Name: Induction dun Etat isoélectrique cerveau chargé denquêter sur limpact de lactivité sur Endogène Synaptic Neuronal excitabilité In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Découvrez l'induction d'un état isoélectrique cérébral chez le rat pour étudier les propriétés intrinsèques des neurones en l'absence d'entrées synaptiques. Cette méthode permet d'évaluer l'impact de l'activité réseau sur le calcul cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de France, l&#39;Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale, l&#39;Université Pierre et Marie Curie et le programme «Investissements d&#39;avenir &#39;ANR-10-IAIHU-06.

Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec les directives de l&#39;Union européenne (directive 2010/63 / UE) et approuvé par le Comité d&#39;éthique Charles Darwin sur l&#39;expérimentation animale. Nous décrivons ici la procédure que nous utilisons régulièrement dans notre laboratoire, mais la plupart des mesures peuvent être adaptées pour répondre aux besoins spécifiques de chacun. 1. Préparation chirurgicale Note: Tous les points d&#39;incision et de pression doivent être infiltrés à plusieurs reprises avec un anesthésique local (lidocaïne ou bupivacaïne). La présente procédure est terminal, si une préparation aseptique est nécessaire plusieurs modifications doivent être mises en œuvre. <ol><li> Anesthésier un rat avec du pentobarbital sodique (40 mg / kg) et de kétamine (50 mg / kg) par voie intrapéritonéale à deux séparés localement (IP) d&#39;injections. </li><li> Laissez l&#39;animal aller sous anesthésie générale et à plusieurs reprises vérifier qu&#39;un plan chirurgical de l&#39;anesthésie est atteint (pas de réaction aux pieds pincement). Placez le rat sur une feedback couverture chauffante et insérer une sonde rectale pour maintenir la température de base d&#39;environ 37 ° C. </li><li> Placer un cathéter dans la cavité peritoneale afin de faciliter l&#39; injection ultérieure d&#39;agents anesthésiques et pour éviter des organes de perforation par piqûres d&#39;aiguille répétées 30. <ol><li> Couper les poils sur un petit (~ 2 - 3 mm) zone au-dessus d&#39;une région située dans le quadrant inférieur droit ou gauche de l&#39;estomac. Remarque: la crème dépilatoire peut également être utilisé. </li><li> Faire un 2 - mm incision 3 sur la peau avec des ciseaux pointus ou un scalpel. Utilisation de dissection, enlever les couches de graisse et de muscle jusqu&#39;à ce que la cavité péritonéale est observée. </li><li> Insérez environ 1 - 2 cm d&#39;un petit cathéter dans la cavité et fermer la plaie avec de la colle chirurgicale. (. Par exemple, 2 Français - correspondant à 0.043 mm de diamètre intérieur): Remarque Le diamètre et la longueur totale du cathéter devrait être minime pour réduire les volumes morts. tubes en polyuréthane sont les plus adaptés. </li><li> Faire une boucle et la suture til cathéter à la peau pour le fixer en place. </li></ol></li><li> Installez un tube trachéal pour contrôler la ventilation pendant la respiration artificielle. <ol><li> Quant à l&#39;étape précédente, préparer la zone d&#39;intérêt (1 - 2 cm au-dessus de la trachée juste au-dessus du manubrium), enlever les poils et inciser la peau. </li><li> Blunt disséquer les premières couches de graisse et de muscles, puis déplacez la glande salivaire de côté et exposer la trachée en disséquant doucement la dernière couche de muscles. </li><li> Retirez délicatement les tissus sur la trachée et glisser un fil ci-dessous à l&#39;aide de petites pinces. Faire le noeud d&#39;un chirurgien avec le fil, mais ne pas serré encore. </li><li> Inciser la transversale trachée entre deux anneaux cartilagineux. sang Swab dans la trachée le cas échéant. </li><li> Insérez un tube trachéal avec le diamètre approprié et serrer le noeud du fil pour fixer le tube stable. Pour plus de stabilité le fil peut en outre être fixé à un point du tube de trachée supérieur. </li><li> Suture la plaie à proximité ou utiliser des agrafes chirurgicales. Éviter la colle chirurgicale ici si le tube trachéal est destiné à être réutilisé. </li></ol></li><li> Installez l&#39;animal dans un cadre stéréotaxique et surveiller attentivement les variables physiologiques suivantes: ECoG, SpO 2, ETCO 2, la fréquence cardiaque (via un électrocardiogramme, ECG) et de la température interne. Surveiller et ajuster ces variables afin de maintenir une bonne profondeur de l&#39;anesthésie et de l&#39;état physiologique. Plus précisément, compléter l&#39;anesthésie avec une faible dose (10 mg / kg) de pentobarbital sodique si nécessaire. </li><li> Appliquer une pommade oculaire sur les deux yeux pour éviter la dessiccation. Couper les poils sur le cuir chevelu, faire une incision longitudinale (~ 2 cm) et réséquer les tissus conjonctifs recouvrant le crâne à l&#39;aide d&#39;un scalpel ou d&#39;une curette. </li><li> Faire un petit (~ 1,5 mm de diamètre) craniotomie sur la région d&#39;intérêt avec une perceuse dentaire. Note: Ici, le champ du cortex somatosensoriel primaire du canon est ciblé (7 - 8 mm antérieure à la ligne interauriculaire, 4.5- 5,5 mm latéralement à la ligne médiane 31). Rincer à plusieurs reprises pour dissiper la chaleur. </li><li> Utilisez une pince extra fines pour faire doucement un petit trou dans la dure-mère. Réserver une région ~ 0,5 mm dans le trépanation crânienne pour placer l&#39;électrode EcoG (voir l&#39;étape suivante). En permanence garder le cortex humide avec une solution de NaCl à 0,9% (ou de liquide céphalo-rachidien artificiel). </li><li> Placer une impédance faible (~ 60 kQ) électrode d&#39;argent (l&#39;électrode ECoG) sur la dure-mère, en évitant la région corticale ne sont pas couverts par les méninges et placer l&#39;électrode de référence sur un muscle du cuir chevelu de l&#39;autre côté de la tête. </li><li> À ce stade (30 minutes après l&#39;injection de pentobarbital de sodium dernière), à ​​maintenir l&#39;anesthésie par des injections répétées de pentobarbital sodique (10-15 mg / kg / h) ou fentanyle (3-6 ug / kg / h) par l&#39;intermédiaire du cathéter IP. L&#39;ancien se traduira par une oscillation lente, motif EcoG semblable au sommeil alors que celui-ci se traduira par un désynchronisé, comme la veille, le profil corticale. </li><li> Réglez la v artificielleSystème de entilation de sorte que la fréquence et le volume respiratoire sont semblables à ceux de la respiration spontanée du rat (plage normale 70-115 respiration / min 32). Ensuite, connectez la ventilation mécanique au tube trachéal et vérifier l&#39;inflation de la cage thoracique appropriée (des deux côtés). Sinon, régler la position du tube d&#39;aération dans l&#39;axe de la trachée. Si nécessaire, aspirer la sécrétion présente dans la trachée d&#39;un cathéter relié à une seringue ou d&#39;une pompe à vide. </li><li> Si toutes les variables physiologiques 32-35 et EcoG 29,36 motifs reflètent un plan chirurgical stable de l&#39; anesthésie, faire une injection intramusculaire de gallamine triéthiodure dans chaque jambe de paralyser le rat, 40 mg / kg pour la première injection, puis 20 mg / kg , chaque 2hr 19,29,36,50. </li></ol> 2. intracellulaires Recordings <ol><li> Tirez une micropipette de verre (microélectrodes forte) avec un ~ 0,2 um pointe telles que sa résistance varie between 50 et 80, une fois rempli avec MQ 2 M d&#39;acétate de potassium (KAc). </li><li> Placer la pipette dans un support spécifique avec un argent / chlorure d&#39;argent (Ag / AgCl) pour connecter le fil de la solution de la pipette à un amplificateur intracellulaire (par l&#39;intermédiaire d&#39;un étage de tête). Le titulaire doit être attaché à un micromanipulateur. Placer une électrode de référence Ag / AgCl sur les muscles du cou du rat. </li><li> Introduire lentement la pipette dans le cerveau jusqu&#39;à la région d&#39;intérêt et de vérifier sa résistance en surveillant les chutes de tension en réponse aux mesures actuelles. Utilisez le buzz (ou zapper) touche de l&#39;amplificateur pour effacer la pipette si nécessaire. </li><li> Utilisez des cotons-tiges ou des triangles d&#39;absorption synthétiques pour sécher la craniotomie (attention à ne pas toucher le EcoG ou électrodes intracellulaires) avant de le couvrir avec un élastomère de silicone ou 4% d&#39;agarose pour réduire les mouvements du cerveau. </li><li> Abaisser la pipette dans 1 - 2 pm étapes jusqu&#39;à ce que sa résistance augmente à l&#39;approche d&#39;une cellule. Ensuite, utilisez la fonction de buzz de l&#39;amplificateur à PenetraTe dans le neurone. </li></ol> 3. Provoquer l&#39;État isoélectrique <ol><li> Effectuer le protocole expérimental approprié (par exemple, les courants de tir réponses aux injecté intracellulairement, les relations courant-tension, les réponses des stimuli sensoriels) à ce stade , tout en surveillant simultanément le potentiel de membrane du neurone, le EcoG et les variables physiologiques. </li><li> Assurez-vous que l&#39;électrode intracellulaire est stable dans la cellule en analysant la stabilité à la fois du potentiel de membrane et l&#39;action, propriétés potentielles tout au long de la session d&#39;enregistrement. Si non, ne vont pas à l&#39;étape suivante et attendre jusqu&#39;à ce que l&#39;enregistrement devienne stable à nouveau ou rechercher un autre neurone. </li><li> Injecter une dose élevée, mais infra-létale de pentobarbital de sodium (~ 90 mg / kg, peut être aussi faible que 35 mg / kg de la condition initiale du pentobarbital et jusqu&#39;à 155 mg / kg du fentanyl état initial) via la ligne IP. Remarque: Dans les 15 - 20 min intracellulaire et EcoG waveforms devrait ralentir avec des silences électriques intermittents pour atteindre transitoirement le &quot;burst-suppression» que l&#39; on appelle le profil de 37,38, qui s&#39;écroule progressivement à un état ​​isoélectrique complet. Il est prévu que le rythme cardiaque ralentit considérablement (d&#39;environ 10 - 20%) , mais la SpO 2 et EtCO 2 devrait rester relativement stable. </li><li> Si l&#39;état isoélectrique est pas atteint, l&#39;injection d&#39;une petite quantité de pentobarbital sodique (~ 10% de la dose étape 3.1). Attendez 15 min avant d&#39;ajouter plus anesthésique si l&#39;état isoélectrique est toujours pas atteint. </li><li> Répétez le protocole expérimental pour comparer l&#39;impact de la dynamique du réseau sur les propriétés d&#39;intégration du neurone enregistré. Note: Après l&#39;arrêt des injections anesthésiques, l&#39;activité électrique du cerveau devrait se rétablir complètement dans les 3 à 4 heures. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, l&#39;injection d&#39;une dose létale de pentobarbital de sodium (200 mg / kg, IP) pour euthanasier le rat. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour supprimer in vivo l&#39; activité électrique cérébrale spontanée à la fois le réseau et les niveaux cellulaires. Cette procédure conduit à un état ​​du cerveau extrême, connu sous le nom comateux isoélectrique 41. D&#39;un point de vue clinique, une telle inactivité est l&#39;anomalie électrique cérébral la plus sévère qui peut être vu sur l&#39;EEG. Elle est principalement associée à un coma irréversible, avec tous les patients soit mourants ou continue d...

En l&#39;absence de stimuli environnementaux ou des tâches comportementales, le &quot;repos&quot; cerveau génère un flux continu de l&#39;activité électrique qui peut être enregistré à partir du cuir chevelu, comme électroencéphalographiques (EEG) des ondes. Le corrélat intracellulaire de cette activité cérébrale endogène est caractérisée par des fluctuations de tension de la membrane de fond (également connu sous le nom de «bruit synaptique»), qui sont composés d&#39;une combinaison de potentiels synaptiques excitateurs et inhibiteurs qui reflètent l&#39;activité en cours des réseaux afférences 1,2. Cette activité spontanée varie en fréquence et en amplitude avec les différents états de vigilance. Elucider l&#39;impact de l&#39; activité du réseau sur l&#39;excitabilité et la réactivité des neurones individuels est l&#39; un des principaux défis des neurosciences 3,4. De nombreuses études expérimentales et informatiques ont exploré l&#39;impact fonctionnel de l&#39;activité synaptique en cours sur la propertie intégratives des neurones. Cependant, le rôle des différents paramètres neuronaux touchés par le bruit de fond synaptique reste insaisissable. Par exemple, le niveau moyen de dépolarisation de la membrane a été trouvé de manière positive ou négative 5,6 09/07 corrélée avec la capacité des entrées sensorielles pour déclencher de potentiels d&#39;action. De plus, alors que certaines études suggèrent que les fluctuations du potentiel de membrane, résultant d&#39;un courant variant de façon continue des apports synaptiques afférences, affectent fortement la réactivité des neurones isolés en modulant le gain de leur relation d&#39; entrée-sortie 3,10-13, d&#39; autres indiquent que les changements dans la conductance membranaire entrée à médiation par l&#39; inhibition shuntage sont suffisantes pour moduler le gain neuronale indépendamment de l&#39;ampleur des fluctuations des membranes 14,15. Enfin, des études récentes effectuées sur des animaux éveillés ont souligné comment le traitement de l&#39;information sensorielle unique neurone dépend essentiellement de l&#39;état de vigilance d&#39;une la demande 16,17 comportementale actuelle. Une stratégie simple pour élucider le rôle fonctionnel d&#39;un procédé donné dans un système hautement interconnectée est de déterminer son absence modifie spécifiquement le fonctionnement du système. Cette méthode a été largement utilisé dans la recherche en neurosciences, par exemple en utilisant des lésions expérimentales ou inactivation des différentes zones du cerveau 18-21, ou le blocage pharmacologique des canaux ioniques spécifiques 22,23. Notamment, il a été appliqué in vivo pour dévoiler la façon dont la connectivité réseau et la dynamique fonctionnelle affectent le calcul de la cellule unique 24-27. Cependant, à ce jour les manipulations locales destinées à bloquer la décharge des neurones et / ou de perturber leurs propriétés biophysiques de base peut être partiellement efficace et sont limitées à des volumes relativement faibles du cerveau 28. Pour surmonter ces limitations, nous avons développé une nouvelle approche expérimentale in vivo dans dele rat pour comparer les propriétés électrophysiologiques des neurones individuels enregistrés dans un état ​​du cerveau donnée, à savoir, intégrés dans un réseau particulier dynamique, à ceux obtenus après la suppression complète du cerveau toute l&#39; activité synaptique 29. Dans les conditions témoins, deux dynamiques corticales distinctes pourraient être générés. électrocorticographiques (ECoG) Les habitudes de sommeil-like ont été induites par l&#39;injection de doses modérées de pentobarbital de sodium. Alternativement, les vagues ECoG rapides de faible amplitude comparable à l&#39;activité corticale sous-jacente de l&#39;état de veille (le dessin d&#39;éveil-like) pourraient être produites par injection de fentanyl. Par la suite, tout en conservant la même EcoG et l&#39;enregistrement intracellulaire, une inactivation complète de l&#39;activité électrique du cerveau endogène a été obtenu par injection systémique d&#39;une dose élevée de pentobarbital sodique, caractérisé par EcoG isoélectrique et les activités intracellulaires. Parce que l&#39;induction d&#39;un tel coma extrême pourrait avoir CONSÉCUTIFS fatalebureaux sur les fonctions biologiques, une surveillance attentive et continue des variables physiologiques était essentielle. Par conséquent, nous avons suivi avec soin la fréquence cardiaque de battement, la concentration de CO 2 télé-expiratoire (EtCO 2), la saturation en O 2 (SpO 2) et la température du coeur du rat au cours des expériences. Nous évaluons simples propriétés des neurones au cours de ces différents états à l&#39; aide de microélectrodes pointus, qui sont particulièrement adaptés pour les enregistrements longs et stables in vivo. La procédure décrite ici, peut être combiné avec d&#39;autres approches électrophysiologiques et d&#39;imagerie et pourrait être étendu à d&#39;autres modèles animaux.

<table><tbody><tr><td>Sodium Pentobarbital</td><td>Centravet</td><td>Pentobarbital</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine 500</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave ; ne 500</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl&nbsp ;</td><td>Janssen-Cilag</td><td>Fentanyl</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaïne</td><td>Centravet</td><td>Xylovet</td><td></td></tr><tr><td>Gallamine triéthiodide</td><td>Sigma</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur ECoG</td><td>A-M Systems</td><td>Amplificateur AC, Modèle 1700</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur intracellulaire</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>Interface d’acquisition de données</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Puissance CED 1401-3&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse de données</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 version 7</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulateur</td><td>Scientifica</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de capillaires</td><td>Narishige</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté Appareil</td><td>Harvard</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Fil d’argent 0,125 mm (enregistrement intracellulaire)</td><td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>Ag-AgCl référence</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>Fil d’argent 0,25 mm (enregistrement ECoG)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>Système de respiration artificielle</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>Surveillance des paramètres physiologiques</td><td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>Couverture chauffante</td><td>Harvard</td><td>Apparatus 507215</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>IP Cathéter en polyuréthane - 0.43x0.69 mm&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>Élastomère de silicone</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Foret dentaire</td><td>NSK</td><td>Y1001151 et P496</td><td></td></tr><tr><td>Colle chirurgicale</td><td>3M</td><td>vetbond</td><td></td></tr></tbody></table>

induction d&#39;un etat isoélectrique cerveau chargé d&#39;enquêter sur l&#39;impact de l&#39;activité sur endogène synaptic neuronal excitabilité<em&gt; in vivo</em

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Les informations de processus de neurones façon dépend à la fois sur leurs propriétés membranaires intrinsèques et sur la dynamique du réseau synaptique afférente. En particulier, l&#39;activité du réseau endogène généré, qui varie fortement en fonction de l&#39;état de vigilance, modulent considérablement neuronal calcul. Pour étudier comment les différentes dynamiques cérébrales spontanées impact sur ​​les propriétés d&#39; intégration des neurones simples de, nous avons développé une nouvelle stratégie expérimentale chez le rat consistant à supprimer in vivo toute l&#39; activité cérébrale au moyen d&#39;une injection systémique d&#39;une forte dose de pentobarbital de sodium. activités corticales, surveillées en permanence par électrocorticogramme combinée (EcoG) et des enregistrements intracellulaires sont progressivement ralenties, conduisant à un profil isoélectrique stable. Cet état extrême du cerveau, en mettant le rat dans un état comateux profond, a été soigneusement contrôlée en mesurant les constantes physiologiques de l&#39;animal tout au long des expériences. r intracellulairesecordings nous a permis de caractériser et de comparer les propriétés d&#39;intégration du même neurone intégré dans la dynamique corticales physiologiquement pertinents, tels que ceux rencontrés dans le cycle veille-sommeil, et quand le cerveau était entièrement silencieux.

Induire et le maintien d&#39; un état ​​du cerveau isoélectrique est délicate in vivo procédure expérimentale. Il a été prouvé être un outil puissant pour étudier directement l&#39;impact de l&#39; activité du réseau cortical sur l&#39; excitabilité neuronale et la fonction de transfert 29. La figure 1 montre la surveillance multi-paramètres, y compris EcoG et des constantes vitales, de l&#39; état ​​physiologique de l&#39;animal avant (Figure...

Cette procédure effectue de longue durée des enregistrements intracellulaires in vivo de neurones isolés au cours des états cérébraux physiologiquement pertinents et après l&#39; abolition complète des activités électriques en cours, ce qui entraîne un état ​​du cerveau isoélectrique. Les constantes physiologiques de l&#39;animal sont soigneusement surveillés pendant la transition vers l&#39;état comateux artificiel.

Induction d&#39;un Etat isoélectrique cerveau chargé d&#39;enquêter sur l&#39;impact de l&#39;activité sur Endogène Synaptic Neuronal excitabilité<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

L'objectif général de ce protocole est d'induire un état général d'inactivité cérébrale in vivo afin d'étudier les propriétés intégrées de neurones individuels en l'absence d'entrées synaptiques. La méthode que nous présentons ici peut aider à répondre à des questions clés en neurophysiologie, telles que l'évaluation de l'impact de l'activité du réseau sur le calcul cellulaire unitaire ou l'étude de la réactivité des neurones dans des états comateux. Le principal avantage de cette technique est que les propriétés neuronales peuvent être étudiées isolément, indépendamment du réseau, dans une préparation in vivo intacte.Pour commencer cette procédure, placer un rat complètement anesthésié sur une couverture chauffante. Insérer une sonde rectale dans l'animal afin de maintenir la température centrale autour de 37 degrés Celsius. Pour placer un cathéter dans la cavité péritonéale afin de faciliter l'injection ultérieure d'agents anesthésiques, raser d'abord les poils recouvrant une petite zone du quadrant inférieur droit ou gauche de l'abdomen à l'aide d'une crème dépilatoire.Après l'injection de l'anesthésique local, stérilisez le site chirurgical et pratiquez une incision de deux à t

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