Name: Au-Interaction des SLP1 Polymères et monocouche de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS et lAFM comme outils pour les études de biomolécules-métalliques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Découvrez l'étude de la sorption de l'or par les protéines S-layer de Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Cette méthode utilise QCM-D, ICP-MS et AFM pour analyser les interactions biomolécules-métalliques en temps réel.

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Le présent travail a été partiellement financé par l&#39;IGF-projet &quot;S-Sieve&quot; (490 ZBG / 1) financé par l&#39;BMWi et le BMBF-projet &quot;Aptasens&quot; (BMBF / DLR 01RB0805A). Un merci spécial à Tobias J. Günther pour son aide précieuse pendant les études de l&#39;AFM et à Erik V. Johnstone pour lire le manuscrit comme une langue maternelle anglaise. En outre, l&#39;auteur de cet article tient à remercier Aline Ritter et Sabrina Gurlit (de l&#39;Institut pour l&#39;écologie des ressources de l&#39;aide pour les mesures par ICP-MS), Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava et de la biotechnologie de groupe de la Helmholtz-Institut Freiberg pour Technology Resource.

Les auteurs ont rien à révéler.

Dans ce travail étudié la liaison aux protéines de Au S-couche a été étudiée en utilisant une combinaison de différentes méthodes analytiques. En particulier, la fixation de Au est très intéressante, non seulement pour la récupération des eaux de Au miniers ou des solutions de traitement, mais également pour la construction de matériaux, par exemple des surfaces sensorielles. Pour les études de l&#39;UA interaction (Au (III) et Au (0) -NPs) avec sursis et monocouche de SLP1 recristallisé, la protéine a dû être ...

En raison de l&#39;utilisation croissante de l&#39;or pour plusieurs applications comme l&#39;électronique, les catalyseurs, les biocapteurs, ou des instruments médicaux, à la demande de ce métal précieux a augmenté au cours du temps de ces dernières années 6-9. Or, ainsi que beaucoup d&#39;autres métaux précieux et lourds sont libérés dans l&#39;environnement par les effluents industriels à des concentrations diluées, à travers des activités minières, et l&#39;élimination des déchets 7,8,10, bien que la plupart contamination de l&#39;environnement par des métaux lourds ou précieux est un processus continu principalement causés par des activités technologiques. Cela conduit à une interférence significative des écosystèmes naturels et pourrait menacer la santé humaine 9. La connaissance de ces résultats négatifs favorise la recherche de nouvelles techniques pour éliminer les métaux provenant des écosystèmes et des améliorations dans le recyclage des métaux contaminés des eaux usées industrielles. Bien établies méthodes physico-chimiques comme la précipitation ou échange d&#39;ions ne sont pas si efficaces, surtout en hauteLy dilué solutions 7,8,11. Biosorption, soit avec la vie ou la biomasse morte, est une alternative intéressante pour le traitement des eaux usées 10,12. L&#39;utilisation de ces matériaux biologiques peut réduire la consommation de produits chimiques toxiques. De nombreux micro-organismes ont été décrits à accumuler ou d&#39;immobiliser les métaux. Par exemple, les cellules de Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 ont montré des capacités de liaison élevée pour les métaux précieux, par exemple, Pd (II), Pt (II), Au (III), et d&#39;autres métaux toxiques comme le plomb (II) ou U (VI) 4,13, les cellules de Bacillus megaterium pour Cr (VI) 14, les cellules de Saccharomyces cerevisiae de Pt (II) et Pd (II) 15, et Chlorella vulgaire de Au (III) et U (VI) 16 , 17. La liaison des métaux précédents comme Au (III), Pd (II), et Pt (II) a également été rapportée pour Desulfovibrio desulfuricans 18 et L. sphaericus JG-B53 19,20. Néanmoins, pas all microbes lient des quantités élevées de métaux et leur application en tant que matériau de sorption est limitée 12,21. En outre, la capacité de liaison du métal dépend de différents paramètres, par exemple, la composition de la cellule, la bio-composant utilisé, ou de l&#39;environnement et des conditions expérimentales (pH, force ionique, température, etc.). L&#39;étude de fragments de paroi cellulaire isolés 22,23, comme les lipides membranaires, peptidoglycane, des protéines ou d&#39;autres composants, aide à comprendre le processus de cellules entières construites complexes 8,21 liaison du métal. Les composants de la cellule ont porté sur dans cette étude sont des protéines de la couche S. Les protéines de la couche S sont des parties de l&#39;enveloppe cellulaire externe de nombreuses bactéries et archaebactéries, et ils constituent environ 15 - 20% de la masse totale en protéines de ces organismes. Comme la première interface pour l&#39;environnement, ces composés cellulaires influencent fortement les propriétés de sorption 3 bactériennes. Les protéines de la couche S avec des poids moléculaires allant de quaranteà des centaines de kDa sont produites à l&#39;intérieur de la cellule, mais sont assemblés à l&#39;extérieur où ils sont capables de former des couches sur les membranes lipidiques ou polymériques composants de la paroi cellulaire. Une fois isolé, presque tous de la couche S protéines ont la propriété intrinsèque d&#39;auto assembler spontanément en suspension, au niveau des interfaces, ou sur des surfaces planes ou formant tubulaires structures 3. L&#39;épaisseur de la monocouche de protéine dépend de la bactérie et est dans une plage de 5 à 25 nm 24. En général, les structures des protéines de la couche S formés peuvent avoir une oblique (P1 ou P2), carré (p4), ou hexagonal (p3 ou p6) symétrie avec des constantes de réseau de 2,5 à 35 nm 3,24. La formation du réseau semble être dans de nombreux cas, dépendant des cations divalents et principalement sur ​​Ca2 + 25,26, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). Néanmoins, la cascade de réaction pleine de monomère pliage, l&#39;interaction monomère-monomère, la formation d&#39;un réseau, et le rôle des différents métaux, en particulier des cations bivalents tels que Ca 2+ et Mg 2+, ne sont pas encore pleinement compris. La souche de bactéries gram-positives L. sphaericus JG-B53 (renommé de Bacillus sphaericus après nouvelle classification phylogénétique) 27 a été isolé à partir de la pile de déchets des mines d&#39;uranium &quot;Haberland&quot; (Johanngeorgenstadt, Saxe, Allemagne) 4,28,29. Son fonctionnelle de la protéine S-couche (SLP1) possède un réseau carré, un poids moléculaire de 116 kDa 30, et une épaisseur de ≈ 10 nm sur 31 cellules bactériennes vivant. Dans des études antérieures, la formation in vitro d&#39;une couche de protéine fermée et stable d&#39;une épaisseur d&#39;environ 10 nm a été obtenue en moins de 10 min 19. La souche liée L. sphaericus JG-A12, également un isolat de la pile &quot;Haberland&quot;, possède des capacités de liaison élevés des métaux et de sa protéine isolée de la couche S a montré un bon taux de sorption haute stabilité chimique et mécanique et pour les métaux précieux comme l&#39;Au (III), Pt (II), et Pd (II) 4,32,33. Cette liaison de métaux précieux est plus ou moins spécifique pour certains métaux et dépend de la disponibilité des groupes fonctionnels sur la surface de protéine extérieure et intérieure du polymère et dans ses pores, la force ionique et le pH. Groupes fonctionnels pertinents pour l&#39;interaction de métal par les protéines sont COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 -, et SO-. En principe, les capacités de liaison métalliques ouvrent un large éventail d&#39;applications, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). par exemple, en tant que composants biosorptive pour l&#39;élimination ou la valorisationde métaux précieux ou toxiques dissoutes, des modèles pour la synthèse ou le dépôt de nanoparticules défini régulièrement structurés métalliques (IP) pour la catalyse, et d&#39;autres matériaux de bio-ingénierie comme couches bio-sensorielle 3,5,18,33. NP tableaux disposés régulièrement comme Au (0) -NPs pourraient être utilisés pour des applications majeures allant de l&#39;électronique moléculaire et les biocapteurs, des dispositifs de stockage ultra-haute densité, et des catalyseurs pour le CO-oxydation 34-37. Le développement de ces applications et la conception intelligente de ces matériaux nécessite une compréhension plus profonde des mécanismes contraignants de métal sous-jacent. Une condition préalable pour le développement de ces matériaux à base de bio-est de la mise en œuvre fiable d&#39;une couche d&#39;interface entre la biomolécule et la surface technique 38,39. Par exemple, les polyélectrolytes assemblés avec la couche par couche (LBL) 40,41 technique ont été utilisées en tant que couche d&#39;interface pour la recristallisation des protéines de la couche S 39 </sup&gt;. Une telle interface offre une façon relativement facile à réaliser le revêtement de protéine d&#39;une manière reproductible et quantitative. En effectuant des expériences différentes avec et sans modification avec les promoteurs adhésifs, il est possible de faire des déclarations concernant la cinétique de revêtement, la stabilité de la couche, et l&#39;interaction des métaux avec des biomolécules 19,42, Raff, J. et al. S-couche de nanocomposites à base pour des applications industrielles à base de protéines dans Engineered nanostructures. (eds Tijana Z. Grove et Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (soumis)). Cependant, le mécanisme complexe de l&#39;adsorption des protéines et l&#39;interaction protéine-surface soit pas complètement compris. Surtout informations sur la conformation, l&#39;orientation du motif, et les densités de revêtement est toujours manquant. Microbalance à cristal de quartz avec la surveillance de dissipation (QCM-D) technique a attiré l&#39;attention ces dernières années comme un outil pour l&#39;étude de l&#39;adsorption des protéines, de la cinétique de revêtement, et l&#39;interaction proles processus à l&#39;échelle du nanomètre 19,43-45. Cette technique permet la détection de masse en détail adsorption en temps réel, et peut être utilisé comme un indicateur pour le processus d&#39;auto-assemblage de protéines et de couplage de molécules fonctionnelles sur 19,20,42,46-48 réseaux de protéines. En outre, les mesures QCM-D ouvrent la possibilité d&#39;étudier les processus d&#39;interaction de métal avec la couche protéique dans des conditions biologiques naturelles. Dans une étude récente, l&#39;interaction de la protéine S-couche avec des métaux choisis comme Eu (III), Au (III), Pd (II), et Pt (II) a été étudié avec QCM-D 19,20. La couche de protéine adsorbée peut servir comme un modèle simplifié d&#39;une paroi cellulaire des bactéries gram-positives. L&#39;étude de ce seul composant peut contribuer à une meilleure compréhension de l&#39;interaction de métal. Cependant, uniquement expériences QCM-D ne permettent pas de déclarations concernant les structures et les influences de métaux à la protéine de surface. D&#39;autres techniques sont nécessaires pour obtenir ces informations. Un POSbilité pour l&#39;imagerie bio-nanostructures et l&#39;obtention d&#39;informations sur les propriétés structurelles est la microscopie à force atomique (AFM). L&#39;objectif de l&#39;étude présentée était d&#39;enquêter sur la sorption de l&#39;or (Au ​​(III) et Au (0) -NPs) aux protéines de la couche S, en particulier SLP1 de L. sphaericus JG-B53. Des expériences ont été faites avec des protéines en suspension sur l&#39;échelle de lots dans une gamme de pH de 2,0 à 5,0 en utilisant l&#39;ICP-MS et S-couches immobilisées en utilisant QCM-D. En outre, l&#39;influence de la solution de sel métallique sur la stabilité du réseau a été étudié par des études ultérieures de la FAM. La combinaison de ces techniques contribue à une meilleure compréhension des processus in vitro dans d&#39;interaction de métal comme un outil pour apprendre plus sur les événements de cellules bactériennes entières concernant les affinités de liaison métalliques spécifiques. Cette connaissance est essentielle non seulement pour le développement de matériaux filtrants applicables pour la récupération des métaux pour la protection de l&#39;environnement et la conservation des re49 sources, mais aussi pour le développement de réseaux de IP métalliques hautement ordonnés pour diverses applications techniques.

<table><tbody><tr><td><Equiment et logiciel >strong</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor, vapeur en place Système pilote 70L</td><td>Applikon Biotechnology, Pays-Bas</td><td>Z6X</td><td>avec dO2, capteurs de pH d’Applikon Biotechnology et logiciel BioXpert V2</td></tr><tr><td>Moniteur de biomasse non invasif BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), USA</td><td>Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td>Spectrometer Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Grande-Bretagne</td><td>80-2109-10</td><td>Entreprise maintenant GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>MiniStar micro centrifuge</td><td>VWR, Allemagne</td><td>521-2844</td><td>Pour la centrifugation d’échantillons de culture Système de</td></tr><tr><td>recherche microscope BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Allemagne</td><td>037006</td><td>Microscope en combinaison avec le logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>Cell^P (version 3.1)</td><td>Olympus Soft Imaging Solutions LLC, M&uuml ; nster, Allemagne---</td><td></td><td>en collaboration avec le microscope</td></tr><tr><td>Powerfuge Pilot Separation System Série 9010-S</td><td>Carr Centritech, Floride, États-Unis</td><td>9010PLT</td><td>Pour la récolte de la biomasse</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Allemagne</td><td>431-2601</td><td>Pour l’élimination des flagelles et l’homogénéisation des échantillons</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>728411</td><td>Utilisé dans l’isolement</td></tr><tr><td>des protéines Processeur de fluide mobile à haut cisaillement, M-110EH-30 Microfluidics pilote</td><td>, Massachusetts, États-Unis</td><td>M110EH30K</td><td>Utilisé pour la rupture cellulaire</td></tr><tr><td>Alpha 1-4 LSC Lyophilisateur</td><td>Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Allemagne</td><td>Spectrophotométrie 102041</td><td>---</td></tr><tr><td>UV-VIS (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>Pour la détermination de la protéine chambre</td></tr><tr><td>d’électrophorèse verticale Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Allemagne</td><td>165-3322</td> Pour le système d’imagerie <td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Allemagne</td><td>1708030</td><td>Utilisé pour l’imagerie des gels SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), États-Unis</td><td>N8120536</td><td>Pour la détermination de la concentration</td></tr> <tr><td>en métalZetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, Worcestershire Royaume-Uni</td><td>ZEN3600</td><td>Pour la détermination de la taille des nanoparticules</td></tr><tr><td>Dispositif Q-Sense E4&nbsp ;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Suède</td><td>QS-E4</td><td>commandé via LOT quantum design (logiciel inclus avec la plate-forme E4)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401 (enregistrement de données)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Suède</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (évaluation et modélisation des données)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Suède</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modules de flux QCM-D QFM&nbsp ; 401&nbsp ;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Suède</td><td>QS-QFM401</td><td>commandé via LOT quantum design</td></tr><tr><td>QSX&nbsp ; 303 SiO2 capteurs piézoélectriques à quartz AT-Cut</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Suède</td><td>QS-QSX303</td><td>commandé via LOT quantum design</td></tr><tr><td>Chambre de nettoyage de l’ozone</td><td>Bioforce Nanoscience, Ames (IA), ÉTATS-UNIS</td><td>QS-ESA006</td><td>commandé via LOT quantum design</td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>MFP-3DBio</td><td>Logiciel de mesure et d’imagerie AFM</td></tr><tr><td>Logiciel AFM d’Asylum Research AR Version 120804+1223</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), États-Unis</td><td></td>--- <td>logiciel d’imagerie inclus dans Cat. Non. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Version Pro 6.3.2.3 Logiciel</td><td>WaveMetrics, Inc., États-Unis---</td><td></td><td>Logiciel d’imagerie inclus dans Cat. Non. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), États-Unis</td><td>Bioheater</td><td>Chauffage d’échantillons pour les mesures AFM</td></tr><tr><td>Mini cantilever Biolever,&nbsp ; BL-AC40TS-C2</td><td>Olympus Germany LLC, Allemagne&</td><td>nbsp ; BL-AC40TS-C2</td><td>Cantilever préféré pour les mesures AFM</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L. , Espagne</td><td>freeware</td><td>Logiciel pour l’analyse AFM</td></tr> <tr><td>Nom</td><td>><Entreprise</td><td><>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</strong</td></tr><tr><td>>Détergents et autres équipements </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acide acide, 100 %, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3738.5</td><td>Danger, liquide et vapeur inflammables et corrosifs. Provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires.</td></tr><tr><td>Antimousse 204</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>A6426</td><td>Pour la suppression de la mousse</td></tr><tr><td>bleu de bromophénol, sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase II de la rate porcine</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>D4138</td><td>Typ IV , 2 000 - 6 000&nbsp ; Kunitz unités/mg de protéines</td></tr><tr><td>Éthanol, 95 %</td> <td>VWR, Allemagne</td><td>20827.467</td> Danger, glycérine <td>inflammable</td></tr><tr><td>, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de guanidine (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl) (37 %)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>4625.2</td><td>Danger ; Corrosif, utilisé pour l’ajustement du pH</td></tr><tr><td>Lysozyme du blanc d’œuf de poule</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>L6876&nbsp ;</td><td>Poudre lyophilisée, protéines = 90 %, = 40 000 unités/mg de protéines (Sigma)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Agitateur magnétique avec chauffage,&nbsp ; MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Allemagne</td><td>504.10100.00</td><td>Agitateur standard dans le cadre de l’expérience</td></tr><tr><td>NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800</td><td>---</td></tr><tr><td>Acide nitrique (HNO3)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN50.1</td><td>Danger ; Échelle</td></tr><tr><td>de protéines non colorées PageRuler</td> oxydante et corrosive <td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614</td><td>---</td></tr><tr><td>Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>243051</td><td>Mw moyen ~70 000</td></tr><tr><td>polyéthylénimine (PEI), ramifié</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>408727</td><td>Avertissement ; Nocif, irritant, dangereux pour l’environnement ; moyenne Mw ~25 000</td></tr><tr><td>Carbonate de potassium anhydre (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>60108</td><td>Avertissement ; </td></tr><tr><td>Ribonucase A nocive du pancréas bovin</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>R5503</td><td>Type I-AS, 50 à 100 unités de Kunitz/mg de protéines</td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td>106688</td><td>Danger ; très toxique et dangereux pour l’environnement</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>L-5750</td><td>Danger ; hydroxyde</td></tr><tr><td>de sodium (NaOH) toxiqueCARL</td> <td>ROTH GmbH+CO. KG</td><td>6771.1</td><td>Danger ; Corrosif, utilisé pour la régulation du pH dans la culture et l’ajustement du pH</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, membrane de dialyse, MWCO 50 000</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Acide sulfurique (H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN52.2</td><td>Danger ; Corrosif, utilisé pour la régulation du pH dans la culture</td></tr><tr><td>Acide tannique (C76H52O46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>9090.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3051.3</td><td>Avertissement ; Nocif, Dangereux pour l’environnement</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500, 50 000 MWCO Tubes d’ultrafiltration</td><td>Sartorius AG</td><td>VS0132</td><td>---</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M6250</td><td>Danger, toxique</td></tr></tbody></table>

au-interaction des slp1 polymères et monocouche de<em&gt; lysinibacillus sphaericus</em&gt; jg-b53 - qcm-d, icp-ms et l&#39;afm comme outils pour les études de biomolécules-métalliques

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

Dans cette publication, le comportement de sorption de l’or des protéines de la couche superficielle (couche S) (Slp1) de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 est décrit. Ces biomolécules s’organisent en réseaux bidimensionnels paracristallins sur les surfaces, lient les métaux et sont donc intéressantes pour plusieurs applications biotechniques, telles que les matériaux biosorptifs pour l’élimination ou la récupération de différents éléments de l’environnement et les processus industriels. Le dépôt de nanoparticules d’Au(0) sur les couches S, soit par synthèse dirigée de la couche S 1, soit par adsorption de nanoparticules, ouvre de nouvelles possibilités pour diverses applications sensorielles. Bien que de nombreuses études aient décrit les propriétés biosorptives des couches S 2 à 5, une compréhension plus approfondie de l’interaction protéine-protéine et protéine-métal reste encore un défi. Dans l’étude suivante, la spectrométrie de masse à couplage inductif (ICP-MS) a été utilisée pour la détection de la sorption des métaux par les couches S en suspension. Cela a été corrélé aux mesures de microbalance à cristal de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D), qui permet la détection en ligne de la formation de monocouches protéiques et du dépôt de métal, et donc, une compréhension plus détaillée de la liaison métallique.
Les résultats de l’ICP-MS ont indiqué que la liaison de l’Au(III) aux polymères de la couche S en suspension dépend du pH. La liaison maximale d’Au(III) a été obtenue à un pH de 4,0. Les investigations QCM-D ont permis de détecter la sorption de l’Au(III) ainsi que le dépôt de NP Au(0) en temps réel pendant les expériences in situ. De plus, cette méthode a permis d’étudier l’influence de la liaison métallique sur la stabilité du réseau protéique de Slp1. Les propriétés structurelles et la stabilité de la couche protéique ont pu être visualisées directement après l’expérience QCM-D à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). En conclusion, la combinaison de ces différentes méthodes permet une compréhension plus approfondie de la liaison des métaux par les protéines bactériennes de la couche S en suspension ou sous forme de monocouches sur des cellules bactériennes ou des surfaces recristallisées.

La culture de micro-organismes et SLP1 Caractérisation Les données enregistrées de la croissance bactérienne indique la fin de la phase exponentielle de croissance à environ 5 heures. Enquêtes précédentes ont montré que SLP1 peut être isolé à partir de ce moment de la récolte (4,36 g / biomasse humide L (≈ 1,45 g / L (BDW)) avec un rendement maximal 19. Néanmoins, l&#39;optimisation de la culture en...

Pour obtenir des informations de base sur la sorption et le recyclage de l’or à partir de systèmes aqueux, l’interaction des nanoparticules d’Au(III) et d’Au(0) sur les protéines de la couche S a été étudiée. La sorption des polymères protéiques a été étudiée par ICP-MS et celle des monocouches protéiques par QCM-D. L’AFM subséquente permet d’imager les nanostructures.

Au-Interaction des SLP1 Polymères et monocouche de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS et l&#39;AFM comme outils pour les études de biomolécules-métalliques

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

L'objectif général de cette expérience est d'étudier le comportement de sorption de l'or par les protéines de couche S de la souche bactérienne présentée, d'un point de vue écologique et technologique. Ces méthodes permettent de répondre à des questions clés dans les domaines scientifiques liés à l'environnement, tels que les processus de sorption, ainsi que la suppression et la récupération des métaux. Le principal avantage de ces techniques réside dans la possibilité de détecter la sorption métallique et l'adsorption de nanoparticules sur une autre échelle de grandeur.En utilisant la QCM-D, il est possible de détecter cela lors d'une mesure en temps réel. Pour commencer cette procédure, équipez les cellules fluidiques de capteurs factices. Passez au moins 20 millilitres par module d'un agent de nettoyage liquide alcalin à 2 % dans de l'eau ultrapure à travers le système de QCM-D et des tubes.Ensuite, pomper un volume égal à cinq fois le volume par module d'eau ultrapure à travers le système, avec un débit allant jusqu'à 300 microlitres par minute, conformément au protocole du fabricant. Nettoyer les capteurs en dioxyde de silicium situés à l'extérieur des modules d'écoulement par incubation dans une solution de dodécylsulfate de sodium à 2 % pendant au moins 20 minutes. Puis rincer les capteurs plusieurs fois avec de l'eau ultrapure.Après avoir séché les cristaux à l'air comprimé filtré, placez-les dans une chambre de nettoyage à l'ozone pendant 20 minutes. Ensuite, répétez la procédure de nettoyage deux fois afin d'éliminer tous les composés organiques. Pour éliminer les métaux liés de la surface du capteur, rincez les capteurs avec de l'acide nitrique à une molaire.Ensuite, rincez les capteurs plusieurs fois avec de l'eau ultrapure. Puis, modifiez les capteurs en utilisant des couches alternées de polyéthylèneimine et de polystyrène sulfonate à trois grammes par litre, par trempage selon la technique en couches successives ou méthode LBL. Placez les capteurs dans la solution de polyelectrolyte appropriée dans des plaques à puits profonds et incubez-les pendant 10 minutes à température ambiante.Ensuite, retirez les capteurs de la solution de polyelectrolyte et rincez-les abondamment à l'eau ultrapure entre chaque étape de trempage. Une fois la modification externe terminée, placez les capteurs à l'intérieur du module d'écoulement. Équilibrez les capteurs en les rinçant à l'eau ultrapure avant de commencer les expériences.À ce stade, dissoudre le Slp1 précédemment isolé et purifié dans de l'urée afin de convertir les polymères en monomères. Centrifuger les protéines monomérisées à 15 000 ×g et à 4 degrés Celsius pendant une heure pour éliminer les agrégats protéiques plus gros. Mélanger le surnageant de Slp1 solubilisé et centrifugé avec un tampon de recristallisation jusqu'à une concentration finale en protéine de 0,2 gramme par litre.Après une recristallisation réussie des protéines sur les capteurs modifiés par des polyelectrolytes à l'intérieur des modules d'écoulement, rincer soigneusement les capteurs recouverts avec le tampon de recristallisation à un débit de 125 microlitres par minute jusqu'à l'obtention de valeurs stables pour les décalages de fréquence et de dissipation. Après un revêtement réussi par Slp1 dans les modules d'écoulement, rincer abondamment la couche de Slp1 obtenue avec un tampon de citrate 1,6 millimolaire, pH 5,0, jusqu'à l'obtention de valeurs stables pour les décalages de fréquence et de dissipation. Ensuite, injecter une solution de nanoparticules préparée au préalable à une concentration de un millimolaire dans les modules d'écoulement à un débit de 125 microlitres par minute.Ensuite, suivre l'adsorption de masse sur la couche Slp1. Après avoir terminé l'interaction avec les nanoparticules métalliques, rincer la couche avec un tampon exempt de nanoparticules afin d'éliminer les métaux ou nanoparticules faiblement liés. À l'aide d'un microscope à force atomique (AFM) couplé à un microscope optique inversé, enregistrer des images en milieu liquide en utilisant de l'eau ultrapure directement sur les capteurs QCM-D revêtus.Rincez les capteurs avec de l'eau ultrapure après les expériences de QCM-D et placez-les à l'intérieur de la cellule liquide de la MFA. Utilisez un levier dont la fréquence de résonance est d'environ 25 kilohertz dans l'eau et dont la rigidité est inférieure à 0,1 newton par mètre. Réglez la vitesse de balayage entre 2,5 et 10 micromètres par seconde.Acquérir des images en mode contact dynamique pendant que le levier est excité par un piézoélectrique à sa fréquence de résonance. Enfin, déterminer la distance entre le levier et la surface par l'amortissement de l'oscillation. Les capacités maximales de liaison métallique de l'or trois par Slp1 en suspension montrent qu'il était stablement lié pendant l'incubation de 24 heures dans la plage de pH étudiée.La diminution immédiate de la fréquence indique une adsorption rapide et une forte affinité des protéines pour la surface modifiée par polyelectrolyte. La dissipation augmente également immédiatement, ce qui indique une adsorption de molécules viscoélastiques à la surface en raison d’un amortissement rapide entraînant une augmentation des valeurs de dissipation. Des nanoparticules d’or préformées ont été incubées avec la Slp1 et analysées par électrophorèse SDS-PAGE, ce qui a confirmé les données de QCM-D montrant que les nanoparticules n’altèrent pas la structure de la Slp1.L'adsorption de nanoparticules zéro de cuivre métallique pré-synthétisées est présentée pour des expériences QCM-D dans des diagrammes delta F-delta D, ainsi que sous forme de profils d'épaisseur et de masse. Le réseau protéique de Slp1 recristallisé sur des capteurs modifiés par des polyelectrolytes est montré ici. La constante de réseau a été déterminée à 13 à 14 nanomètres et l'épaisseur de la couche a été trouvée être de 10 plus ou moins deux nanomètres.Les études par AFM ont vérifié qu'après l'interaction or trois, le réseau Slp1 est resté parfaitement intact, ce qui confirme les résultats de QCM-D prédisant la stabilité du revêtement. L'AFM confirme l'adsorption de nanoparticules or zéro sur le réseau Slp1, mais en raison de la taille des particules, elles ne suivent pas la symétrie p4 de Slp1. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une seule journée de travail si elle est effectuée correctement.À la suite de ces méthodes, d'autres techniques telles que la spectroscopie infrarouge ou la microscopie à ions hélium peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les sites de liaison spécifiques ou les interactions avec l'or ou les nanoparticules d'or. La technique présentée a ouvert la voie à l'utilisation de l'uzrachem pour étudier les interactions des biomolécules avec les métaux, ainsi que, par exemple, le comportement d'adsorption et de désorption sur différents types de surfaces. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez désormais bien comprendre comment étudier les interactions des métaux avec des solvants biologiques. Lorsque vous utilisez cette méthode, n'oubliez pas, s'il vous plaît, de porter des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et bien sûr des gants.

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