Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d'autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

L’objectif global de cette méthode de dissection de monture est d’isoler la région sensorielle de la cochlée adulte calcifiée en trois tours intacts : l’apex, le milieu et la base. Cette méthode de dissection préserve la structure tridimensionnelle de l’organe de Corti et permet de visualiser toutes les cellules lorsqu’elle est combinée à l’immunomarquage et à la microscopie confocale pour imager à différents plans de l’axe Z. Par rapport aux méthodes de dissection précédentes, nous utilisons une stratégie différente qui génère trois tours cochléaires plus grands et moins susceptibles d’être perdus ou endommagés dans le processus d’immunomarquage.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la dissection est difficile à apprendre. Parce que l’organe de Corti est fragile, il y a une petite marge d’erreur lors de l’ablation du ligament spiralé. Après avoir euthanasié l’animal selon les procédures approuvées et retiré le cerveau, commencez par identifier les os temporaux à la base du crâne de la souris.

Ensuite, grattez les nerfs crâniens à l’aide d’une pince à motif standard. Placez la pince à l’extrémité de la capsule otique et utilisez le pouce de la main opposée pour appuyer sur le canal semi-circulaire postérieur afin de déloger la cochlée encapsulée. Libérez la moitié inférieure de l’os temporal du crâne soit manuellement avec le pouce et l’index, soit à l’aide de ciseaux fins de 10,5 centimètres, et placez-le dans une microscopie électronique sans méthanol de grade 4 % de paraformaldéhyde pour fixer.

Après la fixation, détartrez les os temporaux selon les instructions de la partie écrite du protocole. Pour déterminer si l’échantillon est correctement décalcifié, placez les os temporaux sur une boîte de dissection recouverte de silicone-élastomère et appuyez doucement sur la pince sur la cochlée en forme d’escargot. Si le tissu est spongieux, la décalcification est complète.

Ajoutez du PBS dans la boîte de dissection, puis tout en travaillant sous un microscope de stéréodissection, utilisez la pince numéro quatre ou cinq pour maintenir l’os temporal dans la région vestibulaire et des ciseaux à ressort Vannas-Tubingen de cinq millilitres pour couper l’excès de tissu de la capsule otique sur les côtés et au-dessus de l’apex. À l’aide de ciseaux à ressort Vannas de 2,5 millilitres, insérez une lame dans la fenêtre ovale et faites plusieurs petites entailles le long du ligament en spirale de la tour basale. Maintenant, insérez une lame des ciseaux à ressort Vannas-Tübingen de cinq millilitres dans la région qui vient de être coupée, et placez l’autre lame à l’extérieur de l’os temporal, médialement à la fenêtre ovale.

Cette coupe sépare le tour basal des tours moyens et apicals. Ensuite, pour terminer la dissection de la spire basale, utilisez les ciseaux à ressort de 2,5 millilitres pour couper les fibres nerveuses ganglionnaires en spirale qui se connectent au modiolus pour relâcher la tension dans la spire basale. Coupez sous le tour basal pour vous séparer des organes vestibulaires.

Utilisez une pince pour guider le tissu et épingler les fibres ganglionnaires en spirale sur le plat recouvert de silicone-élastomère. Faites une série de petites incisions pour retirer le ligament spiralé au-dessus et en dessous de l’organe de Corti. Avec les fibres ganglionnaires en spirale épinglées à la boîte recouverte de silicone-élastomère, utilisez la pince pour retirer toute membrane de Reissner restante de l’organe de Corti.

Faites plusieurs coupes pour réduire l’épaisseur des axones des ganglions spiraux. Saisissez ensuite les axones restants du ganglion spiral à l’aide d’une pince et transférez le tour basal disséqué sur une plaque de 48 puits contenant environ 500 microlitres de PBS. Séparez maintenant les tours médian et apical en plaçant d’abord les deux tiers restants de la cochlée côté apical vers le bas.

Insérez ensuite une lame des ciseaux de 2,5 millilitres dans la rampe médiane, où le tour moyen était précédemment relié au tour basal, et faites plusieurs coupes le long du ligament en spirale du tour moyen. À l’aide des ciseaux de cinq millilitres, insérez une lame dans la zone de coupe, avec le tour du milieu placé sur le dessus de la lame. Placez l’autre lame à l’extérieur du labyrinthe osseux, à un angle de 90 degrés par rapport à l’extrémité apicale.

Cette coupe sépare le tour médian du tour apical. Ensuite, complétez la dissection du tour moyen en retirant le ligament spiralé de l’organe de Corti. Transférez le tour disséqué dans une plaque à 48 puits, comme précédemment.

Maintenant, utilisez des ciseaux à ressort Vannas de 2,5 millilitres pour ouvrir le capuchon qui recouvre le tour apical et répétez la procédure pour retirer le ligament spiralé du tour apical de l’organe de Corti. Transférez le tour disséqué dans une plaque à 48 puits, comme précédemment. Pour commencer la procédure d’immunomarquage, aspirez d’abord le PBS de chaque puits, puis remplacez-le par 200 à 300 microlitres de solution bloquante et incubez pendant une heure à température ambiante sur un rotateur 3D.

Une fois le temps d’incubation écoulé, retirer la solution bloquante et la remplacer par 100 microlitres d’anticorps primaires, dilués de manière appropriée dans une solution de support. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius sur un rotateur 3D. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaire et lavez chaque puits avec 500 microlitres de PBS pendant au moins cinq minutes à chaque fois, à température ambiante.

Répétez le lavage deux fois. Après le dernier lavage, aspirez le PBS et veillez à ne pas aspirer le tour disséqué dans la pointe de la pipette. Remplacer par 100 microlitres par puits d’anticorps secondaires marqués par fluorescence et dilués dans une solution de support.

Placez la plaque à 48 puits dans une boîte noire à l’abri de la lumière, et placez-la sur le rotateur 3D pour l’incuber pendant deux à trois heures à température ambiante. Après l’incubation, aspirez la solution d’anticorps secondaire et lavez-la trois fois avec du PBS comme précédemment. Après avoir retiré le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres de Hoechst pour étiqueter les noyaux.

A l’abri de la lumière et incuber 15 à 20 minutes à température ambiante sur un rotateur 3D. Enfin, retirez la solution Hoechst et lavez-la trois fois avec du PBS comme auparavant. Après avoir étiqueté chaque lame, pipetez 50 microlitres de support de montage sur chaque lame.

Ensuite, à l’aide de la pince de bijoutier droite numéro quatre ou numéro cinq, saisissez les axones du ganglion spiralé et transférez doucement un tour cochléaire de la plaque à 48 puits vers le support de montage. Utilisez le microscope pour vous assurer que le tour disséqué n’est pas plié ou tordu. Placez une extrémité d’une lamelle sur une glissière et relâchez-la doucement pour laisser tomber la lamelle.

Utilisez un microscope à stéréodissection pour vous assurer que le tour cochléaire n’est pas situé à proximité d’une bulle d’air. Si cela se produit, déplacez doucement la lamelle d’avant en arrière pour repositionner la rotation cochléaire. Répétez la procédure pour les autres tours cochléaires.

Montez un tour cochléaire par lame pour éviter l’exposition à la lumière et le blanchiment photo pendant le processus d’imagerie. Placez les diapositives dans un dossier de diapositives de manière à ce qu’elles soient à plat. Protéger de la lumière et laisser le support de montage durcir pendant la nuit à température ambiante.

Le lendemain, scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent et conservez-les à température ambiante ou à 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient imagés. Cette image en coupe confocale montre le tour médian cochléaire isolé d’une souris p15. Des images 420X ont été superposées pour reconstruire l’ensemble du tour central.

Les cellules ciliées, marquées avec un anticorps primaire anti-myosine VIIa de lapin et un anticorps secondaire conjugué à Alexa 647, apparaissent magenta. Les cellules de soutien, marquées avec un anticorps primaire anti-SOX2 de chèvre et un anticorps secondaire conjugué à Alexa 568, apparaissent en vert. Les noyaux apparaissent bleus en raison de la coloration de Hoechst.

La barre d’échelle représente 100 microns. Cette image montre une coupe transversale optique du tour central isolée d’une souris de six semaines dans le plan X, Z. Encore une fois, les cellules ciliées sont marquées avec un fluorophore magenta et les cellules de soutien avec un fluorophore qui apparaît vert.

Il s’agit d’un agrandissement accru de l’image précédente, avec le réticule supprimé. La barre d’échelle représente 20 microns. Les quatre images suivantes montrent certains des problèmes qui peuvent survenir lors de la dissection complète du support ou lors du montage cochléaire sur des lames.

Ici, sur le côté gauche de l’image, le tissu cochléaire a été coupé à côté de la dernière rangée de cellules ciliées externes, ce qui a entraîné le montage de nombreuses cellules à des angles variés. Sur cette image, une section de l’organe de Corti du côté gauche a été coupée. Il y a un trou percé dans la région externe des cellules ciliées au milieu de l’image.

Ici, l’organe de Corti est plié en plusieurs endroits. Une fois maîtrisée, l’ensemble de la technique de dissection de montage peut être réalisée en 20 à 30 minutes. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important d’éviter de placer la pince sur l’organe de Corti et d’éviter de tirer ou de saisir le ligament spiralé.

Au lieu de cela, fermez la pince et épinglez les fibres ganglionnaires en spirale dans le plat recouvert de silicone-élastomère. Les échantillons de souris âgées d’un à trois semaines sont plus indulgents et utiles pour apprendre la méthode de dissection. De plus, les échantillons présentant des lésions des cellules ciliées sont plus difficiles à disséquer, les tissus exposés au bruit étant particulièrement difficiles et fragiles.

Suite à cette procédure de dissection, d’autres méthodes, telles que la microscopie électronique à balayage, peuvent être effectuées. Cependant, un fixateur différent est nécessaire. De plus, nous avons apporté de légères modifications à ce protocole pour la dissection du tissu cochléaire du rat, et à l’avenir, nous espérons le faire davantage pour la dissection de la cochlée du chinchilla, de la gerbille et du cobaye.