Name: Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez l'évaluation du fuseau méiotique dans les ovocytes de souris par silençage siRNA et immunofluorescence. Cette méthode permet d'étudier l'assemblage du fuseau et les mécanismes de ségrégation chromosomique.

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Cette recherche a été financée en partie par l’Université de Géorgie et une subvention (HD071330) des National Institutes of Health à MMV.

Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;Université de Géorgie. 1. Préparatifs <ol><li> Pour la culture de l&#39;ovocyte, l&#39;achat ou fraîchement préparer milieu essentiel minimal (MEM) et compléter avec 3 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) comme indiqué dans le tableau 1. Placez une bouteille de polystyrène sur une balance de chargement (de tare à zéro). Ajouter tous les réactifs, sauf BSA, dans l&#39;ordre et faire apparaître le volume final avec MQ-eau en poids pour un total de 250 g. Puis ajouter le BSA, laisser dissoudre et stériliser par filtration. Remarque: Le milieu MEM décrit nécessite l&#39;équilibrage et l&#39;incubation de la cellule avec un mélange de gaz à usage médical de 5% de CO 2, 5% d&#39;O 2 et 90% N 2. Cependant, d&#39;autres milieux (par exemple, CZB) peuvent être utilisés qui permettent une incubation des cellules dans 5% de CO 2 dans des conditions atmosphériques. </li><li> Pour ovocyte microinjection, acheter ou préparer le milieu M2. </li><li> Préparer pla gonadotrophine de sérum de jument régnante (PMSG) à une concentration de 5 UI / 100 ul. </li><li> Achat et reconstituer les stocks de siRNA à une concentration de travail de 1 uM. </li></ol> 2. Souris ovocytes Collection <ol><li> JOUR 1: Pour stimuler le développement du follicule ovarien et d&#39;augmenter le nombre de follicules pré-ovulatoire, administrer 5 UI de PMSG voie intrapéritonéale à des souris femelles 48 heures avant la collecte des ovocytes. </li><li> JOUR 3: Pour la collecte d&#39;ovocytes et culture, mis en place des boîtes de culture de 35 mm avec 3 ml de MEM / BSA additionné de 1 pg / ml milrinone. Cet inhibiteur de la phosphodiestérase maintient les ovocytes en prophase-je arrestation et prévient la dégradation de la vésicule germinale (GVBD). Equilibrer les boîtes de culture dans un mélange de gaz médicale pendant au moins 15 min. Note: Milrinone médias complété est nécessaire tout au long de la collecte des ovocytes, ainsi que la micro-injection d&#39;ovocytes et de la culture 24 heures cale période post siRNA. </li><li> Récupérer les ovaires de souris femelles utilisant laboratoire établi des pratiques 15 et transférer à une nouvelle boîte de culture avec préchauffé et équilibrée MEM / BSA / milrinone. </li><li> Placez la boîte de culture sur la scène d&#39;un stéréomicroscope pour la collecte d&#39;ovocytes. Sortie cumulus-ovocytes complexes (COC) en perforant manuellement les follicules antraux avec 27 g d&#39;aiguilles. Fixer un ovaire au fond de la boîte de culture, avec une aiguille 27 G fixée à une seringue de 1 ml, et en utilisant une seconde aiguille pour perforer tous les grands follicules. Répétez l&#39;opération pour chaque ovaire. </li><li> En utilisant des procédures bouche de pipetage standard ou d&#39;autres moyens de l&#39;aspiration des ovocytes, de collecter toutes les ovocytes qui sont entourés par 2 ou plusieurs couches de cellules du cumulus compacts. Transférer le COC à un nouveau plat et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Retirez délicatement les cellules du cumulus environnants par un léger pipetage répété avec une pipette de 1 ml réglé sur un volume d&#39;aspiration de 750 pi. Répétez l&#39;étape de pipetage environ 12 foiset permettent de récupérer les ovocytes pendant 5 min. Continuer de cette manière jusqu&#39;à ce que la totalité ou la plupart des cellules cumulus ont été supprimés. Transférer les ovocytes dénudés à une autre boîte de culture et de permettre à l&#39;équilibre à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Allouer les ovocytes dénudés en trois groupes expérimentaux à être utilisés pour: (i) la micro-injection de siRNA spécifiques contre la cible d&#39;intérêt, (ii) la micro-injection de non spécifiques (contrôle) siRNA, et (iii) un groupe de contrôle non-injecté pour tenir compte de des conditions de culture. </li></ol> 3. ovocytes microinjection <ol><li> Mettre en place des boîtes de culture de 3 ml de milieu M2 additionné de milrinone (1 ug / ml) pendant ovocytes micro-injection. Préparer des plats de culture contenant MEM / BSA / milrinone pour le lavage et la culture subséquente de ovocytes injectés. Remarque: le milieu M2 contient tampon Hepes et nécessite le préchauffage à 37 ° C pendant 15 min dans des conditions atmosphériques. MEM exige pré-réchauffement et l&#39;équilibre en utilisant des gaz médicaux comme décritD ci-dessus. </li><li> Préparer le système de micro-injection. Charger l&#39;aiguille d&#39;injection de 5 ul d&#39;une solution de siRNA spécifique de 1 uM. Fixez la pipette de maintien et aiguille d&#39;injection micromanipulateurs du système de micro-injection et mettre en place l&#39;unité d&#39;injection avec le volume et la pression calibrée. </li><li> Placez un 200 pi micro-goutte de M2 ​​médias sur l&#39;intérieur du couvercle d&#39;une boîte de culture de 3 cm et d&#39;ajouter un ovocyte pour mettre en place et l&#39;alignement du système de micro-injection. </li><li> Utilisation de l&#39;ovocyte comme un guide, ajuster les positions de l&#39;exploitation et injection aiguilles. Appliquer une pression négative à la pipette de maintien pour fixer doucement l&#39;ovocyte et ajuster la position de l&#39;aiguille d&#39;injection pour le diamètre le plus large de la cellule. Modification des réglages pour permettre à la micro-injection de 10 pl environ de la solution de siRNA n&#39;importe où dans le cytoplasme de l&#39;ovocyte. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figure 1. ovocytes microinjection mis en place. ( <strong&gt; A) Représentant l&#39;image d&#39;un 200 pi micro-goutte de M2 médias placé sur le couvercle d&#39;une boîte de culture de 3 cm, avec l&#39;aiguille de pipette de maintien et d&#39;injection positionné sur la gauche et la droite, respectivement. (B) Groupe de la prophase-je arrêté ovocytes (GV-scène) avant microinjection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> </li><li> Retourner le couvercle à l&#39;étape de la loupe binoculaire et ajouter un pl 200 micro-goutte de support M2 frais. Ajouter un groupe d&#39;ovocytes (~ 10) pour la micro-goutte par voie orale pipetage, ou d&#39;autres méthodes, puis retourner le couvercle à micro-goutte à la phase de la micro-injection. <ol><li> Passez à la micro-injection des ovocytes individuels. Fixer un ovocyte avec la pipette de maintien, insérez-la délicatement la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection dans le cytoplasme et expulser le volume d&#39;injection de solution siRNA. Rétracter délicatement l&#39;aiguille d&#39;injection et move de l&#39;ovocyte injecté à une position au fond de la micro-goutte. Déplacez ovocytes injectés en vain à une position au sommet de la micro-goutte. </li><li> Répétez la procédure de micro-injection avec chaque ovocyte. Pour maintenir la viabilité des ovocytes optimale, micro-injection seulement un petit nombre d&#39;ovocytes à la fois. Assurez-vous que ce processus ne prend pas plus de quelques minutes pour éviter température et de pH des changements dans la micro-goutte. </li></ol></li><li> Aspirer injecté avec succès ovocytes ou déplacer le couvercle avec précaution avec le micro-goutte de ovocytes injectés à la loupe binoculaire. Transférer les ovocytes viables injectés par pipetage à la bouche ou des méthodes alternatives, à MEM / BSA moyen / milrinone à laver et équilibrer à 37 ° C. </li><li> Utilisation d&#39;un autre groupe d&#39;ovocytes, répétez le processus de micro-injection avec une nouvelle aiguille d&#39;injection chargé avec des ARNsi non spécifiques pour le groupe de contrôle. Laver les ovocytes dans MEM / BSA / milrinone et transfert à une boîte de culture distincte. </li><li> Culture tous les groupes deovocytes pendant 24 heures dans du MEM / BSA / milrinone à 37 ° C sous une atmosphère de gaz médical. Remarque: La période de culture «bloc de milrinone &#39;est nécessaire pour cible efficace ARNm / protéine épuisement. </li></ol> 4. Culture pour la maturation des ovocytes Meiotic <ol><li> JOUR 4: Pour chaque groupe expérimental d&#39;ovocytes mis en place 4 boîtes de culture (35 mm) avec 3 ml de MEM / BSA. Compléter un plat de médias par groupe avec 10% (de haute qualité) de sérum fœtal bovin (FBS) à utiliser pour la maturation des ovocytes. Permettre à tous les plats de culture pour équilibrer à 37 ° C avec un mélange de gaz médicaux. </li><li> Pour libérer des ovocytes à partir de &#39;bloc de milrinone&#39;, successivement laver les ovocytes à trois reprises dans les plats contenant MEM / BSA et ensuite transférer les ovocytes à l&#39;antenne de la maturation des milieux contenant 10% de FBS. Culture tous les groupes d&#39;ovocytes pendant 17 heures à 37 ° C, afin de permettre la reprise et la progression de la méiose. </li><li> Jour 5: Préparer des solutions pour ovocyte fixation, y compris: (i) 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du tampon PEM (100 mM de PIPES [pH 6,9], 1 mM de MgCl2, 1 mM d&#39;EGTA) avec 0,5% de Triton-X 100, et (ii) du PBS additionné de 5 FBS% qui seront utilisés à laver et à bloquer les ovocytes. Note: Ces solutions nécessitent préchauffage à 37 ° C avant l&#39;ovocyte fixation. </li><li> Pour la fixation de l&#39;ovocyte (après la culture de 17 h), rapidement transférer chaque groupe expérimental d&#39;ovocytes par pipetage à la bouche ou des méthodes alternatives dans des puits individuels (d&#39;un plat 4 puits) contenant 750 pi de pré-chauffé solution PFA 4% et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Par la suite laver chaque groupe d&#39;ovocytes 3 fois (15 minutes chacune) dans 750 ul de PBS préchauffé contenant 5% de FBS. </li><li> Ovocytes de bloc dans 200 pi de PBS / 5% de FBS O / N à 4 ° C pour minimiser les anticorps non spécifique contraignant. </li></ol> 5. Analyse d&#39;immunofluorescence <ol><li> JOUR 6: Note: immunocoloration est réalisée dans une plaque multi-puits et la OOCytes sont transférées en série dans les puits séquentielles, contenant des solutions d&#39;anticorps et de lavage respectifs. Soit 48 ou plaques à 96 puits peuvent être utilisés, il suffit de régler le volume de solution basée sur la taille bien. Pour les plaques à 96 puits en utilisant 200 pi par puits. Les ovocytes sont transférés vers les différentes solutions dans l&#39;ordre suivant: solution d&#39;anticorps primaire - 3 puits de lavage - solution d&#39;anticorps secondaire - 3 puits de lavage. Pour limiter l&#39;exposition de lumière la plaque peut être recouvert d&#39;une feuille. Préparer une solution fraîche PBS / 5% de FBS et utiliser cette solution pour préparer des dilutions d&#39;anticorps (par exemple, de lapin anti-pericentrin (1/1000), de souris anti-tubuline (1/1000)). </li><li> Transférer les ovocytes fixes de chaque groupe expérimental à chaque puits contenant 200 pi (100 pi ou, si l&#39;on souhaite moins de volume) de la solution d&#39;anticorps primaire et couvrir le puits avec du parafilm. Incuber selon les conditions spécifiques d&#39;anticorps optimales (par exemple, 37 ° C pendant 1 heure, ou 4 ° CO / N). Remarque: dilutio d&#39;anticorps primairen ainsi que le temps d&#39;incubation spécifique et la température exigent des tests pour déterminer les conditions optimales pour différents anticorps utilisés. </li><li> Après incubation avec l&#39;anticorps primaire, laver les ovocytes trois fois dans du PBS / 5% de FBS (10 à 15 min chacun). </li><li> Transférer les ovocytes dans la solution contenant des anticorps secondaires conjugués par fluorescence (par exemple, 1 / 1.000 dilution d&#39;anticorps anti-lapin et anti-souris conjugués avec des fluorochromes de longueurs d&#39;onde différentes). Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Laver les ovocytes trois fois dans du PBS / 5% de FBS (10 - 15 min chacun). </li><li> Après l&#39;étape de lavage final, transférer les ovocytes sur une lame de verre propre et doucement aspirer toute solution de lavage en excès. Cela immobiliser les ovocytes sur la surface du verre. Ajouter 8 pi de milieu (contenant DAPI) montage et superposer avec soin les supports de montage avec un 22 mm x 22 mm lamelle. Abaissez la lamelle lentement pour éviter les bulles d&#39;air et / ou d&#39;endommager les ovocytes. Remarque: vous pouvez, pour maintenir les propriétés 3-dimensionnelles de l&#39;ovocyte pour l&#39;analyse de la microscopie confocale, ajouter un petit volume de 100 perles de verre de um (mixtes avec de la gelée de pétrole) sur les coins de la lamelle avant de monter sur la diapositive. </li><li> Stocker les lames à 4 ° C, ou de procéder à l&#39;évaluation de la progression de la méiose, ainsi que l&#39;analyse des niveaux d&#39;expression et la localisation subcellulaire des protéines en utilisant un microscope à fluorescence équipé des filtres nécessaires pour correspondre aux anticorps secondaires utilisés. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à révéler

Bien qu&#39;il existe plusieurs méthodes pour le transfert d&#39;acide nucléique exogène dans des cellules somatiques, telles que l&#39;électroporation et la transfection, micro-injection est le procédé optimal pour la livraison de molécules d&#39;ARN dans des ovocytes de souris transcriptionnellement quiescentes. Le protocole actuel fournit une approche efficace pour déplétion in vitro des ARNm spécifiques qui permettent des tests fonctionnels de la broche différente et / ou des facteurs de MTOC-associé dans l...

La méiose est un processus de division unique qui se produit dans les gamètes (spermatozoïdes et les ovocytes) et comporte deux divisions successives sans intervenir la synthèse d&#39;ADN à séparer les chromosomes homologues et des chromatides sœurs cours de la méiose et de la méiose-I-II, respectivement 1. Erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la division de la méiose dans les ovocytes peuvent résulter de l&#39;aneuploïdie, qui est héritée par l&#39;embryon lors de la fécondation. Notamment, l&#39;incidence de l&#39;aneuploïdie dans les embryons en développement augmente avec l&#39;âge de la mère et est une cause majeure de malformations congénitales ainsi que la perte de la grossesse chez les femmes 1,2, donc, soulignant un besoin important de comprendre la base moléculaire de l&#39;aneuploïdie lors de la division de la méiose . Au cours de la division cellulaire, la ségrégation des chromosomes dépend essentiellement de l&#39;assemblage de l&#39;appareil de la broche de microtubules et l&#39;établissement d&#39;interactions chromosomiques-microtubules stables pour la fixation correcte de la broche opposéepôles. Surtout, la formation du fuseau méiotique dans des ovocytes de mammifères diffère de la mitose dans les cellules somatiques, et est régie par les centres de microtubules organisation uniques (MTOCs) qui manquent centrioles 3,4. Protéines essentielles nécessaires à la nucléation des microtubules et l&#39;organisation localisent à MTOCs d&#39;ovocytes, y compris γ-tubuline qui catalyse l&#39;assemblage des microtubules. En outre, pericentrin fonctionne comme une protéine d&#39;échafaudage essentiel, qui se lie et les ancrages y-tubuline, ainsi que d&#39;autres facteurs en MTOCs 5. En particulier, nos études montrent que l&#39;épuisement des protéines clés associés perturbe MTOC-organisation de fuseau méiotique et conduit à des erreurs de ségrégation des chromosomes dans les ovocytes qui ne sont pas complètement résolus par le point de contrôle de montage de broche (SAC) 6,7. Par conséquent, les défauts de stabilité broche, qui ne déclenchent pas arrêt de la méiose, représentent un risque important en contribuant à l&#39;aneuploïdie. Malgré leur rôle essentiel dans l&#39;assemblage de broche et de l&#39;organisation, prot ovocyte de MTOCcomposition et la fonction ein reste mal comprise. Test de la fonction des protéines cibles spécifiques dans des ovocytes de mammifères est difficile, car les cellules deviennent la transcription de repos peu avant la reprise de la méiose 8,9. Par conséquent, les ovocytes pré-ovulatoire comptent sur ​​les magasins d&#39;ARNm maternels de reprendre la méiose et soutiennent division méiotique ainsi que les premières divisions de clivage après la fécondation 10,11. L&#39;efficacité de l&#39;interférence ARN (ARNi) la dégradation médiée par des transcrits d&#39;ARNm dans les ovocytes de mammifères est bien établie et ARN maternels recrutés pour la traduction lors de la maturation méiotique se prêtent particulièrement bien à siRNA ciblant 12-14. Par conséquent, la micro-injection de courts ARN interférents (siRNA) dans des ovocytes fournit une approche valable pour épuiser ARNm cibles pour le test fonctionnel. Ici, nous décrivons les méthodes pour l&#39;isolement des ovocytes de souris et l&#39;épuisement des siRNA médiation de transcri spécifiquepts pour tester la fonction d&#39;une protéine associée MTOC essentielle, pericentrin. En outre, nous décrivons des conditions d&#39;analyse par immunofluorescence pour évaluer la formation du fuseau méiotique dans les ovocytes.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gonadotrophine sérique de jument enceinte (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Recette décrite dans le tableau 1</td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée Earle’s (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Acide pyruvique, sel de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline G, sel de potassium</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sel disodique dihydraté</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés essentiels (50x)</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Mélange de vitamines (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rouge de phénol</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Média avec Hepes</td>Les siRNA <td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>ciblant Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>les siRNAs de contrôle négatif&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (solution à 16 %)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrine (lapin)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubuline acétylée (souris)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti -souris Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Major Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Fluorescent Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de micro-injections Femtojet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-manipulateurs</td><td>Eppendorf</td> Aiguilles de micro-injection Eppendorf <td></td><td></td></tr><tr><td>(femtotips)</td>Pipettes <td>de maintien 930000035</td><td></td> <td>Eppendorf</td></tr><tr><td>(VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</strongBoîtes</td> de culture ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>plaques 4 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 96 puits</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm Système de filtration CA</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage sirna médiation

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Les erreurs de ségrégation des chromosomes lors de la division méiotique dans les gamètes peuvent entraîner une aneuploïdie qui est ensuite transmise à l’embryon lors de la fécondation. L’aneuploïdie qui en résulte chez les embryons en développement est reconnue comme une cause majeure de perte de grossesse et de malformations congénitales telles que le syndrome de Down. La ségrégation précise des chromosomes dépend de manière critique de la formation de l’appareil du fuseau des microtubules, mais ce processus reste mal compris chez les ovocytes de mammifères. Curieusement, l’assemblage du fuseau méiotique diffère de la mitose et est régulé, au moins en partie, par des centres d’organisation des microtubules uniques (MTOC). L’évaluation des protéines associées au MTOC peut fournir des informations précieuses sur les mécanismes de régulation qui régissent la formation et l’organisation du fuseau méiotique. Ici, nous décrivons des méthodes pour isoler les ovocytes de souris et épuiser les protéines associées au MTOC en utilisant une approche médiée par siRNA pour tester la fonction. De plus, nous décrivons les conditions de fixation des ovocytes et d’analyse d’immunofluorescence pour évaluer la formation et l’organisation du fuseau méiotique.

La micro-injection de siRNA offre une approche efficace pour la dégradation de l&#39;ARNm et de protéine ultérieur épuisement dans des ovocytes, ce qui permet des tests fonctionnels efficace et hautement spécifique de différents facteurs cibles in vitro. Par la suite, l&#39;immunofluorescence est utilisée pour l&#39;analyse du phénotype spécifique, ainsi que pour valider protéine épuisement dans des ovocytes injectés de siARN. Dans l&#39;exemple actuel, le marquage fluorescent des ovocytes individuels avec DAPI...

Ici, nous présentons un protocole de l&#39;épuisement de l&#39;ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d&#39;une analyse d&#39;immunofluorescence pour évaluer l&#39;assemblage du fuseau méiotique et de l&#39;organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l&#39;appauvrissement de produits de transcription in vitro et l&#39;évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la formation et l'organisation du fuseau mitotique dans les cytes suite à l'épuisement médié par irna de protéines clés associées aux MTOC, telles que la perrine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie de la reproduction, telles que les mécanismes régulant la ségrégation des chromosomes et les perturbations potentielles menant à l'aneuploïdie dans tous les sites. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet un abaissement efficace des transcrits et une analyse par immunofluorescence spécifique de cytes individuels.Cette procédure peut également être adaptée pour étudier presque toute protéine cible. Quarante-huit heures avant le jour de la collecte, traitez les souris femelles utilisées pour la collecte des ovocytes avec cinq unités internationales de PMSG injectées par voie intrapéritonéale. Après avoir prélevé les ovaires selon les pratiques habituelles, transférez-les dans une boîte contenant un milieu MEM préchauffé et équilibré, enrichi en BSA et en milréone, et préparez-vous à isoler les ovocytes au microscope stéréoscopique. Libérez les complexes cumulus-ovocyte ou CCO en fixant un ovaire au fond de la boîte de culture à l’aide d’une aiguille de calibre 27, puis percez les follicules antraux à l’aide d’une seconde aiguille, en utilisant une aspiration des ovocytes ou une pipetage buccal standard.Prélevez les ovocytes entourés par deux couches ou plus de cellules du cumulus compactes. Transférez ces COC dans une nouvelle boîte contenant un milieu M-E-M-B-S-A doux et incubez-les pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, procédez au dénudage des ovocytes en utilisant des méthodes standard.Préparez la boîte de culture pour injection avec trois millilitres de milieu M two contenant un microgramme par millilitre de milone. Préparez également les boîtes de lavage et de culture avec du M-E-M-B-S-A milone. Ensuite, chargez cinq microlitres de la solution d'INA à une millimolaire dans l'aiguille d'injection et mettez-la en place pour la microinjection.Placez maintenant une goutte de 100 microlitres de milieu M2 sur le couvercle d'une boîte de 3 centimètres de diamètre. Chargez un ovocyte dans la goutte et utilisez-le pour ajuster la position de la pipette de maintien. Fixez le site OAS en l'attachant à la pipette de maintien à l'aide d'une pression négative.Ensuite, ajustez la position de l'aiguille d'injection au diamètre maximal de l'ovocyte. Une fois en position, injectez environ 10 picolitres de solution dans le cytoplasme de l'ovocyte, en évitant le noyau. Remettez le couvercle sur la platine du microscope stéréo et ajoutez 100 microlitres de milieu M deux frais.Placer environ 10 cytes dans le milieu. Ensuite, sur la platine de micro-injection, procéder à la micro-injection. Fixer chaque ovocyte à l’aide de la pipette de maintien et insérer lentement l’aiguille d’injection dans le cytoplasme.Injecter la solution d'ARNi S et retirer soigneusement la pipette d'injection. Déplacer les cytes correctement injectés à une extrémité de la goutte et les cytes non injectés ou mal injectés à l'extrémité opposée. L'injection de 10 cytes ne devrait prendre que quelques minutes, ce qui est essentiel pour maintenir leur viabilité.Déplacez le couvercle sur la platine du microscope stéréo et transférez toutes les cellules correctement injectées dans une boîte de M-E-M-B-S-A Mel préalablement équilibrée à 37 degrés Celsius. Transférez les cytes dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous atmosphère de gaz médical et incubez pendant 24 heures. Commencez par libérer les cytes du bloc mil reone en lavant les cellules trois fois dans du M-E-M-B-S-A.Ensuite, transférez les cytes dans un milieu de maturation contenant un milieu de culture avec 10 % de SFB. Incubez les cellules pendant 17 heures à 37 degrés Celsius. Ainsi, la méiose reprendra le lendemain.Fixer les cytes. Utilisez l'aspiration de cytes ou la pipetage buccal pour transférer rapidement les différents groupes expérimentaux dans les puits de plaques à quatre puits contenant 750 microlitres de PFA 4 % préchauffé. Laissez les cytes incuber pendant une heure ensuite.Laver chaque groupe trois fois avec 750 microlitres de PBS réchauffé contenant 5 % de FBS. Chaque lavage doit durer 15 minutes dans l'incubateur, puis bloquer chaque groupe de sites O dans 5 % de FBS dans BS. Laisser le blocage se poursuivre toute la nuit à quatre degrés Celsius avant l'immunomarquage. Utiliser une rangée de huit puits sur la plaque multi-puits pour chaque groupe expérimental de cytes.4 plaques de 96 puits contiennent 200 microlitres de solution par puits. Commencez le processus de coloration avec une solution d'anticorps primaire fraîchement préparée. Ensuite, recouvrez les puits de parafilm et incubez les cellules selon les spécifications de l'anticorps après l'ajout de l'anticorps primaire.Lavez les cytes trois fois avec du PBS contenant 5 % de FCS, pendant 10 à 15 minutes par lavage. Après les trois lavages, transférez les cytes dans un puits contenant la solution d'anticorps secondaire. Recouvrez ces puits avec du paraforme.Incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis laver trois fois comme précédemment. Une fois lavées, transférer les ovocytes sur des lamelles en verre propres. Tous les ovocytes d'un groupe expérimental sont transférés sur une seule lamelle.Aspirez toute solution excédentaire pour immobiliser les cellules et ajoutez immédiatement huit microlitres de dappy contenant le milieu de montage. Ensuite, couvrez et faites glisser délicatement pour éviter les bulles d’air ou les dommages aux cellules. Après 17 heures de culture, les cellules ayant subi une microinjection avec un ARN interférent contrôle non spécifique ou un ARNi contre perrin ont été observées : la plupart des contrôles avaient atteint le stade de métaphase II et présentaient des fuseaux mitotiques organisés avec des chromosomes alignés. La marque de perrin, montrée en rouge, était intense et bien localisée aux pôles du fuseau.Les ARN messagers ont été efficacement inhibés, car la coloration perrin dans les cellules injectées avec l'ARNi n'a pas été détectée. La majorité de ces ovocytes sont restés en métaphase I et présentaient des structures de fuseau désorganisées avec des chromosomes mal alignés. Quelques-uns ont progressé jusqu'à la métaphase II, mais présentaient également des fuseaux altérés.Vous devriez maintenant bien comprendre comment recueillir et micro-injecter des cytes de souris avec un ARNi spécifique, puis réaliser une coloration immunohistochimique de ces cytes en vue d'une analyse en fluorescence de la formation et de l'organisation du fuseau. Il est important de se rappeler de travailler rapidement et avec beaucoup de soin afin de préserver la viabilité et la qualité des cytes.

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Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

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Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

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