Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

L’objectif global de ce protocole d’imagerie est de visualiser la dynamique des lymphocytes T CD4 positifs dans la peau enflammée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que : quels sont les mécanismes qui sous-tendent la motilité des cellules immunitaires et fonctionnent dans les tissus enflammés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre un moyen peu invasif d’étudier le comportement dynamique des lymphocytes T CD4 in situ.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de préparation de l’oreille pour l’imagerie sont difficiles à apprendre et un positionnement correct de l’oreille est nécessaire pour capturer des images de haute qualité. Je m’appelle Alison Gaylo, je suis étudiante aux cycles supérieurs, et je vais faire la démonstration de ce protocole. Commencez par aspirer 300 microlitres de suspension de lymphocytes T effecteurs marqués par fluorescence par souris dans une seringue équipée d’une aiguille de calibre 27 et demi.

Retournez ensuite l’aiguille de la seringue vers le haut et effleurez doucement la tige de la seringue, en déplaçant le piston de haut en bas si nécessaire pour éliminer les bulles. Lorsque les cellules sont prêtes, transférez les souris dans une cage propre et placez-les sous une lampe chauffante, jusqu’à ce que les veines de la queue soient vasodilatées. Transférez ensuite la première souris dans la contention et essuyez la queue avec un tampon imbibé d’alcool.

Après avoir identifié une veine caudale latérale, injectez lentement 200 microlitres de cellules dans la veine. Lorsque toutes les cellules ont été transférées, aspirez 50 microlitres d’émulsion complète de fluorescence dans une seringue à insuline de calibre 28 et demi et appuyez fermement sur le piston pour éliminer les grosses bulles d’air. Placez ensuite un dé à coudre sur l’index gauche et saisissez soigneusement l’oreille de la souris entre le pouce gauche et le dé à coudre, avec l’oreille ventrale vers le haut.

Ensuite, glissez l’aiguille, côté biseau vers le haut, dans le derme dans le tiers externe du pavillon, et légèrement décentrée, et injectez lentement dix microlitres d’émulsion dans le tissu. Après avoir injecté tous les animaux, surveillez les souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies. Trois jours après l’immunisation, vasodiler les veines de la queue des animaux injectés comme cela vient d’être démontré.

Après l’anesthésie, immobilisez la queue de la première souris à l’aide d’une paire de pinces. Essuyez la queue avec un tampon imbibé d’alcool, puis glissez soigneusement un cathéter à aiguille de calibre 30 et demi dans une veine latérale de la queue, en vérifiant la perméabilité en exerçant une légère pression sur le piston de la seringue. Lorsque le cathéter est en place, appliquez une à deux gouttes d’adhésif tissulaire cyanoacrylate sur le site d’injection et laissez l’adhésif sécher pendant environ 30 secondes.

Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez soigneusement les moustaches et les poils de l’arrière et des côtés de l’oreille. Ensuite, utilisez un coton-tige pour humidifier la surface interne de l’oreille avec du PBS. Ensuite, tournez la souris et aplatissez l’oreille injectée sur une lamelle en verre numéro un virgule cinq de 24 x 50 millimètres, jusqu’à ce qu’elle affleure le verre.

Épongez l’excès de PBS. Ensuite, à l’aide de deux paires de pinces incurvées, saisissez un morceau de ruban adhésif en tissu d’environ 20 millimètres de long dans le sens de la longueur dans le sens de la longueur dans les coins supérieurs, et placez le bas du ruban sur la gaine en haut de l’oreille de la souris. Roulez le ruban sur le reste de l’oreille, en repoussant l’excès de poils avec la pince si nécessaire, et utilisez un coton-tige sec pour appuyer doucement le ruban autour de l’oreille pour assurer une étanchéité étanche, en prenant soin de ne pas appuyer sur l’oreille elle-même.

Il est essentiel que l’oreille soit correctement collée à la lamelle avec une bonne étanchéité des deux côtés et avec un minimum de bulles d’air, car cela affectera la qualité des images qui peuvent être obtenues. Fixez maintenant une plate-forme d’imagerie au microscope fluorescent sur un bloc chauffant à 37 °C et appliquez de la graisse sous vide des deux côtés de la zone de l’oreille de la plate-forme. Faites pivoter la souris pour placer la housse sur la plate-forme en prenant soin d’aligner l’oreille au centre du feutre.

Lorsque l’oreille est en place, enclenchez le cône nasal de l’isoflurane dans le support sur la plate-forme, en vous assurant que le cône est bien fixé et en couvrant complètement le nez de la souris. Ensuite, à l’aide d’un coton-tige, appuyez fermement, mais soigneusement, sur la lamelle sur la plate-forme d’imagerie, en étalant la graisse sous la lamelle. Enroulez deux morceaux de 20 millimètres et deux morceaux de ruban adhésif plus longs autour de la partie supérieure de la plate-forme pour fixer le couvercle sur la plate-forme.

Ensuite, déplacez la souris sur la platine du microscope. Fixez la plate-forme avec plus de ruban adhésif et versez une double couche de graisse sous vide sur le couvercle autour de l’oreille. Enroulez ensuite une couverture chauffante remplie d’eau autour de la souris et remplissez le réservoir de graisse sous vide avec de l’eau distillée à 37 degrés Celsius.

Pour l’imagerie time lapse in vivo, commencez par positionner l’objectif au centre de l’oreille et abaissez-le jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la surface de l’eau dans le réservoir. Ensuite, à l’aide d’une source de lumière externe, abaissez lentement l’objectif jusqu’à ce que la surface de l’oreille devienne nette. Ensuite, abaissez les rideaux intérieurs et extérieurs autour de la platine du microscope et ajustez la longueur d’onde laser à 900 nanomètres dans la fenêtre du contrôleur laser MP, la puissance laser dans la fenêtre laser de réglage de l’acquisition et les tensions PMT dans la fenêtre de contrôle de l’acquisition d’image.

Dans les fenêtres de taille et de mode de réglage d’acquisition, réglez le microscope sur une résolution de cinq douze par cinq douze pixels, avec un temps de séjour de deux microsecondes par pixel, et sélectionnez Répétition XY pour activer un mode d’imagerie en direct pour le balayage du tissu. Une fois qu’un champ d’imagerie approprié a été localisé, localisez la cellule la plus haute dans le derme et cliquez sur le bouton Définir zéro pour régler la position Z à zéro. Faites défiler vers le bas dans la direction Z pour mesurer l’étendue de la profondeur de la cellule.

Réglez ensuite les positions de départ et d’arrivée dans la fenêtre du microscope de réglage de l’acquisition, et ajustez les tensions PMT de l’instrument et la puissance laser dans la fenêtre Z lumineuse pour optimiser la visualisation des cellules sur toute la profondeur du champ d’imagerie. Vérifiez les boutons de profondeur et de temps, puis définissez un filtre commun pour scanner l’image trois fois par ligne dans la fenêtre du mode de filtre de contrôle d’acquisition d’image. Ajustez la profondeur de la tranche Z dans la fenêtre du microscope d’acquisition d’images de sorte qu’il faille environ une minute pour capturer une pile complète, comme indiqué dans la fenêtre d’affichage temporel.

Ensuite, pour évaluer la stabilité du tissu, réglez le nombre de répétitions à cinq dans la fenêtre de balayage du temps de réglage de l’acquisition, puis cliquez sur le bouton de balayage pour capturer une image en accéléré de cinq minutes de la zone. Si le tissu est stable après cinq minutes, réglez le nombre de répétitions entre 30 et 45 dans la fenêtre de balayage du réglage de l’acquisition et collectez une image en accéléré de 30 à 45 minutes, en surveillant toute dérive mineure des tissus au fur et à mesure que l’image est collectée. Enregistrez l’image pré-anticorps dans le format approprié, puis prélevez le mélange d’anticorps dans une seringue à tuberculine d’un millilitre, en prenant soin d’éliminer toutes les bulles d’air.

Appuyez doucement sur le piston pour que la solution d’anticorps forme une gouttelette à l’extrémité de l’aiguille, et soulevez les rideaux autour de la scène pour localiser le cathéter. Remplacez la seringue PBS par la seringue d’anticorps, puis injectez lentement les anticorps dans le cathéter. Lorsque les anticorps ont été injectés avec succès, abaissez à nouveau les rideaux et notez l’heure de l’injection.

Ensuite, commencez immédiatement à collecter une nouvelle séquence d’imagerie de 20 à 40 minutes, au même endroit, en utilisant les mêmes paramètres de l’instrument que l’image pré-anticorps. Enfin, enregistrez le fichier d’image post-anticorps dans le format approprié et retirez soigneusement la souris de la scène du microscope, en surveillant l’animal jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. L’imagerie du derme de l’oreille intact par ce protocole facilite l’acquisition d’images à haute résolution et en accéléré de la dynamique des lymphocytes T effecteurs dans le derme enflammé.

Dans ce film, on peut observer les lymphocytes T effecteurs verts transférés adoptivement se déplacer dans tout le tissu dermique. Cependant, après l’administration d’anticorps bloquant l’antibêta un et l’antibêta trois à travers le cathéter, les cellules précédemment mobiles s’arrêtent dans le derme. Les cellules présentent une diminution de la vitesse moyenne après l’administration d’anticorps ainsi qu’une diminution significative de leur indice de méandre.

C’est-à-dire le rapport entre le déplacement total et la longueur totale de la voie. Les autofluorescents des follicules pileux, l’ombrage et les autofluorescents des cheveux sus-jacents, ainsi que les bulles d’air piégées entre la surface de l’oreille et la lamelle, peuvent tous conduire à des artefacts d’imagerie, qui obscurcissent la visualisation des lymphocytes T et interfèrent avec le logiciel d’analyse d’images automatisé. De plus, l’utilisation de plusieurs sources de chaleur peut causer des problèmes de stabilité des tissus, entraînant de grandes oscillations pendant l’imagerie qui rendent l’interprétation des résultats difficile.

Une fois maîtrisée, l’imagerie des lymphocytes T CD4 dans le derme peut être réalisée en deux à trois heures, si l’intervention a été effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de suivre les directives appropriées de soins et d’utilisation des animaux pour travailler avec des souris. Cette procédure peut être adaptée pour visualiser d’autres sous-ensembles de lymphocytes T ou types de cellules immunitaires dans l’oreille, en utilisant différents modèles d’infection ou différentes méthodes d’induction d’inflammation.

Après son développement, l’imagerie intravitale a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie pour explorer la dynamique des réponses immunitaires en cours chez les animaux vivants. N’oubliez pas que travailler avec un laser multi-phosphore peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles qu’un blindage approprié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire une inflammation dans le derme d’une oreille de souris, comment utiliser l’imagerie intravitale pour capturer des images en accéléré de l’activité des lymphocytes T CD4 avant et après l’administration d’anticorps.