Name: Génération dun humanisé Drosophila S2 Cell Line Sensible à pharmacologique inhibition de Kinesin-5 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Découvrez la génération d'une lignée cellulaire S2 de Drosophila sensible aux inhibiteurs de la kinésine-5 pour étudier la correction des erreurs lors de la division cellulaire. Cette méthode permet l'imagerie en temps réel des dynamiques du fuseau mitotique.

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Nous tenons à remercier Patricia Wadsworth pour le don de la kinésine-5 construction. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (5 R01 GM107026) de TJM et par une subvention de recherche n ° 5 FY13-205 de la Mars de Dimes Foundation de TJM, ainsi que le soutien de la Fondation Charles H. capot, Inc., Boston, MA. à TJM

1. Les cellules transfectant S2 <ol><li> Du précédemment cultivées 25 cm 2 flacon, ajouter cellules GFP-a-tubuline exprimant S2 10 jusqu&#39;à un volume final de 2 ml à 100% de confluence, et leur permettre de semi-adhérer au fond d&#39;une boîte de culture tissulaire de 35 mm pour environ 1 h. </li><li> Retirez le support de l&#39;antenne. Transfecter 2 pg de l&#39;Eg5-mCherry construire 11 avec 1 ml de médias de Schneider complété avec 10% de FBS (appelé ci-après les médias Schneider) et réactif de transfection, en suivant le protocole du fabricant. Sceller le plat avec du Parafilm et incuber les cellules à 25 ° C pendant 16-18 h. </li><li> Ajouter 1 ml de médias de Schneider. Retour cellules à 25 ° C incubateur. </li><li> Au jour 3 post-transfection, transférer 500 pi de cellules transfectées dans une nouvelle boîte de culture de tissu de 35 mm contenant 1,5 ml de médias de Schneider pour une induction de test. Induire l&#39;expression de Eg5-mCherry en ajoutant CUSO4 </sub&gt; à une concentration finale de 500 uM. Sceller le plat dans Parafilm et incuber à 25 ° CO / N. </li><li> Lamelle de faire des lamelles de concanavaline A-enduit, pipette un volume suffisant de concanavaline Une solution (0,5 mg / ml dissous dans H 2 O) pour enrober un acide lavé, enlever l&#39;excès, et de permettre la lamelle à l&#39;air sec. </li><li> Placer un 22 mm x 22 mm concanavaline A-revêtu lamelle dans une boîte de 35 mm pour culture de tissu propre, puis ensemencer 500 ul à 100% de confluence des cellules induites sur la lamelle couvre-objet et de permettre aux cellules d&#39;adhérer pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Pour vérifier l&#39;expression Eg5-mCherry, assembler la lamelle dans une chambre de rose (ou navire d&#39;imagerie approprié) avec les médias pour l&#39;imagerie à la TA sur un microscope à fluorescence. Utilisez des sources lumineuses appropriées et jeux de filtres pour visualiser les cellules. Par exemple, le microscope utilisé dans cette étude a une source de lumière blanche LED et EGFP (FITC / Cy2) et DsRED (TRITC / Cy3) cubes de filtre. Eg5-mCherry localise aux microtubules et est enrichi de l&#39;AENpôles du fuseau r. </li><li> Après avoir vérifié que les cellules expriment à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline, transférer le reste des cellules non induites, transfectées à un 25 cm flacon de culture de tissu contenant 2 4 ml de médias de Schneider. </li><li> Ajouter Blasticidin S HCL à une concentration finale de 25 pg / ml dans le flacon de cellules transfectées et continuer fractionnement en présence de ml de HCl S 25 de pg / Blasticidin jusqu&#39;à la mort de la cellule cesse d&#39;être sûr de vérifier pour l&#39;expression de Eg5-mCherry périodiquement. Incuber les lignées cellulaires de 25 ° C incubateur. NOTE: Le pourcentage de cellules exprimant des augmentations Eg5-mCherry au fil du temps. </li><li> Une fois que les cellules sont transfectées de façon stable, continuer à diviser en l&#39;absence de médicaments et de geler 12 cellules pour une utilisation future. </li></ol> 2. Interférence ARN <ol><li> Amplifier par PCR une région de 500 pb ~ de Klp61F à partir d&#39;ADNc (LD15641) en utilisant une amorce avec une séquence de promoteur T7 supplémentaire (séquence fournie dans la liste des matériaux) pour êtreutilisé comme matrice pour la synthèse d&#39;ARNdb. <ol><li> Mettre en place quatre réactions de PCR, 50 ul, contenant chacune 100 ng d&#39;ADN matrice, 25 uM de chaque amorce, un tampon approprié, et la polymérase. Réglez le protocole de PCR sur le thermocycleur selon le protocole du fabricant de la polymerase. </li><li> Piscine et quatre réactions PCR nettoyer avec un PCR nettoyer kit selon le protocole du fabricant. Stocker le modèle propre à -20 ° C. </li></ol></li><li> Préparer l&#39;ARN double brin (ARNdb) à partir du modèle en utilisant un kit de transcription de l&#39;ARN de T7, suivant les instructions du fabricant. Attendez ~ concentration 5-15 mg / ml d&#39;ARN double brin. ARNdb stocker à -20 ° C. </li><li> Pour Knockdown Klp61F avec ARNdb, permettent aux cellules S2 exprimant Eg5-mCherry à 25% de confluence à semi-adhèrent au fond d&#39;un plat de culture de tissu de 35 mm pendant 1 heure. </li><li> Retirez le support de la vaisselle et ajouter 5 ug d&#39;ARN double brin contre Klp61F (Drosophila kinésine-5) dilué dans 1 ml de Schneider sans sérum »s médias. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 1 h, puis ajouter 1 ml de médias de Schneider avec 10% de FBS. Incuber les cellules à 25 ° C. </li><li> 24 h après le traitement ARNdb, induire l&#39;expression de Eg5-mCherry en ajoutant CuSO 4 à une concentration finale de 500 uM. Incuber les cellules à 25 ° C pendant encore 24 h. </li></ol> 3. imagerie de cellules vivantes <ol><li> Placez un 22 mm x 22 mm concanavaline A lamelle enrobée dans une boîte de 35 mm de culture de tissu propre. </li><li> Seed 500 pi des cellules qui ont été traitées avec l&#39;ARN double brin et induits O / N sur la concanavaline A lamelle enduit et de leur permettre d&#39;adhérer pendant environ 1 h. </li><li> Assemblez la lamelle dans une chambre de rose (ou navire approprié) pour l&#39;imagerie. </li><li> Trouver les cellules en mitose exprimant à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline. REMARQUE: Les cellules mitotiques exprimant seulement GFP-α-tubuline devrait avoir des fuseaux monopolaires depuis Klp61F, qui est nécessaire pour la bipolarité broche, est renversé 10,13. </li><li> Recueillir images time-lapse de broches bipolaires (par exemple, 1 image par minute) dans les cellules exprimant à la fois Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline. </li><li> Alors que l&#39;imagerie, retirez le support de la chambre de rose, et le remplacer par les médias de Schneider contenant 1 uM STLC sur 3 échanges médiatiques consécutives (~ 5 ml au total) dans la chambre de visualiser broche effondrement. </li><li> Au lavage à la drogue et à inverser l&#39;effondrement de la broche, retirez soigneusement le support contenant STLC-de la chambre de rose, et se laver dans le média de Schneider 4x (6-8 ml au total) avant de remplir la chambre de rose une dernière fois avec un milieu frais. Continuer imagerie. </li></ol> 4. Correction d&#39;erreur de dosage <ol><li> Placer un 22 mm x 22 mm concanavaline A lamelles enrobées dans de 35 mm boîtes de culture de tissu de nettoyage. </li><li> Seed 500 pi de cellules qui ont été traitées avec Klp61F ARNdb sur la concanavaline A lamelle enduit et de leur permettre d&#39;adhérer. </li><li> Après que les cellules sont Adhered, ajouter 1,5 ml de médias de Schneider de chaque plat pour amener le volume final à 2 ml. </li><li> Pour arrêter les cellules en mitose, MG132 ajouter à une concentration finale de 10 pM à chacun des plats, et incuber pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 1 uM STLC et incuber pendant 1 heure pour permettre monopôles à se former. </li><li> Laver le STLC par rinçage lamelles 3x avec 2 ml de milieu de Schneider frais à chaque fois. </li><li> Incuber lamelles avec les médias de Schneider, en plus des médicaments pharmacologiques (par exemple, les inhibiteurs de la kinase Aurora) ou du DMSO comme témoin. Remarque: les concentrations d&#39;inhibiteur varient et concentrations finales appropriées doivent être déterminées par l&#39;expérimentateur. Les solutions mères sont généralement faites de telle sorte que l&#39;inhibiteur est dilué à 1: 1000 dans les médias. Dans ce cas, un mélange 1: 1000 dilution de DMSO (ou solvant approprié) sert de commande de véhicule. Nous utilisons l&#39;inhibiteur Aurora B Binucleine 2 à une concentration finale de 40 uM. </li><li> Fixer les cellules à différents points de temps to observer la progression de la formation du fuseau bipolaire et pour évaluer les états de fixation kinétochore. Arranger: <ol><li> Rincer rapidement les lamelles avec 2 ml de 1x BRB-80. </li><li> Fixer les cellules par addition de 2 ml de paraformaldehyde à 10% diluée dans 1 x BRB-80 pendant 10 min. Pipeter soigneusement paraformaldehyde dans une hotte chimique. </li><li> Perméabiliser les cellules avec 2 ml de 1 x PBS + 1% de Triton-X à 8 min. </li><li> Laver les lames avec 3 x 2 ml de 1 x PBS + 0,1% de Triton-X. </li><li> Transfert lamelles de cellule côté face vers le haut sur une feuille de Parafilm (utiliser un marqueur pour marquer Parafilm appropriée pour garder la trace des diapositives) dans un plat 150 mm Petri. </li><li> Couvrir les lamelles avec 150 ul bouillie sérum âne (BDS) et incuber à température ambiante pendant 1 heure pour bloquer la liaison d&#39;anticorps non spécifique. Remarque: Ici, le protocole de fixation peut être arrêté pour être poursuivie à un stade ultérieur. Lamelles peuvent être stockés dans une chambre humide à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 24 heures. Pour rendre la chambre de l&#39;humidité, aligner le bord d&#39;un plat de 150 mmavec un laboratoire lingette humide et couvrir avec le plat couvercle Petri. </li><li> Retirer le bloc, et incuber les lamelles pendant 1 heure à température ambiante avec 150 pi d&#39;anticorps primaires dilués de manière appropriée dans BDS à la coloration pendant kinétochores et microtubules à des concentrations finales de 2 pg / ml (ou selon les recommandations du fabricant) et 1 pg / ml, respectivement . Remarque: Ici, le protocole de fixation peut être arrêté pour être poursuivie à un stade ultérieur. Lamelles peuvent être stockés dans une chambre humide à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 24 heures. </li><li> Lavez lamelles de 3x avec 500 pi de PBS 1x + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incuber lamelles pendant 30-60 min à température ambiante avec les anticorps secondaires fluorophores approprié conjugué dilué dans BDS. </li><li> Lavez lamelles de 3x avec 500 pi de PBS 1x + 0,1% de Triton-X. </li><li> Incuber lamelles avec 150 pi de BDS contenant 1 pg / ml DAPI concentration finale pendant 5 min. </li><li> Laver 2 fois avec des lamelles couvre-1x PBS + 0,1% de Triton-X, et c montageoverslips côté pile sur un «slide 3x1 avec 8 pi de milieu de montage. Peignez les coins avec du vernis à ongles pour immobiliser les lamelles sur des lames. </li></ol></li><li> Cellules d&#39;image avec broches bipolaires qui expriment Eg5-mCherry. Prenez une série Z composée de 30 avions à 0,2 um intervalles dans tous les canaux à l&#39;aide d&#39;un objectif 100X. Analyser soigneusement les kinétochores et microtubules pour déterminer les états de fixation (bi-orientés ou des pièces jointes syntelic). </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Visualisation correction d&#39;erreur est une technique précieuse pour étudier les étapes impliquées dans ce processus cellulaire importante et complexe. Pour ce faire, les pièces jointes erronées sont générées en utilisant des inhibiteurs réversibles, et la correction d&#39;erreur est observée sur lavage de la drogue. Cet essai a été développé à l&#39;origine en utilisant des cellules de culture de tissu de mammifère 5. Cependant, la présence d&#39;un grand nombre de cinétochores dans de nombreux types de cellules de mammifères modèle pose un défi à l&#39;observation des événements individuels de correction d&#39;erreur. Des cellules de Drosophila S2 possèdent aussi peu que 4 paires de cinétochores, ce qui en fait une lignée cellulaire plus préférable pour l&#39;observation de correction d&#39;erreur. Cependant, un inconvénient majeur est que de nombreux inhibiteurs ne sont pas efficaces dans des cellules S2 de Drosophila. Ainsi, la capacité de générer une lignée de cellules de Drosophila S2 humanisé exprimant kinésine-5 humaine constitue un outil précieux pour étudier la correction d&#39;erreur. Bien que les cellules S2 de Drosophila peuvent être unmeilleure lignée cellulaire pour étudier la correction d&#39;erreur, les multiples étapes nécessaires à l&#39;obtention de la lignée cellulaire et abattre des gènes essentiels pose des défis à cette technique. Par exemple, l&#39;efficacité de transfection peut être très faible. Si moins de 20% des cellules expriment la Eg5-mCherry, la transfection doit être répété que le processus de sélection prendra plus de temps. En outre, le pourcentage de cellules exprimant deux protéines fluorescentes peut diminuer au fil du temps. Ceci peut être surmonté en fractionnant des cellules en présence de HCl et la blasticidine S hygromycine B pour sélectionner des cellules exprimant Eg5-mCherry et GFP-α-tubuline, respectivement. Il est également important de noter que les cellules S2 de Drosophila ont orthologues de nombreuses protéines humaines et; par conséquent, il est essentiel d&#39;optimiser les conditions démontables pour les protéines endogènes. Knockdown conditions optimales peuvent varier de la quantité de l&#39;ARN double brin et la durée du traitement. Considérant l&#39;émergence et l&#39;amélioration rapide de CRISPR-cas9 technologies 15 à 17, la génération d&#39;une lignée de cellules de Drosophila avec le gène remplacé par Klp61F Eg5 humain présente une alternative puissante que permettrait de surmonter les limitations de l&#39;approche et la transfection effet de choc. Notre travail démontre que la mouche à humain remplacement d&#39;un gène doit être une option viable dans ce cas, bien que les réactifs nécessaires pour le faire dans les cellules S2 de drosophile sont actuellement en cours d&#39;élaboration. Ce procédé ne se limite pas à Eg5, mais peut être appliquée pour étudier la fonction d&#39;autres protéines d&#39;intérêt. Si l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs qui ont déjà été mis en place pour être inefficace dans les cellules S2 de drosophile, ce protocole peut être modifié pour étudier l&#39;effet direct des inhibiteurs dans des cellules vivantes, sans crainte des effets hors cible. La lignée cellulaire produit en utilisant ce protocole pourrait également être utilisé dans le criblage à haut débit des analyses pour identifier les médicaments potentiels ciblant les protéines impliquées dans la correction d&#39;erreur.

L&#39;égalité de ségrégation du génome pendant la division cellulaire nécessite des interactions entre l&#39;ADN correctes et broche microtubules répliquées. Microtubules interagissent physiquement avec des chromosomes à travers un ensemble de protéines qui se réunit à centromères connus sous le nom kinetochore 1. La distribution correcte des chromosomes exige que cinétochores sœurs sont bi-orienté, dans lequel chaque sœur est associée à des microtubules provenant opposées pôles du fuseau. Kinetochore microtubules (kt-MT) les pièces jointes qui ne sont pas dans la conformation biorienté sont rapidement et efficacement déstabilisé de fournir l&#39;occasion d&#39;établir biorientation dans un processus connu sous le nom de correction d&#39;erreur. Un essai de correction d&#39;erreur qui a été précédemment mis en place dans des cellules de mammifère 5 nécessite l&#39;assemblage des fuseaux monopolaires utilisant des inhibiteurs de petites molécules contre réversibles Eg5 (kinésine-5). Le traitement de la toxicomanie génère une multitude de pièces jointes syntelic erronées dans lequel botcinétochores h sœurs attachent à la même pôle broche. Un lavage subséquent du médicament permet une visualisation du processus de correction d&#39;erreur. L&#39;essai de correction d&#39;erreur peut être fait en présence d&#39;inhibiteurs de petites molécules ou des passes rabattues pour étudier la contribution des protéines candidates à corriger erronées pièces jointes kt-MT. La capacité à visualiser la correction d&#39;erreurs dans les cellules vivantes est un outil puissant pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans ce processus complexe. Toutefois, le grand nombre de chromosomes présents dans la plupart des lignées de cellules constitue un défi en observant individuelles jointes kt-MT. Des cellules de Drosophila S2, il est idéal pour l&#39;application de l&#39;essai de correction d&#39;erreur, car ils contiennent aussi peu que quatre chromosomes 6, mais de petites molécules inhibitrices de kinésine 5 tels que S-trityl-L-cystéine (STLC) et Monastrol 7-9 ne touchent pas ensemble broche ou kinésine-5 fonction motrice dans les cellules de drosophile. Nous avons donc genresTed une lignée de cellules de Drosophila S2 exprimant kinésine-5 humain sous un promoteur inductible qui est sensible à la kinésine-5 inhibiteurs. Ce protocole décrit comment le knockdown endogène Drosophila kinésine-5 homologue, Klp61F, et en utilisant cette lignée cellulaire dans l&#39;essai de correction d&#39;erreur basé sur des cellules.

<table><tbody><tr><td>Réactif de transfection d’effectine</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Nom du gène LD15641</td></tr><tr><td>Schneider' s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, certifié</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Inactivé par la chaleur, origine américaine</td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre(II) (CuSO4)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&nbsp ; mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cystéine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&nbsp ; stock mM de DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&nbsp ; mg/ml stock dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Système de production d’ARN à grande échelle</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>La concentration approximative d’ARNdb de chaque réaction est d’environ 5-15&nbsp ; et micro ; g/&micro ; l</td></tr><tr><td>Klp61F ARNi F amorce</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R amorce</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR kit de nettoyage</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&nbsp ; mg/ml solution obtenue par dissolution dans 1x PBS.</td></tr><tr><td>Sérum d’âne bouilli</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>Solution mère à 5 % dans 1x tampon PHEM, porter la solution à ébullition. Stocké dans 4&nbsp ; &deg ;C.</td></tr><tr><td>Support de montage</td><td></td><td></td><td>20&nbsp ; mM Tris pH 8,&nbsp ; 0,5 % N-gallate de propyle, 90 % de glycérol. Stocké dans 4&nbsp ; &deg ;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM TUYAUX pH 6,9 ; 1&nbsp ; mM EGTA ; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Source de lumière blanche</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>Filtre DSRed Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 anticorps&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Fabriqué sur mesure par le Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&alpha ; (anti-&alpha ;-tubuline)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CID</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d&#39;un «humanisé»<em&gt; drosophila</em&gt; s2 cell line sensible à pharmacologique inhibition de kinesin-5

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Les kinétochores sont de grandes structures à base de protéines qui s’assemblent sur des centromères pendant la division cellulaire et lient les chromosomes aux microtubules fusiformes. La bonne distribution du matériel génétique exige que les kinétochores sœurs de chaque chromosome deviennent biorientées en se fixant aux microtubules des pôles fusiformes opposés avant de progresser vers l’anaphase. Cependant, les états d’attachement erronés et non bia-orientés sont courants et il existe des voies cellulaires pour détecter et corriger ces attachements pendant la division cellulaire. Le processus par lequel les interactions inappropriées entre les kinétochores et les microtubules sont déstabilisées est appelé correction d’erreur. Pour étudier la correction d’erreurs dans les cellules vivantes, des attaches incorrectes sont générées à dessein par l’inhibition chimique du moteur de la kinésine-5, ce qui conduit à l’assemblage monopolaire du fuseau, et la transition de la mauvaise orientation à la biorientation est observée après le lavage du médicament. Le grand nombre de chromosomes dans de nombreux types de cellules de culture tissulaire modèle pose un défi pour l’observation des événements de correction d’erreurs individuels. drosophile Les cellules S2 sont de meilleurs sujets pour de telles études car elles ne possèdent que 4 paires de chromosomes. Cependant, les inhibiteurs de la kinésine-5 à petites molécules sont inefficaces contre la kinésine-5 de la drosophile (Klp61F). Nous décrivons ici comment construire une lignée cellulaire de drosophile qui remplace efficacement Klp61F par la kinésine-5 humaine, ce qui rend les cellules sensibles à l’inhibition pharmacologique du moteur et apte à être utilisée dans le test de correction d’erreur basé sur les cellules.

Klp61F est nécessaire pour former des broches bipolaires. La kinésine-5 humaine, Eg5, peut sauver la fonction de Klp61F dans des cellules de Drosophila S2 (figure 1A et D). Lors de l&#39;addition de l&#39;inhibiteur de la kinésine-5 (STLC), le niveau de la chute de moteur (Figure 1B et E), et les effondrements de broche associées aux microtubules, ce qui entraîne un monopôle (Figure 1C et F) dans des cellules manquant endogène Klp61F sur l&#39;ARNi réussi (film supplémentaire 1). Il est à noter que les broches bipolaires effondrement lors de l&#39;addition de STLC dans les cellules S2 humanisés kinésine-5 parce que l&#39;activité ne soit pas nécessaire pour maintenir la bipolarité de la broche dans les cellules humaines. Cet écart peut être intéressant en raison de différences de chevauchement et / ou la stabilité des microtubules interpolaire dans les deux systèmes modèles 14. Kinesin-5 inhibition (figure 2A et E) peuvent être Rêve<html> RSED par lavage de la drogue et de la récupération d&#39;un fuseau bipolaire peuvent être suivies au fil du temps. Lors du retrait de l&#39;inhibiteur (figure 2B et F), Eg5-mCherry nouveau associés avec les microtubules comme un bipolaires assemble de broche (figure 2C et G), et les cellules peut évoluer vers une anaphase bipolaire (figure 2D et H, film supplémentaire 2 ). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Figure 1. Ajout de 1 uM STLC conduit à des fuseaux monopolaires dans les cellules S2 de drosophile. Des images représentatives de l&#39;imagerie time-lapse d&#39;une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry (AC) et GFP-α-tubuline (DF) pendant plus de 1 pm STLC. L&#39;inhibiteur Eg5 a été ajouté à 3 min. Barre d&#39;échelle = 5 um. Timestamp = min: sec.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Figure 2. A bipolaires des réformes de la broche lors du retrait de STLC. Des images représentatives de l&#39;imagerie time-lapse d&#39;une cellule de Drosophila exprimant 2 Eg5-mCherry (AD) et GFP-α-tubuline (EH) lors d&#39;une expérience STLC de lavage. STLC a été emporté à 5 min. A bipolaires réformes de broche à moins de 1 h de retirer le STLC. Barre d&#39;échelle = 5 um. Timestamp: min. Sec <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Film supplémentaire 1. (clic droit pour télécharger). Widefield imagerie de fluorescence d&#39;un exemple représentatif d&#39;une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry ( à gauche) et GFP-α-tubuline (à droite). 1 uM STLC a été ajouté à 2 min, et les formes de la broche un monopôle à moins de 10 minutes après l&#39;addition de l&#39;inhibiteur. Les images ont été acquises toutes les 1 mn pris à raison de 10 images par seconde. La barre d&#39;échelle = 5 um. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Film supplémentaire 2. (clic droit pour télécharger).</a> D&#39;imagerie de fluorescence Widefield d&#39;un exemple représentatif d&#39;une cellule de Drosophila S2 exprimant Eg5-mCherry (à gauche) et GFP-α-tubuline (à droite). Médias contenant 1 uM STLC a été enlevé etrincés à 5 min. A bipolaires réformes de broche à moins de 1 h d&#39;éliminer l&#39;inhibiteur. Les images ont été acquises chaque 1 min et ont joué à une vitesse de 10 images par seconde. Barre d&#39;échelle = 5 um.

Ce protocole décrit comment générer une lignée cellulaire de drosophile S2 sensible aux inhibiteurs de petites molécules de kinésine-5. L’utilisation de ces cellules dans un test de correction d’erreur basé sur les cellules est également décrite.

Génération d&#39;un «humanisé»<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 Cell Line Sensible à pharmacologique inhibition de Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

L'objectif général de cette expérience est de générer une lignée cellulaire de Drosophila S2 sensible aux inhibiteurs de petite molécule du moteur kinésine-5, afin de pouvoir étudier le processus de correction d'erreurs. La correction d'erreurs pendant la division cellulaire est un processus au cours duquel les interactions erronées entre les kinétochores et les microtubules sont déstabilisées, offrant ainsi à la cellule une seconde chance, ou une autre opportunité, de former des attaches correctes afin que le génome puisse être correctement réparti. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, liées au processus de correction d'erreurs.Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons utiliser une lignée cellulaire de Drosophila S2 possédant moins de chromosomes et étant sensible à un inhibiteur de la Kinésine-5, ce qui facilite l'observation des événements individuels de correction d'erreurs. À partir d'un flacon carré de 25 centimètres carrés précédemment ensemencé avec des cellules S2 exprimant la GFP-Alpha Tubuline à 100 % de confluence, transférez deux millilitres de la culture dans une boîte de 35 millimètres. Incubez ensuite les cellules à température ambiante pendant environ une heure afin qu'elles s'attachent partiellement.Retirer le milieu de la boîte et ajouter un millilitre de milieu Schneider, complété avec du FBS, à deux microgrammes de la construction Eg5-mCherry et du réactif de transfection afin de transfecter les cellules selon le protocole du fabricant. Utiliser du Parafilm pour sceller la boîte et incuber les cellules à 25 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Ensuite, ajouter un millilitre de milieu Schneider et replacer les cellules dans l’incubateur.Le troisième jour suivant la transfection, transférez 500 microlitres de cellules transfectées dans une nouvelle boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant 1,5 millilitre de milieu Schneider pour une induction test. Pour induire l'expression de Eg5-mCherry, ajoutez du sulfate de cuivre jusqu'à une concentration finale de 500 micromolaire. Scellez la boîte avec du Parafilm et incubez à 25 degrés Celsius pendant la nuit.Placer une lamelle de 22 millimètres sur 22 millimètres, préalablement préparée et revêtue de concanavaline A, dans une boîte de culture tissulaire propre de 35 millimètres. Ensuite, ensemencer 500 microlitres des cellules induites à confluence de 100 % sur la lamelle et laisser les cellules adhérer à température ambiante. Pour vérifier l'expression d'Eg5-mCherry, monter la lamelle dans une chambre de type rose avec du milieu et réaliser l'imagerie à température ambiante à l'aide d'un microscope à fluorescence, conformément aux directives du protocole écrit.Après avoir vérifié que les cellules expriment à la fois Eg5-mCherry et la tubuline alpha GFP, transférer le reste des cellules transfectées non induites dans un flacon de culture tissulaire carré de 25 centimètres carrés contenant quatre millilitres de milieu de Schneider. Ajouter du Blasticidin S HCL à une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre dans le flacon, puis poursuivre le fractionnement des cellules en présence de Blasticidin S HCL jusqu'à l'arrêt de la mort cellulaire. Après avoir préparé l'ARN double brin KLP61F selon le protocole décrit, ensemencer des cellules S2 exprimant Eg5-mCherry dans une boîte de culture de 35 millimètres à une confluence de 25 %, et laisser les cellules s'attacher pendant une heure.Retirez le milieu des boîtes et ajoutez un millilitre de milieu de Schneider sans sérum à cinq microgrammes d'ARN double brin KLP61F. Après une incubation d'une heure à température ambiante, ajoutez un millilitre de milieu de Schneider contenant 10 % de FBS. Incubez les cellules à 25 degrés Celsius.24 heures après le traitement par ARNsd, induire l'expression d'Eg5-mCherry en ajoutant du sulfate de cuivre à une concentration finale de 500 micromolaire. Incuber les cellules à 25 degrés Celsius pendant 24 heures supplémentaires. Pour réaliser l'imagerie de cellules vivantes, placer une lame couvre-objet de 22 millimètres sur 22 millimètres, revêtue de concanavaline A, dans une boîte de culture tissulaire propre de 35 millimètres.Ensemencez 500 microlitres des cellules traitées par ARNdi, induites pendant une nuit, sur le lamelle et laissez-les adhérer pendant environ une heure. Après avoir collecté les images en laps de temps des fuseaux bipolaires selon le protocole décrit dans le texte, retirez le milieu de la chambre rose et ajoutez du milieu Schneider contenant un micromolaire de STLC, puis remplacez le milieu contenant le STLC deux fois supplémentaires, en éliminant le milieu après chaque lavage afin de visualiser l'effondrement du fuseau. Pour éliminer le médicament et inverser l'effondrement du fuseau, retirez soigneusement le milieu contenant le STLC de la chambre rose et jetez-le dans un récipient pour déchets, puis utilisez au total 6 à 8 millimètres de milieu Schneider pour laver les cellules quatre fois, en éliminant les milieux après chaque lavage.Ensuite, après avoir ajouté du milieu frais pour remplir à nouveau la chambre, poursuivez l'acquisition d'images. Pour accéder au milieu afin de procéder au lavage et à l'élimination du médicament, retirez soigneusement la lame couvre-objet supérieure de la chambre en forme de rose tout en la maintenant fixée sur le microscope. Alternativement, une boîte de Pétri à fond en verre traitée à la concanavaline A de manière similaire aux lames couvre-objets peut être utilisée pour l'imagerie de cellules vivantes.Après avoir semé 500 microlitres de cellules S2 traitées avec un ARNid ciblant KLP61F sur un coverslip de Concanavaline A et avoir laissé les cellules adhérer, ajouter 1,5 millilitre de milieu Schneider afin d'obtenir un volume final de deux millilitres. Une fois que les cellules ont été arrêtées en mitose selon le protocole décrit dans le texte, ajouter du STLC à une concentration d'un micromolaire et incuber pendant une heure pour permettre la formation de monopôles. Éliminer le STLC en rinçant les coverslips trois fois avec deux millilitres de milieu Schneider frais.Pour fixer les cellules à différents moments de la formation du fuseau bipolaire et évaluer les sites d'attachement des kinétochores, commencez par rincer rapidement les lamelles avec deux millilitres de BRB80 1X. Dans une hotte chimique, ajoutez deux millilitres de PFA 10 % dans du BRB80 1X et incubez pendant 10 minutes. Ensuite, pour perméabiliser les cellules, ajoutez du Triton X 1 % dans du PBS 1X et incubez pendant 10 minutes.Ensuite, utilisez deux millilitres de Triton X 0,1 % dans du PBS 1X pour laver les cellules trois fois. Puis, transférez la lame couvre-objet, côté cellules vers le haut, sur une feuille de Parafilm dans une boîte de Pétri de 150 millimètres. Ajoutez 150 microlitres de sérum de âne bouilli, ou BDS, sur les lames couvre-objets, et incubez une heure à température ambiante pour bloquer la liaison non spécifique des anticorps.Après l'incubation, retirez le bloc et ajoutez 150 microlitres d'anticorps primaires préparés conformément au protocole décrit dans le texte, puis incubez une heure à température ambiante. Après avoir lavé les lamelles trois fois, ajoutez des anticorps secondaires marqués avec Fluoro-4 dilués dans du BDS et incubez 30 à 60 minutes à température ambiante. Une fois les lamelles lavées trois fois, incubez-les avec 150 microlitres de BDS contenant un microgramme par millilitre de DAPI pendant cinq minutes.Ensuite, après avoir lavé les lamelles deux fois, utilisez huit microlitres de milieu de montage pour monter l'échantillon, côté cellules vers le bas, sur une lame de trois sur un pouce. Appliquez du vernis à ongles sur les coins. Enfin, utilisez un objectif 100X pour imager les cellules présentant des fuseaux bipolaires exprimant Eg5-mCherry.Acquérir une série Z, composée de 30 plans espacés de 0,2 micromètre dans tous les canaux. Analyser attentivement les kinétochores et les microtubules afin de déterminer l'état d'attachement. KLP61F est nécessaire à la formation de fuseaux bipolaires dans les cellules S2 de Drosophila ; toutefois, les inhibiteurs spécifiques de la Kinésine-5 sous forme de petites molécules sont inefficaces contre cette protéine.Ces images montrent que la kinésine-5 humaine Eg5 peut restaurer la fonction de KLP61F dans les cellules S2 de Drosophile. Lorsque l'inhibiteur de la kinésine-5, STLC, est ajouté, les niveaux du moteur associés aux microtubules diminuent et le fuseau s'effondre, conduisant à un monopôle dans les cellules dépourvues de KLP61F endogène suite à une ARNi réussie. Cette figure démontre que l'inhibition de la kinésine-5 peut être inversée par élimination du médicament, et que la récupération d'un fuseau bipolaire peut être suivie au fil du temps. Après retrait de l'inhibiteur, Eg5-mCherry se réassocie aux microtubules, et les cellules peuvent progresser vers une anaphase bipolaire.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer une lignée cellulaire S2 de Drosophila sensible à un inhibiteur de petite molécule de la Kinésine-5. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ six heures, si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important d'anticiper, car cette méthode nécessite des préparatifs quelques jours à l'avance.N'oubliez pas que le travail avec des inhibiteurs de petites molécules peut présenter des risques, portez donc toujours des gants. La création de cellules de drosophile humanisées peut être réalisée grâce à l'application des technologies CRISPR-Cas9, et au remplacement de la kinésine-5 de Drosophila par son homologue humain. Le développement de cellules de Drosophila humanisées devrait améliorer notre compréhension de la correction d'erreurs et d'autres processus cellulaires essentiels à l'avenir.

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