Name: Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Apprenez la dissection en montage entier et l'immunofluorescence de la cochlée de souris adultes. Cette méthode préserve la structure tridimensionnelle de l'organe de Corti et permet la visualisation détaillée des cellules ciliées et des cellules de soutien par microscopie confocale.

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Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de l’Office of Naval Research (N000141310569). L’équipement de l’installation d’imagerie de recherche de la Southern Illinois University School of Medicine a été soutenu par le National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l&#39;Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité à l&#39;École de médecine de l&#39;Université Southern Illinois. 1. Extraction des temporelles Bones <ol><li> Identifier les os temporaux dans la base du crâne de la souris 13 et gratter les nerfs crâniens aide de pinces de modèle standard. </li><li> Placez la pince de modèle standard à la pointe de la capsule otique et avec le pouce de la presse à main opposée sur le canal semi-circulaire postérieur pour déloger la cochlée encapsulé. </li><li> Libérez la moitié inférieure de l&#39;os temporal du crâne manuellement avec le pouce et l&#39;index ou en utilisant 10,5 cm de ciseaux fins. </li></ol> 2. Post-temporelles fixer Bones <ol><li> Placer os temporal dans 2 ml contenant des tubes de microcentrifugation de 250 à 500 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) dilué dans 10 mM de tampon phosphate salin (PBS) de pH 7,4 et Incubmangé à RT pour les 2 - 20 heures. NOTE: Aucune ouverture de la coiffe apicale ou l&#39;injection de PFA dans la ronde ou fenêtre ovale est nécessaire. Recommander utilisant du méthanol libre, ultra-pure, la microscopie électronique (EM) de grade PFA qui peuvent être achetés à une concentration de 16% dans des flacons de verre. Une fois que le flacon est ouvert et dilué à 1: 4 dans du PBS, en faisant une solution à 4%, il peut être utilisé pour 2 semaines lors d&#39;un stockage à 4 ° C (Certains anticorps nécessitent court fixation et d&#39;autres peuvent tolérer O / N (O / N) de fixation). </li></ol> 3. détartrer temporelles Bones <ol><li> Après fixation, retirez PFA aide d&#39;une pipette et le remplacer avec de l&#39;acide 120 mM éthylènediaminetétraacétique (EDTA), un peu plus de 2 ml. Assurez-vous de remplir la totalité de microtube de 2 ml pour éviter les bulles d&#39;air lorsque le tube est fermé. <ol><li> Si non détartrage immédiatement, replacez PFA avec PBS 10 mM pH 7,4 et stocker des échantillons à 4 o C. NOTE: Après fixation, os temporaux peuvent être stockés pendant variabLe élève de temps avant la décalcification selon les antigènes en cours d&#39;examen. </li></ol></li><li> Placer les tubes sur la fin-sur-end rotateurs et tournent à 4 min à température ambiante. Changer solution d&#39;EDTA quotidiennement à l&#39;aide d&#39;une pipette. Durée de décalcification dépend de l&#39;âge de l&#39;échantillon et la préférence du scientifique faisant la dissection. <ol><li> Incuber os temporaux en EDTA utilisant les directives suivantes pour les durées d&#39;incubation: Pour les échantillons postnatale jour (P) 8 à P15: 2 - 4 h; Pour les échantillons P15 à P21: O / N; Pour les échantillons P21 à P30: 2 O / N; Pour les échantillons de plus de P30: 3 ou plus O / N. Remarque: Les temps de décalcification sont soumis à la préférence des utilisateurs et peuvent être prolongés si nécessaire. Temps de décalcification peut être réduite par modification de la solution d&#39;EDTA deux fois par jour, environ 8 heures d&#39;intervalle. Certains laboratoires ajouter 1% de PFA à la solution d&#39;EDTA un détartrage pendant plus de 3 jours pour éviter la contamination. </li></ol></li><li> Pour déterminer si l&#39;échantillon est suffisamment détartrer, placez os temporaux ona silicium enduit d&#39;élastomère plat de dissection et appuyez doucement forceps sur la cochlée forme d&#39;escargot. Si le tissu est spongieuse, puis décalcification est terminée. </li><li> Une fois décalcification est terminée, retirez EDTA aide d&#39;une pipette et ajouter 500 -1 000 pi de PBS 10 mM pH 7,4. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu&#39;au moment de disséquer. </li></ol> 4. Créer un élastomère de silicone revêtu Dish Dissection <ol><li> Mélanger la base et le durcisseur d&#39;un kit d&#39;encapsulation d&#39;élastomère de silicone selon les instructions du fabricant et bien mélanger. </li><li> Ajouter environ 2 - 3 cuillères à soupe de poudre de charbon jusqu&#39;à ce que la solution est noir et bien mélanger. REMARQUE: Encre liquide ou de charbon liquide ne se mélangent pas avec la solution et ne peuvent pas être utilisés. Kits élastomère d&#39;encapsulation en silicone peuvent être achetés en noir, ce qui permet à l&#39;étape 4.2 être omis. </li><li> Versez la solution dans 60 mm de verre ou des boîtes de Petri en plastique, suffisamment copieux pour recouvrir le fond. Si bubbles sont présents, gonflent avec de l&#39;air à la surface. Laisser reposer au moins 24 heures à la température ambiante à définir. REMARQUE: plats enduits d&#39;élastomère de silicone peuvent être utilisés de façon répétée pendant des années. Cependant, ne pas utiliser l&#39;éthanol pour le nettoyage, car cela provoquerait l&#39;élastomère de silicone à se fissurer. </li></ol> 5. Mont entiers Dissection de la cochlée (pour P7 et anciens échantillons) <ol><li> Séparer le tour basal de tours moyen / apical <ol><li> Placez un os temporal adoucie dans un plat de dissection élastomère de silicone revêtu rempli aux deux tiers avec du PBS 10 mM pH 7,4 et utiliser un microscope de dissection stéréo pour les étapes suivantes. </li><li> Tenir l&#39;os temporal dans la région vestibulaire avec n ° 4 ou n ° 5 des pinces de bijoutier droite et en utilisant 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, couper l&#39;excédent de tissu de la capsule otique sur les côtés et au-dessus de l&#39;apex. </li><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, insérer une lame dans la fenêtre ovale et de faire plusieurs petites coupures le long de la spirale ligament / latéraleparoi de la tour basal. </li><li> Utilisation de 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, insérer une lame dans la région il suffit de couper et placer l&#39;autre lame à l&#39;extérieur de l&#39;os temporal, en dedans de la fenêtre ovale. Cette coupe sépare le tour basal de virages moyens et apical. </li></ol></li><li> Dissection complète du tour basal. <ol><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, couper les fibres nerveuses du ganglion spiral qui se connectent à l&#39;modiolus pour relâcher la tension dans la tour basal et couper en dessous de la tour basal de se séparer de organes vestibulaires. </li><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, faire une série de petites coupures pour supprimer le / paroi latérale spirale ligament du dessus et en dessous l&#39;organe de Corti. Utilisez # 4 ou # 5 pince de bijoutier droite pour guider le tissu. Epingler les fibres nerveuses ganglionnaires spirale vers le plat de dissection d&#39;enduit d&#39;élastomère de silicone, mais ne tenez pas sur cette région que le tissu se déchire. </li><li> Au cours des étapes précédentes, une partie de la Membran de Reissnere va souvent être retiré. Si tout reste encore, saisir la membrane de Reissner avec une pince de n ° 4 ou n ° 5 droite bijoutier et se détache de l&#39;organe de Corti. NOTE: La membrane de Corti est rarement visible et flotte généralement distance sans nécessiter une étape spécifique pour l&#39;enlèvement. </li><li> Faire Enfin plusieurs coupes de réduire l&#39;épaisseur des axones du ganglion spiral, pour faire le tour le plus plat possible et utiliser n ° 4 ou n ° 5 des pinces de bijoutier droit de transférer le tour basal disséqué, en saisissant les axones restants du ganglion spiral, à une plaque de 48 puits (ou lame de chambre) contenant ~ 500 pi de PBS 10 mM pH 7,4. </li></ol></li><li> Moyen séparée et tours apical <ol><li> Placez les deux-tiers restants de la cochlée, côté apical vers le bas. </li><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, insérer une lame dans les médias de Scala où le tour Moyen utilisé pour être connecté à la tour basal, et de faire plusieurs petites coupures le long de la paroi spirale ligament / latérale de ee spire médiane. </li><li> Utilisation de 5 mm Vannas-Tübingen ciseaux à ressort, insérer une lame dans la région il suffit de couper avec le tour Moyen placé sur le dessus de la lame, et placer l&#39;autre lame à l&#39;extérieur du labyrinthe osseux, à un angle de la pointe apicale 90 o. Cela sépare le tour du milieu de la tour apicale. </li></ol></li><li> Dissection complète du tour milieu d&#39;une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4). </li><li> Dissection complète du tour apicale. <ol><li> Utilisation de 2,5 mm Vannas ciseaux à ressort, ouvrir le capuchon qui couvre le tour apicale. Dissection complète d&#39;une manière similaire à la tour basal (voir les étapes 5.2.2 à 5.2.4). NOTE: disséqué tours cochléaires peuvent être stockés dans PBS 10 mM pH 7,4 dans une plaque de 48 puits (ou lame de chambre) à 4 o C pendant plusieurs semaines avant immunocoloration. Cependant PBS s&#39;évaporer et doit être réapprovisionné périodiquement et le stockage de plus de 2 - 3 semaines peut conduire à la croissance bactérienne ou fongique sur latissu qui peut diminuer la qualité de l&#39;image. Nous recommandons un stockage à long terme des échantillons que os temporaux undissected. </li></ol></li></ol> 6. Immunocoloration avec par fluorescence Tagged Anticorps <ol><li> Après la dissection, stocker chaque tour cochléaire dans un puits séparé dans une plaque de 48 puits (ou lame de chambre), immergé dans ~ 500 pi de PBS 10 mM pH 7,4. Pour chacune des étapes suivantes de la tour cochléaire doit être immergé dans un liquide, non flottant au-dessus ou collé sur le côté du puits. REMARQUE: Lors du retrait de liquide de chaque puits, il est facile de perdre les tours cochléaires ou sucer dans la pointe de la pipette. Modification de solutions avec une pointe de pipette 200 pi en utilisant un champ de dissection aidera à prévenir cela. </li><li> En utilisant une pipette, retirer PBS de chaque puits et le remplacer par ~ 200 - 300 pi par puits de bloquer / solution de perméabilisation (1% de Triton X-100, 1% de sérum albumine bovine (BSA), et 10% de sérum de chèvre normal (NGS) dilué dans 10 mM de PBS pH 7,4). Incuber 1 heure à température ambiante sur un rotateur 3D. NOTE: Si un anticorps primaire utilisé a été faite dans un hôte de chèvre, puis un anticorps secondaire anti-chèvre sera nécessaire et NGS ne doit PAS être utilisé pour toutes les étapes. De sérum de cheval normal peut être utilisé comme un remplacement pour NGS. </li><li> Retirer la solution de blocage / de perméabilisation en utilisant une pipette et le remplacer par ~ 100 pi par puits de solution d&#39;anticorps primaire (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, 5% de NGS et diluées dans du PBS 10 mM pH 7,4). Le facteur de dilution pour chaque anticorps primaire varie. Incuber O / N (minimum 14 heures) à 4 ° C sur un agitateur 3D. NOTE: Si plus d&#39;un anticorps primaire est utilisé, tous peuvent être combinés dans la même solution pour l&#39;incubation, assurez-vous que chaque anticorps primaire a un hôte différent. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps primaire à l&#39;aide d&#39;une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 ul par puits. Chaque lavage couve un minimum de 5 min à température ambiante sur un rotateur 3D. </li><li> Retirer P dernièreBS laver avec une pipette et le remplacer avec ~ 100 pi par puits d&#39;une solution d&#39;anticorps secondaire (0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, et 5% NGS dilué dans 10 mM PBS pH 7,4). Le facteur de dilution pour chaque étiqueté par fluorescence anticorps secondaire est habituellement de 1: 500 ou 1: 1000. Placez la plaque de 48 puits dans une boîte noire pour protéger fluorescence marqués Anticorps secondaires de la lumière. Incuber 2 - 3 heures à température ambiante sur un rotateur 3D. REMARQUE: si plus d&#39;un anticorps secondaire est nécessaire, ils peuvent être combinés dans la même solution pendant l&#39;incubation. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de possibilité de contre-étiquetage (par ex., En utilisant chèvre anti-lapin et de poulet anti-chèvre Anticorps secondaires) </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps secondaire à l&#39;aide d&#39;une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 pi par puits. Incuber chaque lavage pendant au moins 5 min à température ambiante sur un agitateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Retirez dernier lavage PBS aide d&#39;une pipette et le remplacer par ~ 100 pi par puits de HoecTVH 33342 (dilué 1: 2000 dans PBS 10 mM pH 7,4) pour marquer les noyaux. Incuber 15 - 20 min à température ambiante sur un rotateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l&#39;abri de la lumière. Ne pas incuber plus de 20 minutes. </li><li> Retirer solution Hoechst aide d&#39;une pipette et effectuer 3 lavages de PBS 10 mM pH 7,4 à ~ 500 pi par puits. Incuber chaque lavage pendant au moins 5 min à température ambiante sur un agitateur 3D. Gardez plaque de 48 puits dans une boîte noire à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Toutes les étapes peuvent être prolongés, sauf Hoechst incubation, de plusieurs heures si nécessaire. Pour interrompre la réaction à tout moment, simplement plonger échantillons dans ~ 500 ul de 10 mM PBS pH 7,4 et stocker la plaque 48 eh bien (ou chambre lame) à 4 o C jusqu&#39;au moment de reprendre les heures de protocole ou 1 - 2 jours plus tard . </li></ol> 7. Mont Cochlear Active Diapositives <ol><li> Étiquette glisse avec des informations pertinentes sur l&#39;échantillon et les anticorps utilisés. </li><li> Pipette ~ 50 pi de milieu de montage sur chaque diapositive et soyez prudentpour éviter que des bulles. Centrifuger le tube contenant les milieux de montage pour éliminer les bulles. </li><li> Utilisation # 4 ou pince de # 5 droite bijoutier, saisir les axones du ganglion spiral de transférer en douceur un tour cochléaire de la plaque de 48 puits à la diapositive et le lieu dans les milieux de montage. Montez un tour cochléaire par diapositive pour éviter exposition à la lumière et photoblanchiment pendant le processus d&#39;imagerie. </li><li> Utiliser un microscope de dissection stéréo pour assurer ce tour cochléaire soit pas plié, tordu, ou près d&#39;une bulle d&#39;air. Si l&#39;une de ces situations se produit, les pinces d&#39;utilisation n ° 4 ou n ° 5 droite bijoutier pour repositionner le tour cochléaire. </li><li> Placez une extrémité d&#39;une lamelle sur la lame et relâchez doucement pour laisser la chute de lamelle. </li><li> Utilisez une dissection microscope stéréo pour garantir que le tour cochléaire soit pas plié, tordu, ou près d&#39;une bulle d&#39;air. Si l&#39;une de ces situations se produit, déplacez doucement la lamelle d&#39;avant en arrière pour repositionner le tour cochléaire. </li><li> Placer les lamesdans un dossier de diapositives afin qu&#39;ils reposent à plat. Laissez montage remède médias O / N à température ambiante (garder dans l&#39;obscurité) </li><li> Des lamelles de sceller avec vernis transparent de l&#39;ongle et stocker à température ambiante ou à -20 ° C jusqu&#39;à ce imagés. Les diapositives peuvent être stockées dans un dossier de diapositives ou boîte de diapositive. REMARQUE: Les diapositives peuvent être stockées à long terme à -20 ° C ou -80 ° C et la fluorescence sera maintenu pendant plusieurs mois. </li><li> Glisse image en utilisant un microscope confocal à la longueur d&#39;onde appropriée sur la base des anticorps secondaires utilisés durant la procédure d&#39;immuno-coloration. Réglage de la luminosité et de contraste peuvent être effectuées en utilisant le logiciel d&#39;imagerie fournie par le fournisseur confocale. </li></ol>

<ol><li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li>
<li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li>
<li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+damage+in+the+C57BL%2FCBA+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li>
<li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstrom%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti.+A+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist and Wiksell. (1966).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells%3A+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442(2011).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohne%2C+BA+%22Handbook+of+Mouse+Auditory+Research%22">Handbook of Mouse Auditory Research</a>. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).</li>
<li>Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/">http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/</a> (2015).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li>
<li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters%27+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth%2C+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li>
<li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome%3A+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

<html> Il ya plusieurs étapes cruciales pour la réussite de toute la dissection de montage et immunologique. Cependant, avant l&#39;une de ces méthodes sont exécutées, fixation appropriée du tissu cochléaire est nécessaire. Nous vous recommandons d&#39;utiliser le méthanol libre, ultra-pure, de qualité EM PFA. PFA fait à partir de poudre peut avoir des traces de méthanol et un pH instable qui diminue la qualité de l&#39;immunofluorescence. D&#39;autres groupes ont également montré que les dissections similaires sont poss...

La cochlée en forme de spirale de l&#39;oreille interne, contenue dans l&#39;os temporal, abrite l&#39;organe de Corti, la sensibilité auditive organe final chez les mammifères. La cochlée est tonotopically organisé et souvent divisé en apicale, un milieu et basale tours correspondant à différentes régions de fréquence avec détection de son à haute fréquence dans la base et la détection de basse fréquence dans l&#39;apex 1. Les cellules ciliées, les cellules mécano de l&#39;organe de Corti, courent tout le long de la cochlée, qui est d&#39;environ 6 mm de long chez la souris 2,3. Ces cellules convertissent l&#39;énergie mécanique des ondes sonores, qui sont transmis à travers le labyrinthe membraneux rempli de fluide, en des signaux neuronaux qui sont traitées par les structures auditives centrales. La technique décrite ici concerne un procédé pour la préparation de supports entiers de l&#39;organe de Corti après calcification de la cochlée est complète (pour les échantillons allant de 1 semaine d&#39;âge et l&#39;âge adulte). Nous présentons également une méthode pour immunostaining le tout monté tissus cochléaire. Montures entières cochléaires sont cruciales pour la visualisation de toutes les cellules de cheveux et entourant les cellules de soutien dans leurs arrangements spatiaux naturelles et permettent l&#39;analyse en trois dimensions avec l&#39;utilisation de la microscopie confocale. Drs. Hans Engstrom et Harlow Ades décrits à l&#39;origine un ensemble de monter méthode de dissection cochléaire en 1966. Ils ont décrit une technique pour fixer rapidement et disséquer cochleae calcifiée immergée dans un liquide à partir d&#39;une variété de mammifères, la préservation de courts segments intacts de l&#39;organe de Corti pour analyse microscopique 4. La dissection, une cochlée de rat calcifiée non fixée a également été illustré dans une vidéo d&#39;instruction 5. Drs. Barbara Bohne et Gary Harding à l&#39;Université de Washington ont fait plusieurs modifications importantes à cette méthode. Dans leur version de la méthode de montage toute cochléaire, l&#39;os temporal était adoucie, noyée dans le plastique, et cinq demi-tours ou dix quarts de tours étaient dissectionTed 6,7. Dr Charles Liberman et ses collègues de Eaton Peabody laboratoires, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiés cette technique afin que le plastique intégration n&#39;a pas été nécessaire 8. Une modification supplémentaire de la technique a eu lieu dans le laboratoire du Dr Jian Zuo recherche de l&#39;Hôpital pour enfants St. Jude 9-12 qui a informé la méthode de dissection présenté ici. On utilise une stratégie différente pour avoir accès à l&#39;organe de Corti et que Bohne Liberman, ce qui permet l&#39;isolement de toutes les apical, au milieu et à tour de rôle de base. Ainsi le tissu disséqué est plus grande et moins susceptibles d&#39;être perdus ou endommagés pendant les processus de dissection ou immunocoloration. De plus, le procédé actuel facilite la mesure de la distance à partir de l&#39;extrémité apicale ou basale crochet pour identifier une région de fréquence. Bien que de nombreux laboratoires effectuent un marquage de tissu cochléaire, on ne sait pas où cette méthode est originaire. En conséquence, il existe plusieurs recettes pour bloquer Buffers et incubation des anticorps tampons qui peuvent affecter la performance des anticorps primaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence qui est applicable à des anticorps les plus couramment utilisés dans le domaine auditif. La forme complexe de la cochlée, la structure délicate de l&#39;organe de Corti, et enrobage osseuse constituent un défi pour l&#39;analyse histologique et biochimique. Une variété de techniques sont actuellement utilisés dans le domaine de l&#39;audition de surmonter ces caractéristiques difficiles et visualiser les cellules à l&#39;intérieur de l&#39;organe de Corti, chaque technique avec ses propres avantages et inconvénients. Le protocole présenté ici permet pour toute la dissection de montage de la cochlée de souris adulte et, avec une légère modification, peut potentiellement être utilisé pour examiner les structures critiques au sein de la cochlée d&#39;une variété d&#39;autres organismes modèles utilisés dans le domaine.

<table><tbody><tr><td>Pince à motif standard</td><td>Les outils de science fine</td><td>11000-12</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Ciseaux fins de 10,5 cm</td><td>Outils de science fine</td><td>14060-11</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 2 ml</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs 16</td></tr><tr><td> % de formaldéhyde, sans méthanol, ultra pur, grade</td><td>EM Polysciences</td><td>18814</td><td>TOXIQUE --Portez des gants et ne pouvez pas être jeté dans l’évier. Peut être acheté auprès d’autres vendeurs.&nbsp ;</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP118-500</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Rotateur de tube bout à bout</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Boîte de</td></tr><tr><td>Pétri de 60 mm</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Kit d’encapsulation</td></tr><tr><td>en silicone Dow Corning Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr>charbon<td>actif</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr> microscope à <tr><td>dissection stéréo</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Dumont #4 pince de bijoutier</td><td>Outils de science fine</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pince de bijoutier</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas de 2,5 mm</td><td>Outils de science fine</td><td>15001-08</td><td>courbés.</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Vannas-Tübingen de 5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>plaques droites</td></tr><tr>à<td>48 puits</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Diapositives à chambre à 8 puits</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>BSA, fraction V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Rotateur 3D</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Boîte d’incubation Western blot XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Les</td></tr><tr><td>supports de montage anti-effacement Prolong gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>peuvent être achetés auprès d’autres fournisseurs, mais les supports de montage varient dans leur capacité à protéger contre le photoblanchiment</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs lamelles de</td></tr><tr><td>protection 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs vernis à</td></tr><tr><td>ongles transparent</td><td>Drugstore</td><td></td><td>local peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Chemise à</td></tr><tr><td>lames en carton</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>peut être achetée auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Boîte à lames en plastique</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>peut être achetée auprès d’autres fournisseurs</td></tr></tbody></table>

mont entiers dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

L’organe de Corti, logé dans la cochlée de l’oreille interne, contient des cellules ciliées mécanosensorielles et des cellules de soutien environnantes qui sont organisées en forme de spirale et ont un gradient tonotopique pour la détection des sons. La cochlée de la souris mesure environ 6 mm de long et est souvent divisée en trois tours (apex, milieu et base) pour l’analyse. Pour étudier la perte cellulaire, la division cellulaire ou l’expression génique en mosaïque, l’ensemble du montage ou de la préparation de surface de la cochlée est utile. Cette méthode de dissection permet de visualiser toutes les cellules de l’organe de Corti lorsqu’elle est combinée à l’immunomarquage et à la microscopie confocale pour imager les cellules à différents plans de l’axe z. Plusieurs sections efficaces optiques peuvent également être obtenues à partir de ces images de la pile z. De plus, la méthode de dissection complète peut être utilisée pour la microscopie électronique à balayage, bien qu’une méthode de fixation différente soit nécessaire. Ici, nous présentons une méthode pour isoler l’organe de Corti en trois tours cochléaires intacts (apex, milieu et base). Cette méthode peut être utilisée pour des souris âgées d’une semaine à l’âge adulte et diffère de la technique utilisée pour les échantillons néonatals où la calcification de la cochlée est incomplète. Une version légèrement modifiée peut être utilisée pour la dissection de la cochlée du rat. Nous faisons également la démonstration d’une procédure d’immunomarquage avec des anticorps marqués par fluorescence.

Nous présentons une méthode pour isoler l&#39;organe de Corti que trois tours intactes cochléaires (de sommet, milieu, et la base) à partir de tissu cochléaire qui est calcifiée, avec des étapes de dissection clés présentés dans la figure 1. Pendant la première semaine postnatale du développement, la calcification de la cochlée de souris est incomplète et une méthode de dissection plus simple peut être utilisé 13. En utilisant la méthode de di...

Nous présentons une méthode pour isoler l&#39;organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l&#39;étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d&#39;autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

L'objectif général de cette méthode de dissection en montage entier est d'isoler la région sensorielle du limaçon adulte calcifié en trois tours intacts : l'apex, le milieu et la base. Cette méthode de dissection préserve la structure tridimensionnelle de l'organe de Corti et permet la visualisation de toutes les cellules lorsqu'elle est combinée à une immunomarquage et à une microscopie confocale pour l'imagerie sur différents plans selon l'axe Z. Par rapport aux méthodes de dissection précédentes, nous utilisons une stratégie différente qui produit trois tours cochléaires plus grands et moins sujets à être perdus ou endommagés lors du processus d'immunomarquage.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la dissection est difficile à apprendre. Étant donné que l'organe de Corti est fragile, la marge d'erreur lors du retrait du ligament spiral est très faible. Après avoir euthanasié l'animal selon les procédures approuvées et retiré le cerveau, commencez par identifier les os temporaires à la base du crâne de la souris.Ensuite, retirez les nerfs crâniens à l’aide de pinces de type standard. Placez les pinces à l’extrémité de la capsule otique et utilisez le pouce de l’autre main pour appuyer sur le canal semi-circulaire postérieur afin de déloger la cochlée encapsulée. Détachez la moitié inférieure de l’os temporal du crâne soit manuellement avec le pouce et l’index, soit à l’aide de ciseaux fins de 10,5 centimètres, puis placez-la dans du paraformaldéhyde à 4 %, de qualité microscopie électronique, sans méthanol, pour la fixation.Après la fixation, décalcifier les os temporaux conformément aux instructions figurant dans la partie écrite du protocole. Pour déterminer si l'échantillon est suffisamment décalcifié, placer les os temporaux sur un plat de dissection recouvert d'un élastomère de silicone et appuyer doucement avec une pince sur la cochlée en forme d'escargot. Si le tissu est spongieux, la décalcification est terminée.Ajouter du PBS dans la boîte de dissection, puis, sous un microscope stéréo, utiliser une pince n°4 ou n°5 pour maintenir l’os temporal dans la région vestibulaire et des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen de 5 millilitres pour découper les tissus excédentaires de la capsule otique sur les côtés et au-dessus de l’apex. À l’aide de ciseaux à ressort Vannas de 2,5 millilitres, insérer une lame dans la fenêtre ovale et effectuer plusieurs petites incisions le long du ligament spiral du tour basal. Ensuite, insérer une lame des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen de 5 millilitres dans la région précédemment incisée, et placer l’autre lame à l’extérieur de l’os temporal, en position médiale par rapport à la fenêtre ovale.Cette incision sépare le tour basal des tours moyen et apical. Ensuite, pour terminer la dissection du tour basal, utilisez des ciseaux à ressort de 2,5 millilitres afin de couper les fibres nerveuses du ganglion spiral qui se connectent au modiolus, ce qui permet de relâcher la tension dans le tour basal. Effectuez une incision sous le tour basal pour le séparer des organes vestibulaires.Utilisez une pince pour guider le tissu et fixer les fibres du ganglion spiral sur la boîte recouverte d'élastomère de silicone. Effectuez une série de petites incisions pour retirer le ligament spiral au-dessus et au-dessous de l'organe de Corti. Une fois les fibres du ganglion spiral fixées sur la boîte recouverte d'élastomère de silicone, utilisez la pince pour retirer toute membrane de Reissner résiduelle de l'organe de Corti.Effectuez plusieurs incisions pour réduire l'épaisseur des axones du ganglion spiral. Ensuite, saisissez les axones restants du ganglion spiral avec une pince et transférez le tour basal disséqué dans une plaque de 48 puits contenant environ 500 microlitres de PBS. Séparez maintenant les tours moyen et apical en plaçant d'abord les deux tiers restants de la cochlée, côté apical vers le bas.Insérez ensuite une lame des ciseaux de 2,5 millilitres dans la scala media, là où le tour moyen était précédemment relié au tour basal, et effectuez plusieurs incisions le long du ligament spiral du tour moyen. À l’aide des ciseaux de 5 millilitres, insérez une lame dans la zone incisée, le tour moyen étant placé au-dessus de la lame. Placez l’autre lame à l’extérieur du labyrinthe osseux, à un angle de 90 degrés par rapport à l’extrémité apicale.Cette incision sépare le tour médian du tour apical. Ensuite, terminez la dissection du tour médian en retirant le ligament spiral de l'organe de Corti. Transférez le tour disséqué dans une plaque de 48 puits, comme précédemment.Utilisez maintenant des ciseaux à ressort Vannas de 2,5 millilitres pour ouvrir le capuchon recouvrant le limbe apical, puis répétez la procédure afin d'extraire le ligament spiral du tour apical de l'organe de Corti. Transférez le tour disséqué dans une plaque de 48 puits, comme précédemment. Pour commencer la procédure d'immunomarquage, aspirez d'abord le PBS de chaque puits, puis remplacez-le par 200 à 300 microlitres de solution de blocage et incubez pendant une heure à température ambiante sur un rotateur 3D.Une fois le temps d'incubation écoulé, retirez la solution de blocage et remplacez-la par 100 microlitres d'anticorps primaire, dilué de façon appropriée dans la solution porteuse. Incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un rotateur 3D. Le jour suivant, retirez la solution d'anticorps primaire et lavez chaque puits avec 500 microlitres de PBS pendant au moins cinq minutes à chaque fois, à température ambiante.Répétez le lavage deux fois. Après le dernier lavage, aspirez le PBS en prenant soin de ne pas aspirer le tissu disséqué dans l’embout de pipette. Remplacez par 100 microliters par puits d’anticorps secondaire marqué par un fluorochrome, dilué dans la solution porteuse.Placer la plaque de 48 puits dans une boîte noire pour la protéger de la lumière, puis la mettre sur le rotateur 3D pour une incubation de deux à trois heures à température ambiante. Après l'incubation, aspirer la solution d'anticorps secondaire et laver trois fois avec du PBS comme précédemment. Après avoir éliminé le dernier lavage, ajouter 100 microlitres de Hoechst pour marquer les noyaux.Protéger de la lumière et incuber de 15 à 20 minutes à température ambiante sur un rotateur 3D. Enfin, éliminer la solution de Hoechst et rincer trois fois avec du PBS comme précédemment. Après marquage de chaque lame, déposer 50 microlitres de milieu de montage sur chaque lame à l’aide d’une pipette.Ensuite, à l’aide d’une pince droite de bijoutier de taille quatre ou cinq, saisissez les axones du ganglion spiral et transférez délicatement un tour de la cochlée de la plaque 48 puits vers le milieu de montage. Utilisez le microscope pour vous assurer que le tour disséqué n’est ni plié ni tordu. Placez une extrémité d’une lame couvre-objet sur une lame porte-objet, puis relâchez doucement pour laisser la lame couvre-objet tomber en place.Utilisez un microscope stéréo pour vous assurer que le tour cochléaire ne se trouve pas à proximité d'une bulle d'air. Si tel est le cas, déplacez doucement la lame couvre-objet d'avant en arrière afin de repositionner le tour cochléaire. Répétez la procédure pour les autres tours cochléaires.Montez un tour de la cochlée par lame afin d'éviter l'exposition à la lumière et le photoblanchiment pendant le processus d'acquisition d'images. Placez les lames dans une pochette à lames de manière à ce qu'elles reposent à plat. Protégez-les de la lumière et laissez le milieu de montage polymériser toute la nuit à température ambiante.Le lendemain, scellez les lamelles avec du vernis incolore et conservez-les à température ambiante ou à 20 degrés Celsius jusqu'à l'acquisition des images. Cette image en coupe confocale montre le tour médian de l'oreille interne isolé d'une souris p15. Des images à 420X ont été superposées pour reconstruire l'ensemble du tour médian.Les cellules ciliées, marquées avec un anticorps primaire de lapin anti-myosine VIIa et un anticorps secondaire conjugué à l’Alexa 647, apparaissent en magenta. Les cellules de soutien, marquées avec un anticorps primaire de chèvre anti-SOX2 et un anticorps secondaire conjugué à l’Alexa 568, apparaissent en vert. Les noyaux apparaissent en bleu en raison de la coloration au Hoechst.La barre d'échelle représente 100 microns. Cette image montre une coupe optique du tour médian isolé d'une souris âgée de six semaines, dans le plan X, Z. Là encore, les cellules ciliées sont marquées avec un fluorophore magenta et les cellules de soutien avec un fluorophore apparaissant en vert.Il s'agit d'une augmentation du grossissement de l'image précédente, les réticules ayant été supprimés. La barre d'échelle représente 20 microns. Les quatre images suivantes montrent certains des problèmes pouvant survenir lors de la dissection en montage entier ou lors du positionnement des spires cochléaires sur des lames.Ici, sur le côté gauche de l'image, le tissu cochléaire a été coupé à côté de la dernière rangée de cellules ciliées externes, ce qui a entraîné que bon nombre de ces cellules soient montées selon des angles variés. Dans cette image, une section de l'organe de Corti située sur le côté gauche a été sectionnée. Un trou a été percé dans la région des cellules ciliées externes au milieu de l'image.Ici, l'organe de Corti est replié à plusieurs endroits. Une fois maîtrisée, la technique de dissection en montage complet peut être réalisée en 20 à 30 minutes. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important d'éviter de poser la pince sur l'organe de Corti et de ne pas tirer ni serrer le ligament spiral.Fermez plutôt la pince et fixez les fibres du ganglion spiral sur la boîte recouverte d'élastomère de silicone. Les échantillons provenant de souris âgées d'une à trois semaines sont plus tolérants et plus utiles pour apprendre la méthode de dissection. En outre, les échantillons présentant des lésions des cellules ciliées sont plus difficiles à disséquer, les tissus exposés au bruit étant particulièrement délicats et fragiles.Après cette procédure de dissection, d'autres méthodes, telles que la microscopie électronique à balayage, peuvent être réalisées. Toutefois, un fixateur différent est nécessaire. De plus, nous avons apporté de légères modifications à ce protocole pour la dissection de tissus cochléaires de rat, et à l'avenir, nous espérons l'adapter davantage à la dissection de la cochlée du chinchilla, du gerbille et du cobaye.

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