Name: Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Apprenez la dissection en montage entier et l'immunofluorescence de la cochlée de souris adultes. Cette méthode préserve la structure tridimensionnelle de l'organe de Corti et permet la visualisation détaillée des cellules ciliées et des cellules de soutien par microscopie confocale.

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Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de l’Office of Naval Research (N000141310569). L’équipement de l’installation d’imagerie de recherche de la Southern Illinois University School of Medicine a été soutenu par le National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l&#39;Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Southern Illinois. 1. Extraction des temporelles Bones <ol><li> Identifier les os temporaux dans la base du crâne de la souris 13 et gratter les nerfs crâniens aide de pinces de modèle standard. </li><li> Placez la pince de modèle standard à la pointe de la capsule otique et avec le pouce de la presse à main opposée sur le canal semi-circulaire postérieur pour déloger la cochlée encapsulé. </li><li> Libérez la moitié inférieure de l&#39;os temporal du crâne manuellement avec le pouce et l&#39;index ou en utilisant 10,5 cm de ciseaux fins. </li></ol> 2. Post-temporelles fixer Bones <ol><li> Placer os temporal dans 2 ml contenant des tubes de microcentrifugation de 250 à 500 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) dilué dans 10 mM de tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4 et Incubmangé à RT pour les 2 - 20 heures. NOTE: Aucune ouverture de la coiffe apicale ou l&#39;injection de PFA dans la ronde ou fenêtre ovale est nécessaire. Recommander utilisant du méthanol libre, ultra-pure, la microscopie électronique (EM) de grade PFA qui peuvent être achetés à une concentration de 16% dans des flacons de verre. Une fois que le flacon est ouvert et dilué à 1: 4 dans du PBS, en faisant une solution à 4%, il peut être utilisé pour 2 semaines lors d&#39;un stockage à 4 ° C (Certains anticorps nécessitent court fixation et d&#39;autres peuvent tolérer O / N (O / N) de fixation). </li></ol> 3. détartrer temporelles Bones <ol><li> Après fixation, retirez PFA aide d&#39;une pipette et le remplacer avec de l&#39;acide 120 mM éthylènediaminetétraacétique (EDTA), un peu plus de 2 ml. Assurez-vous de remplir la totalité de microtube de 2 ml pour éviter les bulles d&#39;air lorsque le tube est fermé. <ol><li> Si non détartrage immédiatement, replacez PFA avec PBS 10 mM pH 7,4 et stocker des échantillons à 4 o C. NOTE: Après fixation, os temporaux peuvent être stockés pendant variabLe élève de temps avant la décalcification selon les antigènes en cours d&#39;examen. </li></ol></li><li> Placer les tubes sur la fin-sur-end rotateurs et tournent à 4 min à température ambiante. Changer solution d&#39;EDTA quotidiennement à l&#39;aide d&#39;une pipette. Durée de décalcification dépend de l&#39;âge de l&#39;échantillon et la préférence du scientifique faisant la dissection. <ol><li> Incuber os temporaux en EDTA utilisant les directives suivantes pour les durées d&#39;incubation: Pour les échantillons postnatale jour (P) 8 à P15: 2 - 4 h; Pour les échantillons P15 à P21: O / N; Pour les échantillons P21 à P30: 2 O / N; Pour les échantillons de plus de P30: 3 ou plus O / N. Remarque: Les temps de décalcification sont soumis à la préférence des utilisateurs et peuvent être prolongés si nécessaire. Temps de décalcification peut être réduite par modification de la solution d&#39;EDTA deux fois par jour, environ 8 heures d&#39;intervalle. Certains laboratoires ajouter 1% de PFA à la solution d&#39;EDTA un détartrage pendant plus de 3 jours pour éviter la contamination. </li></ol></li><li> Pour déterminer si l&#39;échantillon est suffisamment détartrer, placez os temporaux ona silicium enduit d&#39;élastomère plat de dissection et appuyez doucement forceps sur la cochlée forme d&#39;escargot. Si le tissu est spongieuse, puis décalcification est terminée. </li><li> Une fois décalcification est terminée, retirez EDTA aide d&#39;une pipette et ajouter 500 -1 000 pi de PBS 10 mM pH 7,4. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu&#39;au moment de disséquer. </li></ol> 4. Créer un élastomère de silicone revêtu Dish Dissection <ol><li> Mélanger la base et le durcisseur d&#39;un kit d&#39;encapsulation d&#39;élastomère de silicone selon les instructions du fabricant et bien mélanger. </li><li> Ajouter environ 2 - 3 cuillères à soupe de poudre de charbon jusqu&#39;à ce que la solution est noir et bien mélanger. REMARQUE: Encre liquide ou de charbon liquide ne se mélangent pas avec la solution et ne peuvent pas être utilisés. Kits élastomère d&#39;encapsulation en silicone peuvent être achetés en noir, ce qui permet à l&#39;étape 4.2 être omis. </li><li> Versez la solution dans 60 mm de verre ou des boîtes de Petri en plastique, suffisamment copieux pour recouvrir le fond. Si bubbles sont présents, gonflent avec de l&#39;air à la surface. Laisser reposer au moins 24 heures à la température ambiante à définir. REMARQUE: plats enduits d&#39;élastomère de silicone peuvent être utilisés de façon répétée pendant des années. Cependant, ne pas utiliser l&#39;éthanol pour le nettoyage, car cela provoquerait l&#39;élastomère de silicone à se fissurer. </li></ol> 5. Mont entiers Dissection de la cochlée (pour P7 et anciens échantillons) <ol><li> Séparer le tour basal de tours moyen / apical <ol><li> Placez un os temporal adoucie dans un plat de dissection élastomère de silicone revêtu rempli aux deux tiers avec du PBS 10 mM pH 7,4 et utiliser un microscope de dissection stéréo pour les étapes suivantes. </li><li> Tenir l&#39;os temporal dans la région vestibulaire avec n ° 4 ou n ° 5 des pinces de bijoutier droite et en utilisant 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, couper l&#39;excédent de tissu de la capsule otique sur les côtés et au-dessus de l&#39;apex. </li><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, insérer une lame dans la fenêtre ovale et de faire plusieurs petites coupures le long de la spirale ligament / latéraleparoi de la tour basal. </li><li> Utilisation de 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, insérer une lame dans la région il suffit de couper et placer l&#39;autre lame à l&#39;extérieur de l&#39;os temporal, en dedans de la fenêtre ovale. Cette coupe sépare le tour basal de virages moyens et apical. </li></ol></li><li> Dissection complète du tour basal. <ol><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, couper les fibres nerveuses du ganglion spiral qui se connectent à l&#39;modiolus pour relâcher la tension dans la tour basal et couper en dessous de la tour basal de se séparer de organes vestibulaires. </li><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, faire une série de petites coupures pour supprimer le / paroi latérale spirale ligament du dessus et en dessous l&#39;organe de Corti. Utilisez # 4 ou # 5 pince de bijoutier droite pour guider le tissu. Epingler les fibres nerveuses ganglionnaires spirale vers le plat de dissection d&#39;enduit d&#39;élastomère de silicone, mais ne tenez pas sur cette région que le tissu se déchire. </li><li> Au cours des étapes précédentes, une partie de la Membran de Reissnere va souvent être retiré. Si tout reste encore, saisir la membrane de Reissner avec une pince de n ° 4 ou n ° 5 droite bijoutier et se détache de l&#39;organe de Corti. NOTE: La membrane de Corti est rarement visible et flotte généralement distance sans nécessiter une étape spécifique pour l&#39;enlèvement. </li><li> Faire Enfin plusieurs coupes de réduire l&#39;épaisseur des axones du ganglion spiral, pour faire le tour le plus plat possible et utiliser n ° 4 ou n ° 5 des pinces de bijoutier droit de transférer le tour basal disséqué, en saisissant les axones restants du ganglion spiral, à une plaque de 48 puits (ou lame de chambre) contenant ~ 500 pi de PBS 10 mM pH 7,4. </li></ol></li><li> Moyen séparée et tours apical <ol><li> Placez les deux-tiers restants de la cochlée, côté apical vers le bas. </li><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, insérer une lame dans les médias de Scala où le tour Moyen utilisé pour être connecté à la tour basal, et de faire plusieurs petites coupures le long de la paroi spirale ligament / latérale de ee spire médiane. </li><li> Utilisation de 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, insérer une lame dans la région il suffit de couper avec le tour Moyen placé sur le dessus de la lame, et placer l&#39;autre lame à l&#39;extérieur du labyrinthe osseux, à un angle de la pointe apicale 90 o. Cela sépare le tour du milieu de la tour apicale. </li></ol></li><li> Dissection complète du tour milieu d&#39;une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4). </li><li> Dissection complète du tour apicale. <ol><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, ouvrir le capuchon qui couvre le tour apicale. Dissection complète d&#39;une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4). NOTE: disséqué tours cochléaires peuvent être stockés dans PBS 10 mM pH 7,4 dans une plaque de 48 puits (ou lame de chambre) à 4 o C pendant plusieurs semaines avant immunocoloration. Cependant PBS s&#39;évaporer et doit être réapprovisionné périodiquement et le stockage de plus de 2 - 3 semaines peut conduire à la croissance bactérienne ou fongique sur latissu qui peut diminuer la qualité de l&#39;image. Nous recommandons un stockage à long terme des échantillons que os temporaux undissected. </li></ol></li></ol> 6. Immunocoloration avec par fluorescence Tagged Anticorps <ol><li> Après la dissection, stocker chaque tour cochléaire dans un puits séparé dans une plaque de 48 puits (ou lame de chambre), immergé dans ~ 500 pi de PBS 10 mM pH 7,4. Pour chacune des étapes suivantes de la tour cochléaire doit être immergé dans un liquide, non flottant au-dessus ou collé sur le côté du puits. REMARQUE: Lors du retrait de liquide de chaque puits, il est facile de perdre les tours cochléaires ou sucer dans la pointe de la pipette. Modification de solutions avec une pointe de pipette 200 pi en utilisant un champ de dissection aidera à prévenir cela. </li><li> En utilisant une pipette, retirer PBS de chaque puits et le remplacer par ~ 200 - 300 pi par puits de bloquer / solution de perméabilisation (1% de Triton X-100, 1% de sérum albumine bovine (BSA), et 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dilué dans 10 mM de PBS pH 7,4). Incuber 1 heure à température ambiante sur un rotateur 3D. NOTE: Si un anticorps primaire utilisé a été faite dans un hôte de chèvre, puis un anticorps secondaire anti-chèvre sera nécessaire et NGS ne doit PAS être utilisé pour toutes les étapes. De sérum de cheval normal peut être utilisé comme un remplacement pour NGS. </li><li> Retirer la solution de blocage / de perméabilisation en utilisant une pipette et le remplacer par ~ 100 pi par puits de solution d&#39;anticorps primaire (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, 5% de NGS et diluées dans du PBS 10 mM pH 7,4). Le facteur de dilution pour chaque anticorps primaire varie. Incuber O / N (minimum 14 heures) à 4 ° C sur un agitateur 3D. NOTE: Si plus d&#39;un anticorps primaire est utilisé, tous peuvent être combinés dans la même solution pour l&#39;incubation, assurez-vous que chaque anticorps primaire a un hôte différent. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps primaire à l&#39;aide d&#39;une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 ul par puits. Chaque lavage couve un minimum de 5 min à température ambiante sur un rotateur 3D. </li><li> Retirer P dernièreBS laver avec une pipette et le remplacer avec ~ 100 pi par puits d&#39;une solution d&#39;anticorps secondaire (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, et 5% NGS dilué dans 10 mM PBS pH 7,4). Le facteur de dilution pour chaque étiqueté par fluorescence anticorps secondaire est habituellement de 1: 500 ou 1: 1000. Placez la plaque de 48 puits dans une boîte noire pour protéger fluorescence marqués Anticorps secondaires de la lumière. Incuber 2 - 3 heures à température ambiante sur un rotateur 3D. REMARQUE: si plus d&#39;un anticorps secondaire est nécessaire, ils peuvent être combinés dans la même solution pendant l&#39;incubation. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de possibilité de contre-étiquetage (par ex., En utilisant chèvre anti-lapin et de poulet anti-chèvre Anticorps secondaires) </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps secondaire à l&#39;aide d&#39;une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 pi par puits. Incuber chaque lavage pendant au moins 5 min à température ambiante sur un agitateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Retirez dernier lavage PBS aide d&#39;une pipette et le remplacer par ~ 100 pi par puits de HoecTVH 33342 (dilué 1: 2000 dans PBS 10 mM pH 7,4) pour marquer les noyaux. Incuber 15 - 20 min à température ambiante sur un rotateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l&#39;abri de la lumière. Ne pas incuber plus de 20 minutes. </li><li> Retirer solution Hoechst aide d&#39;une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 pi par puits. Incuber chaque lavage pendant au moins 5 min à température ambiante sur un agitateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Toutes les étapes peuvent être prolongés, sauf Hoechst incubation, de plusieurs heures si nécessaire. Pour interrompre la réaction à tout moment, simplement plonger échantillons dans ~ 500 ul de 10 mM PBS pH 7,4 et stocker la plaque 48 eh bien (ou chambre lame) à 4 o C jusqu&#39;au moment de reprendre les heures de protocole ou 1 - 2 jours plus tard . </li></ol> 7. Mont Cochlear Active Diapositives <ol><li> Étiquette glisse avec des informations pertinentes sur l&#39;échantillon et les anticorps utilisés. </li><li> Pipette ~ 50 pi de milieu de montage sur chaque diapositive et soyez prudentpour éviter que des bulles. Centrifuger le tube contenant les milieux de montage pour éliminer les bulles. </li><li> Utilisation # 4 ou pince de # 5 droite bijoutier, saisir les axones du ganglion spiral de transférer en douceur un tour cochléaire de la plaque de 48 puits à la diapositive et le lieu dans les milieux de montage. Montez un tour cochléaire par diapositive pour éviter exposition à la lumière et photoblanchiment pendant le processus d&#39;imagerie. </li><li> Utiliser un microscope de dissection stéréo pour assurer ce tour cochléaire soit pas plié, tordu, ou près d&#39;une bulle d&#39;air. Si l&#39;une de ces situations se produit, les pinces d&#39;utilisation n ° 4 ou n ° 5 droite bijoutier pour repositionner le tour cochléaire. </li><li> Placez une extrémité d&#39;une lamelle sur la lame et relâchez doucement pour laisser la chute de lamelle. </li><li> Utilisez une dissection microscope stéréo pour garantir que le tour cochléaire soit pas plié, tordu, ou près d&#39;une bulle d&#39;air. Si l&#39;une de ces situations se produit, déplacez doucement la lamelle d&#39;avant en arrière pour repositionner le tour cochléaire. </li><li> Placer les lamesdans un dossier de diapositives afin qu&#39;ils reposent à plat. Laissez montage remède médias O / N à température ambiante (garder dans l&#39;obscurité) </li><li> Des lamelles de sceller avec vernis transparent de l&#39;ongle et stocker à température ambiante ou à -20 ° C jusqu&#39;à ce imagés. Les diapositives peuvent être stockées dans un dossier de diapositives ou boîte de diapositive. REMARQUE: Les diapositives peuvent être stockées à long terme à -20 ° C ou -80 ° C et la fluorescence sera maintenu pendant plusieurs mois. </li><li> Glisse image en utilisant un microscope confocal à la longueur d&#39;onde appropriée sur la base des anticorps secondaires utilisés durant la procédure d&#39;immuno-coloration. Réglage de la luminosité et de contraste peuvent être effectuées en utilisant le logiciel d&#39;imagerie fournie par le fournisseur confocale. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

<html> Il ya plusieurs étapes cruciales pour la réussite de toute la dissection de montage et immunologique. Cependant, avant l&#39;une de ces méthodes sont exécutées, fixation appropriée du tissu cochléaire est nécessaire. Nous vous recommandons d&#39;utiliser le méthanol libre, ultra-pure, de qualité EM PFA. PFA fait à partir de poudre peut avoir des traces de méthanol et un pH instable qui diminue la qualité de l&#39;immunofluorescence. D&#39;autres groupes ont également montré que les dissections similaires sont poss...

La cochlée en forme de spirale de l&#39;oreille interne, contenue dans l&#39;os temporal, abrite l&#39;organe de Corti, la sensibilité auditive organe final chez les mammifères. La cochlée est tonotopically organisé et souvent divisé en apicale, un milieu et basale tours correspondant à différentes régions de fréquence avec détection de son à haute fréquence dans la base et la détection de basse fréquence dans l&#39;apex 1. Les cellules ciliées, les cellules mécano de l&#39;organe de Corti, courent tout le long de la cochlée, qui est d&#39;environ 6 mm de long chez la souris 2,3. Ces cellules convertissent l&#39;énergie mécanique des ondes sonores, qui sont transmis à travers le labyrinthe membraneux rempli de fluide, en des signaux neuronaux qui sont traitées par les structures auditives centrales. La technique décrite ici concerne un procédé pour la préparation de supports entiers de l&#39;organe de Corti après calcification de la cochlée est complète (pour les échantillons allant de 1 semaine d&#39;âge et l&#39;âge adulte). Nous présentons également une méthode pour immunostaining le tout monté tissus cochléaire. Montures entières cochléaires sont cruciales pour la visualisation de toutes les cellules de cheveux et entourant les cellules de soutien dans leurs arrangements spatiaux naturelles et permettent l&#39;analyse en trois dimensions avec l&#39;utilisation de la microscopie confocale. Drs. Hans Engstrom et Harlow Ades décrits à l&#39;origine un ensemble de monter méthode de dissection cochléaire en 1966. Ils ont décrit une technique pour fixer rapidement et disséquer cochleae calcifiée immergée dans un liquide à partir d&#39;une variété de mammifères, la préservation de courts segments intacts de l&#39;organe de Corti pour analyse microscopique 4. La dissection, une cochlée de rat calcifiée non fixée a également été illustré dans une vidéo d&#39;instruction 5. Drs. Barbara Bohne et Gary Harding à l&#39;Université de Washington ont fait plusieurs modifications importantes à cette méthode. Dans leur version de la méthode de montage toute cochléaire, l&#39;os temporal était adoucie, noyée dans le plastique, et cinq demi-tours ou dix quarts de tours étaient dissectionTed 6,7. Dr Charles Liberman et ses collègues de Eaton Peabody laboratoires, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiés cette technique afin que le plastique intégration n&#39;a pas été nécessaire 8. Une modification supplémentaire de la technique a eu lieu dans le laboratoire du Dr Jian Zuo recherche de l&#39;Hôpital pour enfants St. Jude 9-12 qui a informé la méthode de dissection présenté ici. On utilise une stratégie différente pour avoir accès à l&#39;organe de Corti et que Bohne Liberman, ce qui permet l&#39;isolement de toutes les apical, au milieu et à tour de rôle de base. Ainsi le tissu disséqué est plus grande et moins susceptibles d&#39;être perdus ou endommagés pendant les processus de dissection ou immunocoloration. De plus, le procédé actuel facilite la mesure de la distance à partir de l&#39;extrémité apicale ou basale crochet pour identifier une région de fréquence. Bien que de nombreux laboratoires effectuent un marquage de tissu cochléaire, on ne sait pas où cette méthode est originaire. En conséquence, il existe plusieurs recettes pour bloquer Buffers et incubation des anticorps tampons qui peuvent affecter la performance des anticorps primaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence qui est applicable à des anticorps les plus couramment utilisés dans le domaine auditif. La forme complexe de la cochlée, la structure délicate de l&#39;organe de Corti, et enrobage osseuse constituent un défi pour l&#39;analyse histologique et biochimique. Une variété de techniques sont actuellement utilisés dans le domaine de l&#39;audition de surmonter ces caractéristiques difficiles et visualiser les cellules à l&#39;intérieur de l&#39;organe de Corti, chaque technique avec ses propres avantages et inconvénients. Le protocole présenté ici permet pour toute la dissection de montage de la cochlée de souris adulte et, avec une légère modification, peut potentiellement être utilisé pour examiner les structures critiques au sein de la cochlée d&#39;une variété d&#39;autres organismes modèles utilisés dans le domaine.

<table><tbody><tr><td>Pince à motif standard</td><td>Les outils de science fine</td><td>11000-12</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Ciseaux fins de 10,5 cm</td><td>Outils de science fine</td><td>14060-11</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 2 ml</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs 16</td></tr><tr><td> % de formaldéhyde, sans méthanol, ultra pur, grade</td><td>EM Polysciences</td><td>18814</td><td>TOXIQUE --Portez des gants et ne pouvez pas être jeté dans l’évier. Peut être acheté auprès d’autres vendeurs.&nbsp ;</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Rotateur de tube bout à bout</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Boîte de</td></tr><tr><td>Pétri de 60 mm</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Kit d’encapsulation</td></tr><tr><td>en silicone Dow Corning Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr>charbon<td>actif</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr> microscope à <tr><td>dissection stéréo</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Dumont #4 pince de bijoutier</td><td>Outils de science fine</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pince de bijoutier</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas de 2,5 mm</td><td>Outils de science fine</td><td>15001-08</td><td>courbés.</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas-Tübingen de 5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>plaques droites</td></tr><tr>à<td>48 puits</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Diapositives à chambre à 8 puits</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>BSA, fraction V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Rotateur 3D</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Boîte d’incubation Western blot XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Les</td></tr><tr><td>supports de montage anti-effacement Prolong gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs, mais les supports de montage varient dans leur capacité à protéger contre le photoblanchiment</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs lamelles de</td></tr><tr><td>protection 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs vernis à</td></tr><tr><td>ongles transparent</td><td>Drugstore</td><td></td><td>local peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Chemise à</td></tr><tr><td>lames en carton</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>peut être achetée auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Boîte à lames en plastique</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>peut être achetée auprès d’autres fournisseurs</td></tr></tbody></table>

mont entiers dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

L’organe de Corti, logé dans la cochlée de l’oreille interne, contient des cellules ciliées mécanosensorielles et des cellules de soutien environnantes qui sont organisées en forme de spirale et ont un gradient tonotopique pour la détection des sons. La cochlée de la souris mesure environ 6 mm de long et est souvent divisée en trois tours (apex, milieu et base) pour l’analyse. Pour étudier la perte cellulaire, la division cellulaire ou l’expression génique en mosaïque, l’ensemble du montage ou de la préparation de surface de la cochlée est utile. Cette méthode de dissection permet de visualiser toutes les cellules de l’organe de Corti lorsqu’elle est combinée à l’immunomarquage et à la microscopie confocale pour imager les cellules à différents plans de l’axe z. Plusieurs sections efficaces optiques peuvent également être obtenues à partir de ces images de la pile z. De plus, la méthode de dissection complète peut être utilisée pour la microscopie électronique à balayage, bien qu’une méthode de fixation différente soit nécessaire. Ici, nous présentons une méthode pour isoler l’organe de Corti en trois tours cochléaires intacts (apex, milieu et base). Cette méthode peut être utilisée pour des souris âgées d’une semaine à l’âge adulte et diffère de la technique utilisée pour les échantillons néonatals où la calcification de la cochlée est incomplète. Une version légèrement modifiée peut être utilisée pour la dissection de la cochlée du rat. Nous faisons également la démonstration d’une procédure d’immunomarquage avec des anticorps marqués par fluorescence.

Nous présentons une méthode pour isoler l&#39;organe de Corti que trois tours intactes cochléaires (de sommet, milieu, et la base) à partir de tissu cochléaire qui est calcifiée, avec des étapes de dissection clés présentés dans la figure 1. Pendant la première semaine postnatale du développement, la calcification de la cochlée de souris est incomplète et une méthode de dissection plus simple peut être utilisé 13. En utilisant la méthode de di...

Nous présentons une méthode pour isoler l&#39;organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l&#39;étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d&#39;autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

L'objectif général de cette méthode de dissection en montage entier est d'isoler la région sensorielle du limaçon adulte calcifié en trois tours intacts : l'apex, le milieu et la base. Cette méthode de dissection préserve la structure tridimensionnelle de l'organe de Corti et permet la visualisation de toutes les cellules lorsqu'elle est combinée à une immunomarquage et à une microscopie confocale pour l'imagerie sur différents plans selon l'axe Z. Par rapport aux méthodes de dissection précédentes, nous utilisons une stratégie différente qui produit trois tours cochléaires plus grands et moins sujets à être perdus ou endommagés lors du processus d'immunomarquage.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la dissection est difficile à apprendre. Étant donné que l'organe de Corti est fragile, la marge d'erreur lors du retrait du ligament spiral est très faible. Après avoir euthanasié l'animal selon les procédures approuvées et retiré le cerveau, commencez par identifier les os temporaires à la base du crâne de la souris.Ensuite, retirez les nerfs crâniens à l’aide de pinces de type standard. Placez les pinces à l’extrémité de la capsule otique et utilisez le pouc

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Une procédure simple de vibratome sectionner l'organe de Corti, suivie par microscopie confocale immunohistochimie et est décrit. Cette procédure permet une meilleure conservation de l'cytoarchitecture amende de l'organe de Corti des mammifères, et permet par conséquent d'une quantification précise des types de cellules.

Vibratome sectionnement pour la préservation accrue de la cytoarchitecture de l&#39;Organe de Corti des mammifères

Les cils primaires influencent diverses voies de signalisation. La cochlée de mammifère est idéale pour examiner la signalisation de la polarité cellulaire planaire (PCP). Le dysfonctionnement des cils affecte la croissance cochléaire, la structure cellulaire et l’orientation des cellules ciliées, les lectures de PCP. Notre objectif est d’analyser la signalisation PCP dans la cochlée de souris via l’analyse phénotypique, l’immunohistochimie et la microscopie électronique à balayage.

Évaluation de Planar-Cell-polarité phénotypes dans ciliopathie souris mutante cochlée

Nous décrivons ici une méthode d’imagerie de haute résolution entier-montent dans la peau d’oreille de souris adulte entier, qui nous permet de visualiser la ramification de la morphogenèse et structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que distribution de cellules immunitaires.

Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

Ce manuscrit décrit un protocole expérimental pour évaluer les caractéristiques morphologiques et l'état fonctionnel des synapses de ruban chez les souris normales. Le modèle actuel convient également aux modèles à synaptopathie cochléaire induits par le bruit et liés à l'âge. Les résultats corrélatifs des études précédentes de souris sont également discutés.

Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses de ruban aux régions spécifiques de fréquence de la Cochlea de souris

Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l'utilisation d'un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l'immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

Dans cette étude, nous présentons une méthode d’imagerie en temps réel utilisant la microscopie confocale pour observer les cellules se déplaçant vers le tissu endommagé par incubation ex vivo avec l’épithélium cochléaire contenant l’organe de Corti.

Imagerie in vitro de cellules vivantes en accéléré pour explorer la migration cellulaire vers l’organe de Corti

Un protocole pour le traitement des cochlées de gerbilles jeunes adultes et âgées par immunomarquage des structures synaptiques afférentes et des cellules ciliées, extinction de l’autofluorescence dans les tissus âgés, dissection et estimation de la longueur des cochlées et quantification des synapses dans des piles d’images obtenues par imagerie confocale est présenté.

Immunoétiquetage et comptage des synapses rubanées chez les cochlées de gerbille jeunes adultes et âgées

Ici, nous présentons un protocole pour un modèle murin de perte auditive induite par le bruit (NIHL). Pour induire le NIHL, nous avons développé un nouveau dispositif simple utilisant du plastique ondulé, une cage de piège à rats et un haut-parleur. La réponse auditive du tronc cérébral et l’imagerie par immunofluorescence ont été utilisées pour évaluer la fonction auditive et les dommages aux cellules ciliées externes, respectivement.

Conditions expérimentales modifiées pour la perte auditive induite par le bruit chez la souris et évaluation de la fonction auditive et des lésions des cellules ciliées externes

Un microscope à feuille de lumière a été développé pour imager et numériser la cochlée entière.

Imagerie de la cochlée vieillissante avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière

La strie vasculaire est vitale pour la génération du potentiel endocochléaire. Ici, nous présentons la dissection de la strie vasculaire de la souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage.

Dissection de la strie vasculaire de souris adulte pour le séquençage mononucléaire ou l’immunomarquage

Ce protocole, destiné aux utilisateurs novices de tissu de l’oreille interne de souris, détaille de manière exhaustive les étapes de traitement des oreilles internes de souris à différents stades de développement pour l’immunomarquage en section.

Cryosectionnement et immunomarquage du tissu de l’oreille interne de souris : du stade embryonnaire au stade adulte

Apprenez la dissection en montage entier et l'immunofluorescence de la cochlée de souris adultes. Cette méthode préserve la structure tridimensionnelle de l'organe de Corti et permet la visualisation détaillée des cellules ciliées et des cellules de soutien par microscopie confocale.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

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