Trois dimensions technologie biomimétique: Roman Biorubber Crée Défini micro et macro-échelle Architectures en collagène hydrogels

L’objectif global de ce protocole est de concevoir des échafaudages de collagène tridimensionnels qui peuvent ressembler aux caractéristiques architecturales, à la composition et aux propriétés mécaniques des tissus in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire, telles que les interactions entre les cellules ECM, l’influence des caractéristiques architecturales dans la création de tissus modifiés et le développement de remplacements tissulaires, entre autres. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une procédure viable pour récapituler la microgéométrie des canaux et des voies d’écoulement intérieurs avec une haute fidélité dans un matériau biodégradable.

Veronica Rodriguez-Rivera, associée postdoctorale dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Les matériaux utilisés pour préparer le caoutchouc BSA doivent être stockés et conservés au froid jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi afin que le caoutchouc BSA ne durcisse pas prématurément. La stérilité est également très importante pour cette procédure.

Tout d’abord, stérilisez le distributeur. Dans une hotte de culture non cellulaire, disposez les joints toriques, la seringue, son capuchon, l’embout de mélange et le distributeur quatre pour un. Stérilisez ces matériaux par UV pendant 30 minutes.

Tout d’abord, vissez les deux pièces du moule en acier inoxydable ensemble et fixez le verrou Luer. Avant d’assembler le distributeur, vaporisez les pipettes et les réactifs avant de les introduire dans la hotte avec de l’éthanol à 70 %. Fixez d’abord le capuchon de l’embout au porte-solution.

Ensuite, chargez la solution à 30 % BSA dans la plus grande chambre sans contaminer l’autre chambre. Laissez suffisamment d’espace pour fixer le joint torique. Ensuite, chargez la plus petite chambre distributrice avec trois pour cent de glutaraldéhyde et fixez un autre joint torique.

Maintenant, fixez la seringue au distributeur. Inclinez ensuite l’ensemble de manière à ce que le capuchon soit sur le dessus et remplacez le capuchon par un embout mélangeur. Tapotez ensuite doucement les côtés pour permettre aux bulles d’air de se déplacer vers le haut.

Ensuite, placez le distributeur à l’intérieur d’un sac autoclavé pour contenir la solution d’échappement. Dans le sac, avec le distributeur à la verticale, versez une petite quantité de solution pour évacuer tout l’air de la seringue. L’évacuation de l’air est très importante.

Ensuite, fixez rapidement le verrou Luer du moule en Y en acier inoxydable à l’embout de la seringue. Maintenant, avec le moule dans votre main non dominante, alternez la solution d’éjection dans les échappements gauche et droit des canaux d’écoulement. Appuyez sur les échappements, remplissant ainsi les vides internes avec de la solution.

Ensuite, positionnez le moule horizontalement et injectez-le avec plus de solution jusqu’à ce que la moitié du volume du distributeur ait été utilisée. Le moule doit maintenant être placé dans un plat, enveloppé dans du parafilm et stocké à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Cette procédure est réduite à quatre grammes de collagène acidifié.

Gardez-le au frais jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Une fois le collagène pesé, procédez à la stérilisation de la solution par rayonnement gamma. En préparation, préparez une solution fraîche de HEPES 0,2 normale dans de l’eau.

Transférez ensuite le contenu dans un tube conique de 50 millilitres. Ajustez le pH à neuf à l’aide d’hydroxyde de sodium concentré. Assurez-vous de stériliser la cagoule aux UV et d’autoclaver la pince, la spatule et le scalpel.

Dans la hotte, mélangez 1,5 millilitres de la solution HEPES avec 1,5 millilitres de 10x MEM. Conservez ce mélange sur de la glace. De plus, refroidissez une assiette à 12 puits et une seringue de 20 millilitres au congélateur pendant 10 minutes.

Pour plus de stérilité, vaporisez les tubes et les plaques contenant de l’éthanol à 70 % avant de les placer dans le capot. Vaporisez la plaque du moule et placez-la dans la hotte. Ensuite, retirez les moules en caoutchouc BSA à l’aide d’une pince.

Ensuite, coupez les canaux d’échappement du moule à l’aide d’un scalpel. Ensuite, mélangez brièvement le mélange HEPES-MEM et ajoutez un millilitre au collagène. Ensuite, mélangez soigneusement la solution avec une spatule stérile.

Poursuivez avec un bref vortex et transférez rapidement la solution dans la seringue froide de 20 millilitres. Maintenant, tout en fixant le caoutchouc BSA à l’intérieur du puits, versez la moitié de la solution d’hydrogel de collagène dans le fond du puits. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, positionnez le moule de manière à ce que les extrémités d’entrée et de sortie du caoutchouc touchent les parois du puits.

Ensuite, couvrez le moule avec de l’hydrogel de collagène. Maintenant, scellez le puits avec du parafilm et chargez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Attendez une heure pour que le collagène polymérise.

Pendant ce temps, gardez la lumière UV dans la capuche allumée. Réglez également l’appareil de réticulation UV pour qu’il délivre 630 000 microjoules par centimètre carré. Maintenant, vaporisez vos mains gantées avec de l’éthanol à 70 %, chargez la plaque avec les moules recouverts de collagène dans le réticulant, et commencez le processus d’irradiation.

Après l’irradiation, vaporisez à nouveau vos gants et déchargez la plaque de l’agent de réticulation. Ensuite, à l’aide d’une spatule stérile, retirez le gel du puits, retournez-le et réticulez le fond de l’hydrogel. Après le dernier cycle de réticulation, procédez à la digestion enzymatique.

Pour retirer le caoutchouc BSA sans perturber l’échafaudage de collagène, utilisez une solution stérile de trypsine à 0,25 % à pH 7,8 et pressez-la à travers un filtre de 0,20 micron. Transférez suffisamment de solution de trypsine filtrée dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ensuite, transférez l’hydrogel de collagène dans le tube conique qui contient la solution enzymatique.

Assurez-vous que l’hydrogel est complètement recouvert de la solution. Scellez le tube avec du parafilm et agitez-le doucement pendant environ une minute. Ensuite, incubez le tube à 30 degrés Celsius et laissez la digestion se dérouler pendant 15 à 24 heures.

Pendant les quatre premières heures, retirez le tube toutes les 15 à 30 minutes et agitez-le doucement pour aider à terminer la digestion du caoutchouc BSA. Le lendemain, la digestion est considérée comme terminée lorsqu’aucun caoutchouc ne flotte dans la solution ou qu’il n’y a pas de morceaux de caoutchouc décomposés dans l’hydrogel. Maintenant, remplacez la solution de trypsine par une solution stérile de Mosconas et laissez le tube agiter à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Plus tard, aspirez la solution de Mosconas et répétez cette étape deux fois de plus pour nettoyer complètement l’échafaudage de collagène. Un grand nombre de tests ont été utilisés pour optimiser l’utilisation du biocaoutchouc et décrits en détail dans le protocole de texte. À l’aide du protocole optimisé et de trois pièces de moule solides, des hydrogels de collagène ont été fabriqués et examinés en détail.

Le moule en Y nécessaire a été fabriqué sur une machine Microlution. Le moule Y a été injecté avec 30 % de BSA et 3 % de glutaraldéhyde, qui ont réagi pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, le caoutchouc BSA a été coulé avec le collagène et chauffé à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Le caoutchouc a été digéré par des enzymes pendant 15 heures, ce qui l’a affaibli au point de tomber sans affecter la géométrie de l’hydrogel de collagène. Le canal d’entrée de quatre millimètres coulé par le moule a été mesuré avec des pieds à coulisse pour être précisément de quatre millimètres dans l’hydrogel de collagène. En testant la stabilité du moule, il a été constaté que des dimensions aussi petites que 300 microns pouvaient être conçues de manière fiable.

De plus, les échafaudages ont été testés pour détecter la présence de glutaraldéhyde résiduel après le lavage de Mosconas, et aucun résidu n’a été trouvé. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’échafaudages de collagène 3D avec le potentiel d’imiter les géométries in vivo. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes complémentaires à cette technique, telles que la création de modèles 3D de tissus in vivo et la fabrication de moules avec des caractéristiques architecturales spécifiques, peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie tissulaire pour explorer l’interaction entre les caractéristiques architecturales internes et les composants de la matrice avec les cellules dans des modèles in vitro.