Génération d'un «humanisé» Drosophila S2 Cell Line Sensible à pharmacologique inhibition de Kinesin-5

L’objectif global de cette expérience est de générer une lignée cellulaire de drosophile S2 sensible aux inhibiteurs de petites molécules du moteur de la kinésine-5, afin qu’elles puissent être utilisées pour étudier la correction d’erreurs. La correction d’erreurs pendant la division cellulaire est un processus dans lequel les interactions erronées entre le kinétochore et les microtubules sont déstabilisées, afin de donner à la cellule une seconde chance, ou une autre opportunité, de former des attaches appropriées afin que le génome puisse être correctement séparé. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, liées au processus de correction d’erreurs.

Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons utiliser une lignée cellulaire de drosophile S2 qui a moins de chromosomes et qui est sensible à un inhibiteur de la kinésine-5, ce qui facilite la visualisation des événements de correction d’erreurs individuels. En commençant par un flacon de 25 centimètres carrés préalablement cultivé de 100 % de cellules GFP-Alpha Tubuline exprimant S2, transférez deux millilitres de la culture dans une boîte de 35 millimètres. Ensuite, incubez les cellules à température ambiante pendant environ une heure pour qu’elles adhèrent semi-bien.

Retirez le milieu de la boîte et ajoutez un millilitre de milieu de Schneider, complété par du FBS, dans deux microgrammes de la construction Eg5-mCherry et du réactif de transfection pour transfecter les cellules conformément au protocole du fabricant. Utilisez Parafilm pour sceller la boîte et incubez les cellules à 25 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de Schneider et remettez les cellules dans l’incubateur.

Le troisième jour après la transfection, transférez 500 microlitres de cellules transfectées dans une nouvelle boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant 1,5 millilitre de milieu de Schneider pour une induction de test. Pour induire l’expression d’Eg5-mCherry, ajoutez du sulfate de cuivre à une concentration finale de 500 micromolaires. Scellez le plat dans Parafilm et incubez à 25 degrés Celsius pendant la nuit.

Placez une lamelle de culture tissulaire Concanavalin A de 22 millimètres sur 22 millimètres préalablement préparée dans une boîte de culture tissulaire propre de 35 millimètres. Ensuite, ensemencez 500 microlitres de cellules induites à 100 % confluentes sur la lamelle de recouvrement et laissez les cellules adhérer à température ambiante. Pour vérifier l’expression de Eg5-mCherry, assemblez la lamelle de couverture dans une chambre à roses avec un milieu et imagez à température ambiante à l’aide d’un microscope à fluorescence, conformément aux directives du protocole de texte.

Après s’être assuré que les cellules expriment à la fois la tubuline Eg5-mCherry et l’alpha tubuline GFP, transférez le reste des cellules transfectées et non induites dans une fiole de culture tissulaire de 25 centimètres carrés, contenant quatre millilitres de milieu de Schneider. Ajouter la blasticidine S HCL à une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre dans la fiole et continuer à diviser les cellules en présence de la blasticidine S HCL jusqu’à ce que la mort cellulaire cesse. Après avoir préparé l’ARN double brin KLP61F selon le protocole de texte, ensemencez les cellules S2 exprimant Eg5-mCherry dans une boîte de culture de 35 millimètres à 25 % de confluence, et laissez-les adhérer pendant une heure.

Retirez le milieu de la boîte et ajoutez un millilitre de milieu Schneider’s sans sérum à cinq microgrammes d’ARN double brin KLP61F. Après avoir incubé à température ambiante pendant une heure, ajoutez un millilitre de milieu Schneider’s avec 10 % FBS. Incuber les cellules à 25 degrés Celsius.

24 heures après le traitement à ARNdb, induire l’expression d’Eg5-mCherry en ajoutant du sulfate de cuivre à une concentration finale de 500 micromolaires. Incuber les cellules à 25 degrés Celsius pendant 24 heures supplémentaires. Pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes, placez une gaine Concanavalin A de 22 millimètres sur 22 millimètres dans une boîte de culture tissulaire propre de 35 millimètres.

Semez 500 microlitres de cellules traitées à l’ARNdb qui ont été induites pendant la nuit sur la lamelle et laissez-les adhérer pendant environ une heure. Après avoir collecté des images en accéléré de fuseaux bipolaires conformément au protocole de texte, retirez le milieu de la chambre à roses et ajoutez le milieu de Schneider contenant un STLC micromolaire et replacez le milieu STLC deux fois de plus, en jetant le milieu après chaque lavage pour visualiser l’effondrement du fuseau. Pour laver le médicament et inverser l’effondrement du fuseau, retirez soigneusement le milieu contenant du STLC de la chambre de la rose et jetez-le dans un récipient à déchets, et utilisez un total de 6 à 8 millimètres de milieu de Schneider pour laver les cellules quatre fois, en jetant le milieu après chaque lavage.

Ensuite, après avoir ajouté du milieu frais pour remplir la chambre, continuez l’imagerie. Pour accéder au support de lavage et de lavage des médicaments, retirez soigneusement la lamelle du couvercle supérieur de la chambre à rose lorsqu’elle est fixée au microscope. Alternativement, une boîte de Pétri à fond de verre traitée avec du Concanavalin A, de la même manière que les lamelles de couverture, peut être utilisée pour l’imagerie de cellules vivantes.

Après avoir ensemencé 500 microlitres de cellules S2 traitées avec l’ARNdb KLP61F sur une lamelle de Concanavalin A et permis aux cellules d’adhérer, ajoutez 1,5 millilitre de milieu de Schneider pour porter le volume final à deux millilitres. Une fois que les cellules ont été arrêtées en mitose selon le protocole textuel, ajoutez un STLC micromolaire et incubez pendant une heure pour permettre aux monopôles de se former. Lavez le STLC en utilisant deux millilitres de milieu frais Schneider’s pour rincer les lamelles trois fois.

Pour fixer les cellules à différents moments de la formation du fuseau bipolaire et pour évaluer les sites de fixation des kinétochores, commencez par utiliser deux millilitres de 1X BRB80 pour rincer rapidement les lamelles. Dans une hotte chimique, ajoutez deux millilitres de 10 % de PFA dans 1X BRB80 et incubez pendant 10 minutes. Ensuite, pour perméabiliser les cellules, ajoutez 1 % de Triton X dans 1X PBS et incubez pendant 10 minutes.

Utilisez ensuite deux millilitres de 0,1 % Triton X dans 1X PBS pour laver les cellules trois fois. Ensuite, transférez la lamelle, côté cellule vers le haut, sur une feuille de Parafilm dans une boîte de Pétri de 150 millimètres. Ajoutez 150 microlitres de sérum d’âne bouilli, ou BDS, dans les lamelles et incubez à température ambiante pendant une heure pour bloquer la liaison des anticorps non spécifiques.

Après l’incubation, retirez le bloc et ajoutez 150 microlitres d’anticorps primaires préparés selon le protocole textuel avant d’incuber à température ambiante pendant une heure. Après avoir lavé les lamelles trois fois, ajoutez des anticorps secondaires conjugués au fluoro-4 dilués dans du BDS et incubez à température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Une fois que les lamelles ont été lavées trois fois, incubez-les avec 150 microlitres de BDS, contenant un microgramme par millilitre de DAPI pendant cinq minutes.

Ensuite, après que les lamelles aient été lavées deux fois, utilisez huit microlitres de milieu de montage pour monter l’échantillon, côté cellule vers le bas, sur une lame de trois pouces sur un. Utilisez du vernis à ongles pour peindre les coins. Enfin, utilisez un objectif 100X pour imager des cellules avec des fuseaux bipolaires exprimant Eg5-mCherry.

Prenez une série Z, composée de 30 plans à des intervalles de 0,2 micromètre dans tous les canaux. Analysez soigneusement le kinétochore et les microtubules pour déterminer l’état d’attachement. KLP61F est nécessaire à la formation de fuseaux bipolaires dans les cellules S2 de la drosophile ; cependant, les inhibiteurs de la kinésine-5 à petites molécules sont inefficaces contre elle.

Ces images montrent que la kinésine-5 Eg5 humaine peut sauver la fonction de KLP61F dans les cellules S2 de la drosophile. Lorsque l’inhibiteur de la kinésine-5, STLC, est ajouté, les niveaux associés aux microtubules du moteur chutent et le fuseau s’effondre, ce qui entraîne un monopôle dans les cellules dépourvues de KLP61F endogène à la suite de la réussite de l’ARN I.Cette figure démontre que l’inhibition de la kinésine-5 peut être inversée en éliminant le médicament, et que la récupération d’un fuseau bipolaire peut être suivie au fil du temps. Lors de l’élimination de l’inhibiteur, Eg5-mCherry se réassocie aux microtubules, et les cellules peuvent évoluer vers une anaphase bipolaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer une lignée cellulaire de drosophile S2 sensible à une petite molécule inhibitrice de la kinésine-5. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures environ, si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de planifier à l’avance, car cette méthode nécessite une préparation quelques jours à l’avance.

N’oubliez pas que travailler avec des inhibiteurs de petites molécules peut être dangereux, alors portez toujours des gants. La construction de cellules de mouches des fruits humanisées peut être prouvée par l’application des technologies Crispr-Cas 9 et le remplacement de la drosophile kinésine-5 par son homologue humain. Le développement de cellules de drosophile humanisées devrait faire progresser notre compréhension de la correction d’erreurs et d’autres processus cellulaires essentiels à l’avenir.