Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

L'objectif général de ce protocole d'imagerie est de visualiser la dynamique des cellules T CD4 positives dans la peau enflammée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que les mécanismes sous-jacents à la motilité et à la fonction des cellules immunitaires dans les tissus enflammés. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle offre un moyen peu invasif d'étudier le comportement dynamique des cellules T CD4 in situ.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de préparation de l'oreille pour l'imagerie sont difficiles à apprendre, et un positionnement adéquat de l'oreille est nécessaire pour obtenir des images de haute qualité. Je suis Alison Gaylo, étudiante diplômée, et je vais effectuer la démonstration de ce protocole. Commencez par aspirer 300 microlitres de suspension de lymphocytes T effecteurs marqués de façon fluorescente par souris dans une seringue munie d'une aiguille de calibre 27 et demi.

Ensuite, retournez la seringue, l’aiguille vers le haut, et tapez doucement sur le corps de la seringue, en déplaçant le piston vers le haut et vers le bas selon les besoins pour éliminer toutes les bulles. Lorsque les cellules sont prêtes, transférez les souris dans une cage propre et placez-les sous une lampe chauffante jusqu’à ce que les veines de la queue soient vasodilatées. Puis, transférez la première souris dans le dispositif de contention et essuyez la queue avec un coton-tige imbibé d’alcool.

Après avoir identifié une veine latérale de la queue, injectez lentement 200 microlitres de cellules dans la veine. Une fois que toutes les cellules ont été transférées, aspirez 50 microlitres d'émulsion complète de fluorescéine dans une seringue à insuline de 28 et demi de calibre et appuyez fermement sur le piston pour éliminer toutes les grosses bulles d'air. Ensuite, placez un embout sur l'index gauche, puis saisissez délicatement l'oreille de la souris entre le pouce gauche et l'embout, en orientant la face ventrale de l'oreille vers le haut.

Ensuite, introduisez l'aiguille, côté biseau vers le haut, dans le derme au tiers externe du pavillon de l'oreille, légèrement en dehors du centre, puis injectez lentement dix microlitres d'émulsion dans le tissu. Après avoir injecté tous les animaux, surveillez les souris jusqu'à leur complète récupération. Trois jours après l'immunisation, dilatez les veines de la queue des animaux injectés comme vient de l'être démontré.

Après anesthésie, immobilisez la queue de la première souris à l’aide d’une paire de forceps. Essuyez la queue avec un coton-tige imbibé d’alcool, puis insérez prudemment un cathéter de 30 et demi gauge dans une veine latérale de la queue, en vérifiant la perméabilité par une légère pression sur le piston de la seringue. Une fois le cathéter en place, appliquez une à deux gouttes d’adhésif tissulaire cyanoacrylate sur le site d’injection et laissez sécher environ 30 secondes.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper soigneusement les vibrisses et les poils situés à l'arrière et sur les côtés de l'oreille. Puis, utilisez un coton-tige pour humidifier la surface interne de l'oreille avec du PBS. Tournez ensuite la souris et applatissez l'oreille injectée sur un coverslip en verre de 24 sur 50 millimètres, d'épaisseur numéro 1,5, jusqu'à ce qu'elle soit bien à plat contre le verre.

Éliminer l'excès de PBS par tamponnement. Ensuite, utiliser deux paires de pinces courbes pour saisir, aux coins supérieurs, un morceau de ruban adhésif d'environ 20 millimètres de long dans le sens de la longueur, puis poser le bord inférieur du ruban sur la lame couvre-objet située au sommet de l'oreille de la souris. Enrouler délicatement le ruban autour du reste de l'oreille, écartant avec les pinces les poils excédents si nécessaire, et utiliser un coton-tige sec pour appuyer doucement sur le ruban tout autour de l'oreille afin d'assurer un scellement étanche, en prenant soin de ne pas exercer de pression sur l'oreille elle-même.

Il est essentiel que l'oreille soit fixée correctement sur la lame à l’aide de ruban adhésif, avec un bon scellement des deux côtés et un minimum de bulles d’air, car cela influencera la qualité des images pouvant être obtenues. Fixez maintenant une plateforme d'imagerie fluorescente pour microscope sur un bloc chauffant à 37 degrés Celsius, et appliquez de la graisse à vide sur les deux faces de la zone de l'oreille de la plateforme. Tournez la souris afin de positionner la lame sur la plateforme, en prenant soin d'aligner l'oreille au centre du feutre.

Une fois l'oreille en place, insérez fermement le cône d'isoflurane dans le support situé sur la plateforme, en veillant à ce que le cône soit bien fixé et recouvre complètement le nez de la souris. Ensuite, utilisez un coton-tige pour appuyer fermement mais délicatement sur la lame couvre-objet afin de l'appliquer sur la plateforme d'imagerie, en répartissant la graisse à vide sous la lame. Enroulez deux morceaux de ruban adhésif de 20 millimètres et deux morceaux plus longs autour de la partie supérieure de la plateforme afin de fixer solidement la lame couvre-objet à la plateforme.

Ensuite, déplacez la souris sur la platine du microscope. Fixez la plateforme avec davantage de ruban adhésif, puis appliquez une double couche de graisse à vide sur la lame couvre-objet autour de l’oreille. Enveloppez ensuite la souris avec une couverture chauffante remplie d’eau, et remplissez le réservoir de graisse à vide avec de l’eau distillée à 37 degrés Celsius.

Pour l'imagerie par laps de temps in vivo, commencez par positionner l'objectif au-dessus du centre de l'oreille, puis abaissez l'objectif jusqu'à ce qu'il touche légèrement la surface de l'eau dans le réservoir. Ensuite, à l'aide d'une source lumineuse externe, abaissez lentement l'objectif jusqu'à ce que la surface de l'oreille soit mise au point. Abaissez alors les rideaux intérieur et extérieur autour de la platine du microscope, puis réglez la longueur d'onde du laser à 900 nanomètres dans la fenêtre du contrôleur laser à impulsions, la puissance du laser dans la fenêtre des paramètres d'acquisition du laser, et les tensions du PMT dans la fenêtre de contrôle d'acquisition d'image.

Dans les fenêtres de paramétrage de la taille et du mode d'acquisition, configurez le microscope sur une résolution de cinq cent douze par cinq cent douze pixels, avec un temps de séjour de deux microsecondes par pixel, et sélectionnez XY répétition afin d'activer un mode d'imagerie en direct pour balayer le tissu. Une fois qu'un champ d'imagerie approprié a été localisé, repérez la cellule la plus haute dans le derme, puis cliquez sur le bouton définir zéro pour régler la position Z à zéro. Faites défiler vers le bas dans la direction Z afin de mesurer la profondeur totale de la cellule.

Ensuite, définir les positions initiale et finale dans la fenêtre de réglage de l'acquisition du microscope, puis ajuster les tensions PMT de l'appareil et la puissance du laser dans la fenêtre Z claire afin d'optimiser la visualisation des cellules sur toute la profondeur du champ d'imagerie. Vérifier les boutons de profondeur et de temps, puis régler un filtre commun pour balayer l'image trois fois par ligne dans la fenêtre de mode de contrôle d'acquisition d'image. Ajuster la profondeur de coupe en Z dans la fenêtre d'acquisition d'image du microscope de manière à ce qu'il faille environ une minute pour capturer une pile complète, comme indiqué dans la fenêtre d'affichage du temps.

Ensuite, pour évaluer la stabilité du tissu, réglez le nombre de répétitions à cinq dans la fenêtre de paramétrage de l'acquisition temporelle et cliquez sur le bouton d'analyse pour capturer une image en laps de temps de cinq minutes de la zone. Si le tissu est stable après cinq minutes, réglez le nombre de répétitions entre 30 et 45 dans la fenêtre de paramétrage de l'acquisition temporelle et enregistrez une image en laps de temps de 30 à 45 minutes, en surveillant tout déplacement mineur du tissu pendant la collecte de l'image. Enregistrez l'image pré-anticorps dans le format approprié, puis aspirez le mélange d'anticorps dans une seringue tuberculinique d'un millilitre, en veillant à éliminer toutes les bulles d'air.

Appuyez doucement sur le piston afin que la solution d'anticorps forme une goutte à l'extrémité de l'aiguille, puis relevez les rideaux entourant la platine pour localiser le cathéter. Remplacez la seringue de PBS par celle contenant l'anticorps, puis injectez lentement les anticorps dans le cathéter. Une fois l'injection des anticorps terminée avec succès, rabaissez les rideaux et notez l'heure de l'injection.

Ensuite, commencez immédiatement à acquérir une nouvelle séquence d'images de 20 à 40 minutes, au même emplacement et avec les mêmes paramètres instrumentaux que l'image pré-anticorps. Enfin, enregistrez le fichier d'image post-anticorps dans le format approprié, retirez soigneusement la souris de la platine du microscope et surveillez l'animal jusqu'à son réveil complet. L'imagerie du derme auriculaire intact selon ce protocole permet d'obtenir des images en haute résolution et des séries temporelles des dynamiques des lymphocytes T effecteurs dans le derme enflammé.

Dans cette vidéo, les cellules T effectrices transférées adoptivement marquées en vert peuvent être observées en mouvement à travers le tissu dermique. Après l'administration d'anticorps bloquants anti-bêta un et anti-bêta trois entogrine par le biais du cathéter, cependant, les cellules précédemment mobiles s'immobilisent au sein du derme. Les cellules présentent une vitesse moyenne réduite après l'administration des anticorps, ainsi qu'une diminution significative de leur indice de méandrage.

Autrement dit, le rapport du déplacement total sur la longueur totale de la trajectoire. Les autofluorescences provenant des follicules pileux, les ombres et les autofluorescences des poils superposés, ainsi que les bulles d'air piégées entre la surface de l'oreille et la lame couvre-objet, peuvent toutes entraîner des artefacts d'imagerie, qui obscurcissent la visualisation des lymphocytes T et interfèrent avec le logiciel d'analyse d'image automatisé. De plus, l'utilisation de plusieurs sources de chaleur peut provoquer des problèmes de stabilité du tissu, entraînant de grandes oscillations pendant l'acquisition d'images et rendant l'interprétation des résultats difficile.

Une fois maîtrisée, l'imagerie des cellules T CD4 dans le derme peut être réalisée en deux à trois heures, si la procédure a été correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de respecter les lignes directrices appropriées sur les soins et l'utilisation des animaux lorsqu'on travaille avec des souris. Cette procédure peut être adaptée pour visualiser d'autres sous-populations ou types de cellules immunitaires dans l'oreille, en utilisant différents modèles d'infection ou différentes méthodes d'induction de l'inflammation.

Après son développement, l'imagerie intravitale a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie, leur permettant d'explorer la dynamique des réponses immunitaires en cours chez des animaux vivants. N'oubliez pas que le travail avec un laser multi-photons peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles qu'un blindage adéquat, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire une inflammation dans le derme de l'oreille d'une souris, ainsi que de l'utilisation de l'imagerie intravitale pour capturer des images en accéléré de l'activité des cellules T CD4 avant et après l'administration d'anticorps.