Name: Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Découvrez l'analyse phénotypique de la cochlée de souris mutante ciliaire pour étudier la polarité cellulaire planaire. Cette méthode combine immunohistochimie et microscopie électronique à balayage pour comprendre le rôle des cils dans le développement de l'oreille interne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L&#39;auteur tient à remercier Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer et Zoe Mann et pour leur évaluation critique du manuscrit. Ce travail a été financé par le Prix Sofja Kovalevskaya (Fondation Humbodlt) et de l&#39;Université Johannes-Gutenberg, Mainz, Allemagne.

<ol><li>Waters, A. M., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliopathies%3A+an+expanding+disease+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Ciliopathies: an expanding disease spectrum.</a> Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).</li>
<li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%2C+Wnt+signaling%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1, 7(2012).</li>
<li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genet. 37, 1135-1140 (2005).</li>
<li>Ezan, J., Montcouquiol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+planar+cell+polarity+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting planar cell polarity in the inner ear.</a> Seminars in cell & developmental biology. 24, 499-506 (2013).</li>
<li>Semenov, M. V., Habas, R., Macdonald, B. T., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Noncanonical+Wnt+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Noncanonical Wnt Signaling Pathways.</a> Cell. 131, 1378(2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37, 980-985 (2005).</li>
<li>Montcouquiol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Vangl2+and+Scrb1+as+planar+polarity+genes+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Vangl2 and Scrb1 as planar polarity genes in mammals.</a> Nature. 423, 173-177 (2003).</li>
<li>May-Simera, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+Bbs8+and+Ift20+promote+planar+cell+polarity+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins Bbs8 and Ift20 promote planar cell polarity in the cochlea.</a> Development. 142, 555-566 (2015).</li>
<li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nat Genet. 40, 69-77 (2008).</li>
<li>Lim, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+of+the+organ+of+Corti%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Functional structure of the organ of Corti: a review.</a> Hearing research. 22, 117-146 (1986).</li>
<li>Nayak, G. D., Ratnayaka, H. S., Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+hair+bundle+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of the hair bundle and mechanotransduction.</a> The International journal of developmental biology. 51, 597-608 (2007).</li>
<li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+deveoping+vestibular+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the deveoping vestibular system of the mouse.</a> J. Neurocytol. , 821-835 (1999).</li>
<li>Sobkowicz, H. M., Slapnick, S. M., August, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinocilium+of+auditory+hair+cells+and+evidence+for+its+morphogenetic+role+during+the+regeneration+of+stereocilia+and+cuticular+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">The kinocilium of auditory hair cells and evidence for its morphogenetic role during the regeneration of stereocilia and cuticular plates.</a> Journal of neurocytology. 24, 633-653 (1995).</li>
<li>Denman-Johnson, K., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+hair+bundle+polarity+and+orientation+in+the+developing+vestibular+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Establishment of hair bundle polarity and orientation in the developing vestibular system of the mouse.</a> Journal of neurocytology. 28, 821-835 (1999).</li>
<li>van Dam, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SYSCILIA+gold+standard+%28SCGSv1%29+of+known+ciliary+components+and+its+applications+within+a+systems+biology+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">The SYSCILIA gold standard (SCGSv1) of known ciliary components and its applications within a systems biology consortium.</a> Cilia. 2, 7(2013).</li>
<li>Blacque, O. E., Sanders, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+within+a+compartment%3A+what+C.+elegans+can+tell+us+about+ciliary+subdomain+composition%2C+biogenesis%2C+function%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Compartments within a compartment: what C. elegans can tell us about ciliary subdomain composition, biogenesis, function, and disease.</a> Organogenesis. 10, 126-137 (2014).</li>
<li>Wallingford, J. B., Mitchell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strange+as+it+may+seem%3A+the+many+links+between+Wnt+signaling%2C+planar+cell+polarity%2C+and+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Strange as it may seem: the many links between Wnt signaling, planar cell polarity, and cilia.</a> Genes & development. 25, 201-213 (2011).</li>
<li>Borovina, A., Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFT88+plays+a+cilia-+and+PCP-independent+role+in+controlling+oriented+cell+divisions+during+vertebrate+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">IFT88 plays a cilia- and PCP-independent role in controlling oriented cell divisions during vertebrate embryonic development.</a> Cell reports. 5, 37-43 (2013).</li>
<li>Huang, P., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dampened+Hedgehog+signaling+but+normal+Wnt+signaling+in+zebrafish+without+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dampened Hedgehog signaling but normal Wnt signaling in zebrafish without cilia.</a> Development. 136, 3089-3098 (2009).</li>
<li>Ocbina, P. J., Tuson, M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+not+required+for+normal+canonical+Wnt+signaling+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are not required for normal canonical Wnt signaling in the mouse embryo.</a> PloS one. 4, e6839(2009).</li>
<li>Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy%3A+preparation+and+imaging+for+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy: preparation and imaging for SEM.</a> Methods Mol Biol. 915, 1-20 (2012).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Celsr1+disrupts+planar+polarity+of+inner+ear+hair+cells+and+causes+severe+neural+tube+defects+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mutation of Celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse.</a> Current biology : CB. 13, 1129-1133 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Guo, N., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Frizzled3+and+Frizzled6+in+neural+tube+closure+and+in+the+planar+polarity+of+inner-ear+sensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of Frizzled3 and Frizzled6 in neural tube closure and in the planar polarity of inner-ear sensory hair cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 2147-2156 (2006).</li>
<li>Montcouquiol, M., Jones, J. M., Sans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+planar+polarity+proteins+in+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of planar polarity proteins in mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 468, 207-219 (2008).</li>
<li>May-Simera, H., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+planar+cell+polarity+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Examining planar cell polarity in the mammalian cochlea.</a> Methods Mol Biol. 839, 157-171 (2012).</li>
<li>Yin, H., Copley, C. O., Goodrich, L. V., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+phenotypes+between+different+vangl2+mutants+demonstrates+dominant+effects+of+the+Looptail+mutation+during+hair+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparison of phenotypes between different vangl2 mutants demonstrates dominant effects of the Looptail mutation during hair cell development.</a> PloS one. 7, e31988(2012).</li>
<li>Rachel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Cep290+and+Mkks+ciliopathy+alleles+in+mice+rescues+sensory+defects+and+restores+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Combining Cep290 and Mkks ciliopathy alleles in mice rescues sensory defects and restores ciliogenesis.</a> J Clin Invest. 122, 1233-1245 (2012).</li>
<li>Jagger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alstrom+Syndrome+protein+ALMS1+localizes+to+basal+bodies+of+cochlear+hair+cells+and+regulates+cilium-dependent+planar+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Alstrom Syndrome protein ALMS1 localizes to basal bodies of cochlear hair cells and regulates cilium-dependent planar cell polarity.</a> Human molecular genetics. 20, 466-481 (2011).</li>
<li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alstrom+Syndrome+Protein%2C+ALMS1%2C+Interacts+with+alpha-Actinin+and+Components+of+the+Endosome+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The Alstrom Syndrome Protein, ALMS1, Interacts with alpha-Actinin and Components of the Endosome Recycling Pathway.</a> PloS one. 7, e37925(2012).</li>
<li>Copley, C. O., Duncan, J. S., Liu, C., Cheng, H., Deans, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+refinement+of+auditory+hair+cell+planar+polarity+deficits+occurs+in+the+absence+of+Vangl2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postnatal refinement of auditory hair cell planar polarity deficits occurs in the absence of Vangl2.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 14001-14016 (2013).</li>
<li>Sorusch, N., Wunderlich, K., Bauss, K., Nagel-Wolfrum, K., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usher+syndrome+protein+network+functions+in+the+retina+and+their+relation+to+other+retinal+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Usher syndrome protein network functions in the retina and their relation to other retinal ciliopathies.</a> Advances in experimental medicine and biology. 801, 527-533 (2014).</li>
<li>Hebert, J. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+cre+to+the+Foxg1+%28BF-1%29+locus+mediates+loxP+recombination+in+the+telencephalon+and+other+developing+head+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of cre to the Foxg1 (BF-1) locus mediates loxP recombination in the telencephalon and other developing head structures.</a> Dev Biol. 222, 296-306 (2000).</li>
<li>Willott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8%2C+Measurement+of+the+auditory+brainstem+response+%28ABR%29+to+study+auditory+sensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chapter 8, Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21B(2006).</li>
<li>Martin, G. K., Stagner, B. B., Lonsbury-Martin, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8%2C+Assessment+of+cochlear+function+in+mice%3A+distortion-product+otoacoustic+emissions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chapter 8, Assessment of cochlear function in mice: distortion-product otoacoustic emissions.</a> Current protocols in neuroscience. , Unit8 21C(2006).</li>
<li>Finetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+is+required+for+polarized+recycling+of+the+TCR%2FCD3+complex+to+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport is required for polarized recycling of the TCR/CD3 complex to the immune synapse.</a> Nature cell biology. 11, 1332-1339 (2009).</li>
<li>Sedmak, T., Wolfrum, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+molecules+in+ciliary+and+nonciliary+cells+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport molecules in ciliary and nonciliary cells of the retina.</a> J Cell Biol. 189, 171-186 (2010).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+horizons%3A+ciliary+proteins+reach+beyond+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">Expanding horizons: ciliary proteins reach beyond cilia.</a> Annual review of genetics. 47, 353-376 (2013).</li>
<li>Tarchini, B., Jolicoeur, C., Cayouette, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+blueprint+at+the+apical+surface+establishes+planar+asymmetry+in+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">A molecular blueprint at the apical surface establishes planar asymmetry in cochlear hair cells.</a> Developmental cell. 27, 88-102 (2013).</li>
<li>Ezan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilium+migration+depends+on+G-protein+signalling+control+of+subapical+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Primary cilium migration depends on G-protein signalling control of subapical cytoskeleton.</a> Nature cell biology. 15, 1107-1115 (2013).</li>
</ol>

L’auteur ne déclare aucun intérêt financier concurrent.

Lors de la préparation des tissus cochléaire pour l&#39;analyse, il y a quelques points clés à garder à l&#39;esprit. Tout d&#39;abord, les différences de fond génétique peuvent modifier le phénotype cochléaire, ce qui rend nécessaire d&#39;analyser et de comparer les seuls contrôles même portée. Deuxièmement, l&#39;élimination complète de la membrane de Corti est nécessaire pour obtenir les meilleures images avec immunohistochimie et est essentielle pour SEM. La membrane de Corti est une structure opaque et peut obscur...

cils primaires sont des appendices en fonction de microtubules longues qui se prolongent à partir de la surface de la plupart des cellules de mammifères. cils primaires sont souvent confondus avec des cils mobiles, dont il existe toujours multiples par cellule, et dont le but est de déplacer le fluide à travers les surfaces de la membrane. cils primaires, en revanche, adopter des rôles sensoriels et sont par conséquent également désignée comme les cils sensorielle. Une fois oublié depuis longtemps, cet organite a récemment été &quot;redécouvert&quot; en raison de son association avec une multitude de maladies génétiques humaines 1. Idéalement positionné comme un organite de signalisation, le cil primaire a été montré pour réguler de nombreuses voies de signalisation, dont beaucoup sont importantes non seulement dans l&#39;homéostasie tissulaire et les maladies, mais également au cours du développement 2. L&#39;une des premières voies de signalisation est prouvé qu&#39;ils sont associés à un dysfonctionnement des cils est la voie de signalisation Wnt non canonique, connu également que la polarité cellulaire planaire (PCP) voie <sup<html> &gt; 3. Cette cascade de signalisation initialement identifié chez la drosophile, est essentiel pour l&#39;embryogenèse; en particulier pour les processus de convergence et d&#39;extension et pour l&#39;orientation correcte de cellules dans le plan de l&#39;épithélium 4. La signalisation séquentielle d&#39;un ensemble de base de protéines régulatrices traduit indications directionnelles qui conduisent finalement à des réarrangements du cytosquelette et se traduisent par la polarisation coordonnée des cellules épithéliales dans un plan 5. Le processus de convergence et l&#39;extension est absolument nécessaire pour le canal cochléaire pour allonger et de structuration cellulaire correcte 6. Comme il est régulée par activation de la voie de PCP, l&#39;un des phénotypes les plus frappants de mutants PCP cochlée est un canal cochléaire raccourci avec l&#39;épithélium sensoriel désorganisé 7. De même, les mutants de souris, qui manquent de cils, présentent également une telle convergence et l&#39;extension phénotype 8,9, mais précisément comment cela est réglementé reste à élucider. ve_content &quot;&gt; Parce que les processus de convergence et de vulgarisation sont essentiels pour l&#39;excroissance du canal cochléaire, et la structuration cellulaire de l&#39;épithélium sensoriel dans le canal cochléaire, le développement de la cochlée est un organe idéal pour examiner la signalisation PCP au cours du développement des vertébrés. L&#39;organe de Corti, le terme donné à l&#39;épithélium sensoriel spécialisé qui tapisse le canal cochléaire, est composé de cellules de soutien non-sensorielles et les cellules ciliées mécano qui doivent être uniformément orientés pour la cochlée pour fonctionner 10. les cellules ciliées mécano sont appelés ainsi en raison de la faisceaux stéréocils qui se prolongent à partir de la plaque cuticulaire (de surface apicale) de chaque cellule sensorielle de cheveux 11. Ceux-ci agissent comme des transducteurs primaires de mécanosensibilité et en dépit de leur nomenclature comme stereocilia, sont en fait constituées de microvillosités sur la base de filaments d&#39;actine modifié. de chaque poil en forme de chevron bundle, trois rangées de stéréocils sont organisées dans un pa très ordonnée et régulièrettern dans un cas comme manière d&#39;escalier. Réel cils base microtubules, kinocilia appelés, sont nécessaires pour le développement et l&#39;orientation des faisceaux stéréocils 12. A chaque cellule de cheveux, un seul kinocil est physiquement attaché à la touffe ciliaire, adjacent au centre de la rangée la plus haute des stéréocils. La fonction précise de la kinocil est pas claire, et une hypothèse est que le kinocil &#39;tire&#39; stéréocils en forme à leur échéance de microvillosités 12. Chez les vertébrés, kinocilia dans la cochlée ne sont présentes que de façon transitoire et se rétractent à partir des cellules ciliées chez les souris avant le début de l&#39;audition 11,13,14. Perte complète de cils dans les résultats de la cochlée en développement dans les conduits cochléaires sévèrement raccourcies, mal formée et mal orienté paquets stéréocils, ainsi que mis-positionnés organes de base 8,9. Un cil fonctionnelle est non seulement composé de l&#39;axonème ciliaire. Beaucoup de protéines associées aux cilsfonction se produire dans des complexes localisés dans les sous-domaines connexes cils tels que le corps de base, zone de transition, ou ciliaire axonème 15. Le corps de base, provenant de la centriole mère du centrosome, est également un centre de microtubules organisation pour les microtubules étendant depuis le cil dans le corps cellulaire et peut réguler le trafic intracellulaire, ainsi que le trafic de ciliaire. La zone de transition ciliaire est une autre région où la fonction ciliaire est réglementé en termes d&#39;organisation importation et l&#39;exportation de composés ciliaires 16. De multiples études ont identifié un lien entre les cils et Wnt non canonique (signalisation PCP), bien que le mécanisme précis est difficile 17. Redondance de gènes ciliaires et le PCP et la sensibilité de la polarité cellulaire à des anomalies cellulaires généralisées, il est difficile de relier directement une mutation à des déficits spécifiques PCP. L&#39;une des sorties de lecture de la signalisation de PCP est le positionnement du corps de base et primary cil donc séparer le primaire à partir des défauts secondaires est difficile. Certaines études de mutants de poisson zèbre et la souris ont suggéré aucun lien entre les cils et de signalisation Wnt 18-20. Les écarts dans les données peuvent refléter des espèces, des tissus ou des différences temporelles dépendantes des cotisations ciliaires vers la signalisation Wnt. En outre, la réactivité Wnt normale pourrait être retenue si les organes de base restent fonctionnelles. Une connaissance plus approfondie le rôle des protéines ciliaires dans les voies de signalisation cellulaire et d&#39;autres phénomènes biologiques est cruciale pour notre compréhension de la biologie cellulaire et du développement, ainsi que pour le développement de stratégies thérapeutiques ciblées.

<table><tbody><tr><td>Outils/Matériel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Élastomère de silicone - Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028-5EA</td><td>Voir note 2</td></tr><tr><td>Micro ciseaux de dissection-lame droite</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinces fines (n° 5 et 55) et pinces émoussées</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection.</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre non revêtu</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lamelles de protection de microscope (22 mm & times ; 40 mm & times ; 0,15 mm)</td><td>Diverses</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipettes de transfert</td><td>Diverses</td><td></td><td></td></tr><tr><td>broches Minutien</td><td>&nbsp ; Outils de haute science</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Porte-échantillon MEB</td><td>tousimis</td><td>8762</td><td></td></tr><tr><td>Goujons de microscopie électronique à balayage</td><td>TED PELLA</td><td>16111</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Tabs : Adhésif carbone</td><td>TED PELLA</td><td>16084-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sécheur de points critiques</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Diverses</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lames de microscope en verre</td><td>Diverses</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lamelles en verre</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissus Kimwipe&nbsp ;</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fins pour pinceau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1& fois ; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>le paraformaldéhyde&nbsp ; (PFA) (Grade EM requis pour EM)</td><td>Divers</td><td></td><td>Préparez une solution à 4 % en 1& fois ; PBS a fait du frais à chaque fois. Grade EM requis pour EM.</td></tr><tr><td>2.5 % Glutaraldehyde Grade1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 7.5)</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Média de montage</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>10&times ; Celui de Hanks Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>14065</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Tétroxyde d’osmium (OsO4 )</td><td>Sigma-Aldrich/Fluka Analytical</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Acide tannique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 200 proof</td><td>Divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti Arl13b</td><td>Protein Tech</td><td>17711-1-AP</td><td>Concentration suggérée 1:1 000</td></tr><tr><td>anti tubuline acétylée (611-B1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>Concentration suggérée 1:800</td></tr><tr><td>anti gamma tubuline (GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td>Concentration suggérée 1:200</td></tr><tr><td>anti Zo_1&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>40-2300</td><td>Concentration suggérée 1:500</td></tr><tr><td>Myosine VI</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6791</td><td>Concentration suggérée 1:1000</td></tr><tr><td>Myosine VIIa</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td>Concentration suggérée 1:1 000</td></tr><tr><td>anti Vangl2</td><td>Merk Millipore</td><td>ABN373</td><td>Concentration suggérée 1:250</td></tr><tr><td>anti G&alpha ; i3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4040</td><td>Concentration suggérée 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg ; 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Concentration suggérée 1:300 - 1 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg ; 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Concentration suggérée 1:300 - 1 000</td></tr></tbody></table>

Évaluation de planar-cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

Ces dernières années, les cils primaires sont devenus des régulateurs clés dans le développement et la maladie en influençant de nombreuses voies de signalisation. L’une des premières voies de signalisation associées à la fonction ciliaire était la voie de signalisation Wnt non canonique, également appelée signalisation de polarité cellulaire planaire (PCP). L’un des meilleurs endroits pour étudier les effets de la signalisation de la polarité cellulaire planaire (PCP) pendant le développement des vertébrés est la cochlée des mammifères. La perturbation de la signalisation PCP dans la cochlée de la souris perturbe la croissance cochléaire, la structure cellulaire et l’orientation des cellules ciliées, qui sont toutes affectées par le dysfonctionnement des cils. L’objectif de ce protocole est de décrire l’analyse de la signalisation PCP dans la cochlée de mammifère en développement par analyse phénotypique, immunohistochimie et microscopie électronique à balayage. Les défauts de convergence et d’extension se manifestent par un raccourcissement du canal cochléaire et/ou des modifications de la structure cellulaire, qui peuvent être quantifiées après dissection de mutants murins en développement. Les changements dans l’orientation stéréociliaire du faisceau et la longueur ou le positionnement des kinocilia peuvent être observés et quantifiés à l’aide de l’immunofluorescence ou de la microscopie électronique à balayage (MEB). Une compréhension plus approfondie du rôle des protéines ciliaires dans les voies de signalisation cellulaire et d’autres phénomènes biologiques est cruciale pour notre compréhension de la biologie cellulaire et du développement, ainsi que pour le développement de stratégies de traitement ciblées.

Cochlée Dissection et de tissus Préparation Après l&#39;élimination du cerveau, après la mi-ligne dissection sagittal d&#39;une tête P0 de la souris, le labyrinthe osseux, vu de derrière, peut être visualisée (Figure 1A, flèche blanche) et enlevé. Figure 1B montre les labyrinthes osseuses isolées avec les cheveux cochléaire vers le haut, ventrale, (à gauche) et de l&#39;arrièr...

Les cils primaires influencent diverses voies de signalisation. La cochlée de mammifère est idéale pour examiner la signalisation de la polarité cellulaire planaire (PCP). Le dysfonctionnement des cils affecte la croissance cochléaire, la structure cellulaire et l’orientation des cellules ciliées, les lectures de PCP. Notre objectif est d’analyser la signalisation PCP dans la cochlée de souris via l’analyse phénotypique, l’immunohistochimie et la microscopie électronique à balayage.

Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

L'objectif général de ce protocole est d'examiner les cochlées de souris mutantes ciliées afin d'analyser les phénotypes de polarité cellulaire planaire. Ces techniques permettent une description détaillée du phénotype cochléaire, conduisant ainsi à une compréhension plus précise du rôle des cils dans l'établissement de la signalisation PCC (polarité cellulaire planaire) chez les vertébrés. Le principal avantage de ce protocole réside dans le fait que, une fois maîtrisé, l'épithélium cochléaire disséqué peut être utilisé pour divers types d'analyses phénotypiques.Après avoir préparé les réactifs et les tissus provenant des animaux expérimentaux, au stade de développement E16,5 à p3, utilisez une lame de scalpel ou une petite paire de ciseaux pour disséquer la tête le long de la ligne médiane sagittale, en partant du nez et en allant jusqu'au condyle. Retirez le cerveau de chaque moitié du crâne à l’aide d’une pince. Ensuite, identifiez les os temporaux qui contiennent les labyrinthes osseux en développement de l’oreille interne.Lors de la manipulation de l'échantillon au microscope stéréoscopique, utilisez une pince pour détacher délicatement les labyrinthes osseux du crâne en glissant la pince doucement sous les labyrinthes osseux. Après la dissection, utilisez la pointe de la pince de dissection pour dégager les fenêtres ovale et ronde et pratiquer un petit trou au sommet de la spirale cochléaire. Ensuite, fixez les labyrinthes osseux dans 1,5 millilitre de paraformaldéhyde à 4 % pendant cinq minutes sur de la glace afin de faciliter le retrait de la membrane tectoriale.Maintenant, placez les labyrinthes osseux dans une boîte de dissection recouverte d’un élastomère de silicone noir contenant du PBS afin de faciliter la dissection. Utilisez une pince n°5 pour enlever le cartilage externe, exposant ainsi le canal cochléaire. Commencez par la fenêtre ovale, insérez l’extrémité inférieure de la pince dans la fenêtre ovale, puis soulevez délicatement le cartilage en remontant progressivement vers l’apex.Ensuite, utilisez une pince fine pour pincer la membrane de Reissner à la base du canal cochléaire et retirez-la par un mouvement ascendant. Visualisez l'aspect dorsal du canal cochléaire, y compris l'épithélium sensoriel. Puis, utilisez une pince n°55 pour pincer la membrane tectoriale à la base de la cochlée, et décollez-la vers le haut en direction de l'apex.La suppression complète de la membrane tectoriale est nécessaire pour obtenir les meilleures images en immunohistochimie et est essentielle pour la microscopie électronique à balayage. Après avoir exposé l'organe de Corti, fixez davantage le tissu et effectuez l'immunohistochimie, ou préparez-le pour la microscopie électronique à balayage, comme indiqué dans la partie écrite du protocole. Une fois le tissu coloré, placez l'échantillon dans une boîte en élastomère silicone noir contenant du PBS.À l’aide de pinces fines, retirez la région vestibulaire de la spirale cochléaire. Ensuite, retirez très soigneusement le cartilage sous-jacent et le mésenchyme de la spirale cochléaire. La spirale cochléaire restante contient le sillon interne, l’organe de Corti et le sillon externe.Transférez la spirale cochléaire dans une goutte de PBS placée sur une lame de microscope. Absorbez le PBS à l’aide d’un papier absorbant ou d’un morceau de papier filtre, puis repositionnez délicatement la spirale cochléaire si l’épithélium s’est déplacé et se chevauche. Ajoutez une goutte de milieu de montage directement sur l’échantillon de cochlée, puis placez doucement une lamelle sur l’échantillon, en prenant soin d’éviter les bulles d’air.Utilisez un microscope épifluorescent ou un microscope confocal à balayage laser équipé d'objectifs à fort grossissement et à haute ouverture numérique pour capturer des images de la surface apicale des cellules ciliées cochléaires. Utilisez des objectifs de plus faible grossissement pour acquérir des images en chevauchement de la spirale cochléaire afin de quantifier la longueur du canal cochléaire. Les images suivantes montrent une coloration immunofluorescente d'une cochlée de type tournant basal, au jour postnatal un.La phalloïdine marque l'actine filamenteuse dans les stéréocils et l'actine corticale au niveau de la périphérie cellulaire. La myosine VIIA est un marqueur des cellules ciliées internes et externes. ZO_1 marque les jonctions serrées situées entre les cellules, ce qui en fait un excellent marqueur pour distinguer les limites cellulaires.La tubuline alpha acétylée est utilisée comme marqueur du kinocilié au sommet du faisceau, comme indiqué par la flèche blanche. Les microtubules internes sont également marqués par la tubuline alpha acétylée, particulièrement abondante dans les cellules pilier, comme indiqué par les astérisques blancs. Cette image de conduits cochléaires disséqués à E18,5, colorés avec la tubuline acétylée, montre un raccourcissement marqué des conduits cochléaires chez les souris knock-out conditionnel pour IFT20 par rapport aux témoins.L'image suivante montre une préparation en montage entier du tour basal de la cochlée chez des souris knock-out pour BBS8, au jour postnatal zéro. Les faisceaux stéréociliaires des cochlées de souris knock-out BBS8 présentent une rotation variable, indiquée par la flèche de droite, ou sont aplatis et mal localisés, comme l'indique la flèche centrale. Les kinocils sont mal localisés ou leurs axonèmes sont absents, comme le montre la flèche de gauche.Lors de la préparation du phénotype cochléaire pour l'analyse, il est important de garder à l'esprit que les différences de fond génétique peuvent modifier le phénotype cochléaire. Par conséquent, il est essentiel d'utiliser des témoins provenant de la même portée pour l'analyse. D'autres analyses comprennent les tests audiométriques et la culture d'explantats cochléaires, ce qui permet un traitement par divers activateurs ou inhibiteurs de signalisation, contribuant ainsi à une compréhension mécanistique des processus développementaux impliqués.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation du tissu cochléaire pour analyser le rôle des composants ciliaires et leurs effets spécifiques sur la signalisation du PCP.

evaluation-planar-cell-polarity-phenotypes-ciliopathy-mouse-mutant

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Une procédure simple de vibratome sectionner l'organe de Corti, suivie par microscopie confocale immunohistochimie et est décrit. Cette procédure permet une meilleure conservation de l'cytoarchitecture amende de l'organe de Corti des mammifères, et permet par conséquent d'une quantification précise des types de cellules.

Vibratome sectionnement pour la préservation accrue de la cytoarchitecture de l&#39;Organe de Corti des mammifères

La cytométrie en flux est un outil puissant permettant l'isolement et l'étude de populations cellulaires spécifiques. Ce protocole décrit les étapes d'isolement de cellules exprimant LacZ à partir de tissus cochléaires de souris transgéniques néonatales. Les cellules cochléaires dissociées ont été marquées à l'aide de substrats marqués par un fluorochrome de la β-galactosidase avant leur séparation par cytométrie en flux.

Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

Imagerie en temps réel de la cochlée des mammifères embryonnaire est difficile parce que les processus de développement de la main fonctionnent sur un gradient temporel de plus de dix jours. Nous présentons ici une méthode pour la culture et l'imagerie des tissus embryonnaires des explants cochléaire pris d'une souris rapporteur fluorescent sur cinq jours.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Nous présentons une méthode qui décrit l’isolement et la culture d’explants cochléaires à partir d’oreilles internes embryonnaires de souris.  Nous démontrons également une méthode de transfert de gènes dans des explants cochléaires par électroporation à ondes carrées. La culture d’explants in vitro couplée à la technique de transfert de gènes permet aux chercheurs d’étudier les effets de la modification de l’expression des gènes au cours du développement.

Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d'autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Nous présentons un protocole pour isoler la bulle auditive, la capsule et les osselets de souris postnatales pour une analyse histologique et de montage entier.

Dissection de l&#39;Auditory Bulla chez les souris postnatale: Isolation des os de l&#39;oreille moyenne et l&#39;analyse histologique

Cultures organotypique tridimensionnelle de l’utricule murin et la cochlée en défricher collagène j’ai gélifie morphologie tissulaire innée preserve optiquement, permettant une stimulation mécanique au moyen d’ajustement de la rigidité de la matrice et permettent la livraison de gène induite par le virus.

Culture organotypique en trois dimensions des organes sensoriels vestibulaires et auditives

Ce manuscrit décrit un protocole expérimental pour évaluer les caractéristiques morphologiques et l'état fonctionnel des synapses de ruban chez les souris normales. Le modèle actuel convient également aux modèles à synaptopathie cochléaire induits par le bruit et liés à l'âge. Les résultats corrélatifs des études précédentes de souris sont également discutés.

Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses de ruban aux régions spécifiques de fréquence de la Cochlea de souris

Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l'utilisation d'un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l'immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

Cette étude décrit comment disséquer le sac endolymphatique de l’oreille interne de la souris à différents âges. Le résultat d’une dissection similaire est montré dans un modèle murin Slc26a4-null d’élargissement du sac endolymphatique. Une souris transgénique avec un rapporteur fluorescent exprimé dans le sac endolymphatique est présentée comme un modèle permettant de visualiser facilement le sac endolymphatique, et un outil éducatif.

Dissection du sac endolymphatique de souris

Le protocole actuel met à jour les protocoles précédents et intègre des approches relativement simples pour la culture d’explants cochléaires de haute qualité. Cela permet une acquisition de données fiable et une imagerie haute résolution dans les cellules vivantes et fixes. Ce protocole s’inscrit dans la tendance actuelle à l’étude des cellules de l’oreille interne.

Explants cochléaires néonatals entiers comme modèle in vitro

Découvrez l'analyse phénotypique de la cochlée de souris mutante ciliaire pour étudier la polarité cellulaire planaire. Cette méthode combine immunohistochimie et microscopie électronique à balayage pour comprendre le rôle des cils dans le développement de l'oreille interne.

Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée

Explorer plus de vidéos