Au-Interaction des SLP1 Polymères et monocouche de Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS et l'AFM comme outils pour les études de biomolécules-métalliques

L’objectif global de cette expérience est d’étudier le comportement de sorption de l’or par les protéines de la couche S de la souche bactérienne présentée d’un point de vue écologique et technologique. Ces méthodes peuvent répondre à des questions clés dans les sciences liées à l’environnement dans ces domaines des processus de sorption et de l’élimination et de la récupération des métaux. Le principal avantage de ces techniques est que vous pouvez détecter la sorption métallique et l’adsorption de nanoparticules dans une autre plage d’échelle.

En utilisant QCM-D, il est possible de le détecter dans une mesure en temps réel. Pour commencer cette procédure, équipez les cellules de fluide de mannequins de capteur. Pompez au moins 20 millilitres par module d’un agent nettoyant liquide alcalin à 2 % dans de l’eau ultrapure à travers le QCM-D et le système de tubes.

Ensuite, pompez un volume quintuple par module d’eau ultrapure à travers le système avec un débit allant jusqu’à 300 microlitres par minute selon le protocole du fabricant. Nettoyez les capteurs de dioxyde de silicium à l’extérieur des modules d’écoulement par incubation dans une solution de dodécylsulfate de sodium à 2 % pendant au moins 20 minutes. Ensuite, rincez plusieurs fois les capteurs à l’eau ultra-pure.

Après avoir séché les cristaux à l’air comprimé filtré, placez-les dans une chambre de nettoyage à l’ozone pendant 20 minutes. Ensuite, répétez la procédure de nettoyage deux fois pour éliminer tout le contenu organique. Pour éliminer les métaux liés de la surface du capteur, rincez les sondes avec une molaire d’acide nitrique.

Rincez ensuite les capteurs plusieurs fois avec de l’eau ultrapure. Ensuite, modifiez les capteurs avec trois grammes par litre d’alternance de couches de polyéthylénimine et de polystyrène sulfonate par immersion en utilisant la technique couche par couche ou LBL. Placez les capteurs à l’intérieur de la solution de polyélectrolyte appropriée dans des plaques à puits profonds et incuberez-les pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, retirez les capteurs de la solution de polyélectrolyte et rincez-les intensivement entre chaque étape de revêtement par immersion avec de l’eau ultrapure. Une fois la modification externe terminée, placez les capteurs à l’intérieur du module de flux. Équilibrez les capteurs en les rinçant à l’eau ultrapure avant de commencer les expériences.

À ce stade, dissoudre le Slp1 précédemment isolé et purifié dans la formule urée pour convertir les polymères en monomères. Centrifugez les protéines monomérisées à 15 000 fois g et 4 degrés Celsius pendant une heure pour éliminer les plus gros agglomérats de protéines. Mélanger le surnageant Slp1 solubilisé et centrifugé avec le tampon de recristallisation jusqu’à une concentration finale en protéines de 0,2 gramme par litre.

Après une recristallisation réussie des protéines sur les capteurs modifiés en polyélectrolyte à l’intérieur des modules de flux, rincez intensivement les capteurs revêtus avec un tampon de recristallisation à un débit de 125 microlitres par minute jusqu’à ce que des valeurs stables de décalages de fréquence et de dissipation soient détectées. Une fois que l’enrobage Slp1 a réussi dans les modules de flux, rincez intensivement la couche Slp1 obtenue avec un tampon de citrate de 1,6 millimolaire pH 5,0 jusqu’à ce que des valeurs stables de décalages de fréquence et de dissipation soient détectées. Ensuite, pompez une solution de nanoparticules d’un millimolaire préalablement préparée dans les modules d’écoulement avec un débit de 125 microlitres par minute.

Ensuite, suivez l’adsorption de masse sur la couche Slp1. Une fois l’interaction entre les nanoparticules métalliques terminée, rincez la couche avec un tampon sans nanoparticules pour éliminer les métaux ou les nanoparticules faiblement liés. À l’aide d’un microscope à force atomique ou d’un AFM avec un microscope optique inversé, enregistrez des images dans un liquide en utilisant de l’eau ultrapure directement sur les capteurs QCM-D revêtus.

Rincez les capteurs à l’eau ultrapure après les expériences QCM-D et placez-les à l’intérieur de la cellule fluide AFM. Utilisez un porte-à-faux avec une fréquence de résonance d’environ 25 kilohertz dans l’eau et une rigidité inférieure à 0,1 newton par mètre. Ajustez la vitesse de balayage entre 2,5 et 10 micromètres par seconde.

Prenez des images en mode contact dynamique pendant que le cantilever est excité par un piézo à sa fréquence de résonance. Enfin, déterminez la distance du porte-à-faux par rapport à la surface par l’amortissement des oscillations. Les capacités maximales de liaison métallique de l’or trois par Slp1 en suspension montrent qu’il était lié de manière stable pendant l’incubation de 24 heures dans la plage de pH étudiée.

La diminution immédiate de la fréquence indique une adsorption rapide et une grande affinité des protéines pour la surface modifiée par les polyélectrolytes. La dissipation augmente également immédiatement, ce qui indique une adsorption des molécules viscoélastiques à la surface en raison de l’amortissement rapide, ce qui entraîne une augmentation des valeurs de dissipation. Des nanoparticules d’or zéro présynthétisées ont été incubées avec Slp1 et analysées par SDS-PAGE qui a vérifié les données QCM-D montrant que les nanoparticules ne perturbent pas la structure de Slp1.

L’adsorption de nanoparticules d’or métallique zéro présynthétisées est démontrée pour les expériences QCM-D dans les tracés delta F-delta D et sous forme de profils d’épaisseur et de masse. Le réseau protéique de Slp1 recristallisé sur des capteurs modifiés par des polyélectrolytes est illustré ici. La constante du réseau a été déterminée à 13 à 14 nanomètres et l’épaisseur de la couche a été trouvée à 10 plus ou moins deux nanomètres.

Les études AFM ont vérifié qu’après l’interaction or-trois, le réseau Slp1 est resté complètement intact, ce qui confirme les résultats du QCM-D qui prédisaient la stabilité du revêtement. L’AFM vérifie l’adsorption des nanoparticules d’or zéro sur le réseau Slp1, mais en raison de la taille des particules, elles ne suivent pas la symétrie p4 de Slp1. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en un jour ouvrable si elle est exécutée correctement.

En suivant ces méthodes, d’autres techniques telles que la spectroscopie infrarouge ou la microscopie ionique à l’hélium peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions telles que des viseurs de liaison spécifiques ou l’interaction avec de l’or ou des nanoparticules d’or. La technique présentée a ouvert la voie à l’uzrachem pour étudier les interactions des biomolécules avec les métaux et, par exemple, le comportement d’adsorption et de désorption sur différents types de surfaces. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier les interactions des métaux avec les solvants biologiques et s’il vous plaît, lorsque vous utilisez cette méthode, n’oubliez pas d’utiliser des lunettes, une blouse de laboratoire et bien sûr aussi des gants.