléaire. Les images suivantes montrent une coloration immunofluorescente de la cochlée postnatale de type tour basal, post-natal

La phalloïdine marque l’actine filamenteuse dans les stéréocils et l’actine corticale à la périphérie cellulaire. La myosine VIIA est un marqueur des cellules ciliées internes et externes. ZO_1 marque les jonctions serrées entre les cellules, ce qui en fait un excellent marqueur pour distinguer les limites cellulaires.

L’alpha-tubuline acétylée est utilisée comme marqueur du kinocilium au sommet du faisceau, comme indiqué par la flèche blanche. Les microtubules internes sont également marqués par de l’alpha-tubuline acétylée, qui est particulièrement abondante dans les cellules pilier, comme l’indiquent les astérisques blancs. Cette image de canaux cochléaires disséqués à E18.5, colorés à la tubuline acétylée, montre un raccourcissement marqué des canaux cochléaires knock-out conditionnels IFT20 par rapport au contrôle.

L’image suivante est une préparation complète du tour cochléaire basal, chez une souris knock-out BBS8, au jour zéro postnatal. Les faisceaux stéréociliaires des cochlées knock-out BBS8 sont orientés de manière variable, comme l’indique la flèche droite, ou aplatis et mal localisés, comme l’indique la flèche du milieu. Les kinocilia sont mal localisés, ou les axonèmes sont manquants, comme l’indique la flèche gauche.

Lors de la préparation du phénotype cochléaire pour l’analyse, il est important de se rappeler que les différences de fond génétique peuvent modifier le phénotype cochléaire. Par conséquent, il est important d’utiliser des témoins de litière pour l’analyse. D’autres analyses comprennent des tests audiométriques et la culture d’explants cochléaires, ce qui permet un traitement avec divers activateurs ou inhibiteurs de signalisation, contribuant ainsi à la compréhension mécaniste des processus de développement impliqués.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer le tissu cochléaire pour analyser le rôle des composants ciliaires et leurs effets distincts sur la signalisation PCP.