Suivi des cellules dans le poisson zèbre transgénique de la GFP-Utilisation du système photoconvertible PSmOrange
5 février 2016
Nous avons établi le système photoconvertible PSmOrange comme un outil puissant, simple et peu coûteux pour le suivi cellulaire in vivo dans les fonds transgéniques GFP. Ce protocole décrit son application dans le système modèle du poisson zèbre.
L’objectif global de la technologie de conversion de photos PSmOrange est de suivre les cellules de l’animal vivant pendant le développement embryonnaire et la maladie. Cette méthode peut répondre à des questions clés en biologie du développement, telles que la découverte de l’origine des cellules qui se développent en tissus et en organes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée dans des fonds transgéniques GFP.
Cette méthode peut également être appliquée dans différents domaines d’investigation tels que la régénération, la progression tumorale et l’invasion. Après avoir généré et intégré des embryons exprimant PSmOrange et GFP selon le protocole de texte, placez l’embryon sous le microscope confocal et utilisez l’objectif à air 20x et les lasers de 488 et 561 nanomètres pour scanner l’échantillon afin d’identifier une zone à photoconvertir. Pour détecter la protéine PSmOrange avant la photoconversion, utilisez le laser de 561 nanomètres à 0,74 milliwatt de puissance mesurée au plan de mise au point au-dessus de l’objectif et ajustez la puissance du laser si nécessaire.
Ajustez les facteurs de zoom pour mettre en évidence la zone d’intérêt et réduire le temps d’acquisition de l’image et la toxicité de la photo. À l’aide des lasers de 488 et 561 nanomètres en mode séquentiel et d’un pas Z entre 1,0 et 2,0 micromètres, acquérez une pile Z couvrant les structures d’intérêt. Ajustez la moyenne de ligne et la fréquence de balayage pour optimiser la qualité de l’image.
Ensuite, scannez l’échantillon et sélectionnez la région d’intérêt, ou l’outil ROI, pour mettre en évidence la zone à photoconvertir avant de fixer le ROI comme zone de stimulation. Sélectionnez le module de blanchiment par photoactivation, cochez la case pour activer le laser de 488 nanomètres, puis réglez le laser de 488 nanomètres sur 80 % et la vitesse de balayage sur 0,5 seconde par image. Ensuite, ouvrez l’utilitaire de photoconversion et cliquez sur Ajouterpour spécifier le protocole de photoconversion.
Dans le menu de stimulation de l’acquisition, réglez la première phase sur l’acquisition et dans le menu des boucles, indiquez le nombre d’images à acquérir avant la photoconversion. Réglez la phase deux sur la stimulation et entrez le nombre d’événements de stimulation à effectuer. Ajustez la phase trois comme décrit pour la première phase.
Si vous le souhaitez, insérez une phase d’attente après la phase deux en saisissant le temps d’attente avant le dernier tour d’acquisition de l’image. Une fois les paramètres définis, appliquez le réglage de stimulation et lancez la photoconversion. Les paramètres miscroscopiques sont cruciaux pour la photoconversion PSmOrange.
Pour garantir une photoconversion réussie, l’embryon est imagé directement après l’expérience afin de détecter la protéine PSmOrange photoconvertie. Si la conversion n’a pas réussi, la procédure est répétée. À l’aide des lasers de 488, 561 et 640 nanomètres, et en réglant le laser de 640 nanomètres à haute puissance, jusqu’à 4,5 milliwatts, obtenez une pile z finale avec les paramètres décrits ci-dessus.
Pour démonter l’embryon, retirez la chambre du microscope et utilisez une pince pour retirer l’embryon de l’agarose. Transférez l’embryon dans une nouvelle boîte de Pétri en plastique stérilisé, ou une plaque stérilisée à 6 puits, contenant 0,2 millimolaire de PTU dans E3. Incuber l’embryon à 28 degrés Celsius jusqu’au stade de développement souhaité. Pour analyser le devenir des cellules exprimant la protéine PSmOrange photoconverties, réintégrez l’embryon selon le protocole de texte.
Sous le miscroscope confocal, balayez l’échantillon pour identifier les cellules photoconverties dans la structure transgénique GFP d’intérêt. Utilisez les lasers nanométriques 488, 561 et 640 pour acquérir une pile z avec une pile fixe de 1 à 2 micromètres en mode séquentiel couvrant les structures. À l’aide du logiciel Image J Fiji, identifiez les cellules qui co-expriment la GFP et la protéine photoconvertie.
Dupliquez la pile d’origine, utilisez le plugin Gaussian Blur et le calculateur d’image pour soustraire les piles lisses de l’original. Appliquez des seuils spécifiques aux canaux vert et rouge lointain afin de mettre en évidence les cellules photoconverties. Utilisez ensuite l’outil Analyser les particules pour détecter les zones de seuil dans le canal vert avec un paramètre approprié.
Répétez cette étape pour le canal rouge éloigné. Ouvrez le plugin de calcul d’images pour détecter les cellules co-localisantes. Affichez en jaune les zones d’intérêt qui se chevauchent dans le canal vert ou rouge lointain à l’aide de l’outil Analyser les particules.
À l’aide du logiciel NIS-Elements, effectuez une évaluation de date 3D et affichez la pile en 3D à l’aide de l’option Afficher la vue du volume. Utilisez ensuite l’interface graphique pour sélectionner les canaux vert, rouge et rouge lointain, ajustez la luminosité et le contraste et recadrez la pile 3D pour mettre en évidence la zone photoconvertie. Voici un exemple du système de photocoversion PSmOrange chez des embryons de GFP à tête flottante transgénique FOXD3 de poisson zèbre.
26 heures après la fécondation, deux amas de cellules dans la partie antérieure de la glande pinéale ont été photoconvertis et immédiatement imagés. La protéine a été détectée avec un laser rouge lointain de 640 nanomètres, mais pas avec un laser de 561 nanomètres. Dans ces cellules, l’expression de la GFP a d’abord été réduite en raison du photoblanchiment.
À 52 HPF, la GFP et la H2B PSmOrange ont été détectées dans les cellules exprimant la protéine H2B PSmOrange photoconverties. Quelques-unes de ces cellules formaient le parapinéal du côté gauche du cerveau. Ce résultat est cohérent avec les rapports précédents sur l’origine des cellules parapinéales dans la glande pinéale antérieure et montre l’applicabilité de la technique PSmOrange dans l’embryon de vertébré transgénique GFP vivant.
À la suite de cette procédure, l’analyse de suivi cellulaire peut être effectuée sur des embryons génétiquement manipulés afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les hiérarchies moléculaires sous-jacentes au développement de la cellule.
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Aperçu
Le système PSmOrange est un outil économique permettant le suivi cellulaire in vivo dans des lignées transgéniques exprimant la GFP, en particulier chez le poisson-zèbre. Ce protocole facilite l'étude de l'origine cellulaire au cours du développement embryonnaire et des maladies.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie du développement
- Suivi cellulaire
- Développement embryonnaire
Contexte
- La technologie de photoconversion PSmOrange permet le suivi de cellules dans des organismes vivants.
- Cette méthode s'applique à divers domaines de recherche, notamment la régénération et la progression tumorale.
- Elle peut être utilisée dans des lignées transgéniques exprimant GFP, ce qui accroît sa polyvalence.
- La microscopie confocale est utilisée pour la visualisation et la photoconversion des cellules.
Objectif de l'étude
- Suivre les cellules au cours du développement embryonnaire et des processus pathologiques.
- Déterminer l'origine des cellules qui donnent naissance aux tissus et aux organes.
- Fournir des informations sur les comportements cellulaires dans divers contextes biologiques.
Méthodes utilisées
- Génération d'embryons exprimant PSmOrange et GFP.
- Inclusion d'embryons pour l'analyse par microscopie confocale.
- Utilisation de lasers à 488 et 561 nm pour l'imagerie.
- Photoconversion de la protéine PSmOrange à des fins de traçage.
Résultats principaux
- Un suivi réussi des cellules dans des modèles de poisson zèbre à l'aide du système PSmOrange.
- Capacité démontrée de visualiser les origines et les comportements cellulaires.
- Mise en évidence de l'applicabilité de la méthode dans divers domaines de recherche biologique.
- Un protocole simple fourni pour que les chercheurs puissent le suivre.
Conclusions
- Le système PSmOrange est un outil efficace pour le suivi cellulaire in vivo.
- Il offre des avantages significatifs pour l'étude de la biologie du développement.
- Cette méthode peut améliorer la compréhension des processus biologiques complexes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Le système de protéine photoconvertible PSmOrange permet un suivi cellulaire précis in vivo chez les embryons de poisson-zèbre transgéniques exprimant GFP, répondant ainsi à une limitation majeure de la recherche en biologie du développement, où les lignées transgéniques existantes ne possèdent pas de rapporteurs compatibles pour le traçage lignager. Cette capacité soutient la réduction des risques mécanistiques lors de la validation de cibles en permettant la visualisation directe des origines cellulaires et des décisions de destin cellulaire dans des systèmes pertinents pour la maladie, notamment dans les applications d'oncologie et de médecine régénérative impliquant la progression tumorale, l'invasion et la régénération tissulaire. La méthode renforce la fiabilité prédictive des modèles précliniques en fournissant des données quantitatives et spatialement résolues sur la migration et la différenciation cellulaires au sein d'organismes intacts et vivants.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en suivant des populations cellulaires définies dans des lignées transgéniques afin de préciser les origines cellulaires des tissus et des organes.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les lignées transgéniques GFP existantes, éliminant le besoin de générer de nouveaux promoteurs et réduisant le temps de développement des modèles.
- Valeur prédictive : Facilite la dé-risquisation biologique par l'observation directe des décisions concernant le destin cellulaire, renforçant ainsi la confiance dans les associations entre cibles et mécanismes de maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données spatiales et temporelles quantifiables sur la migration des cellules photoconverties, permettant une comparaison objective de perturbations génétiques ou pharmacologiques.
- Valeur opérationnelle : Utilise une microscopie confocale standard avec excitation laser séquentielle (488, 561, 640 nm), ne nécessitant aucun équipement spécialisé au-delà des plateformes d'imagerie classiques.
- Extensibilité : Compatible avec l'imagerie 3D haute résolution et les outils de post-traitement (ImageJ Fiji, NIS-Elements) pour une analyse de co-localisation reproductible avec GFP.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Directement applicable à l'étude des modèles d'invasion et de métastase des cellules tumorales chez le poisson zèbre, dans des modèles xénogreffés ou transgéniques de cancer.
- Continuité translationnelle : Permet une transition fluide de la découverte (traçage de l'origine cellulaire) à la validation préclinique, par le suivi de l'engraftement, de la migration et de l'intégration des cellules photoconverties in vivo.
- Décisions adaptées au risque : Fournit des critères d'évaluation visuels et quantitatifs pour des décisions d'orientation (suite à donner ou non) en phase précoce de développement préclinique, fondées sur le comportement cellulaire dans des contextes pertinents pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le système PSmOrange s'inscrit dans la continuité entre la découverte précoce et le stade préclinique, servant d'outil de criblage phénotypique et de validation mécanistique qui établit un lien entre la manipulation génétique et les mesures fonctionnelles cellulaires dans des modèles vertébrés vivants.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses en facilitant le traçage du destin de populations cellulaires spécifiques en réponse à des perturbations génétiques ou environnementales chez des embryons transgéniques exprimant la GFP.
- Criblage : Génère des sorties quantitatives standardisées et reproductibles (pourcentages de co-localisation, distances de migration) adaptées aux criblages de composés ou de gènes suppresseurs/potentiateurs.
- Analyse : Produit des données de fluorescence multicanal (GFP, PSmOrange orange/rouge, PSmOrange photoconverti en proche infrarouge) permettant des analyses rigoureuses de co-localisation et de particules pour un phénotypage objectif.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans les travaux précliniques en suivant le comportement cellulaire dans des modèles de régénération et de progression tumorale, apportant des éléments sur la validité mécanistique des cibles.
- Réutilisation institutionnelle : Constitue une plateforme réutilisable ; l'injection d'ARNm permet un déploiement rapide sur plusieurs lignées transgéniques sans avoir à créer de nouvelles lignées stables.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation de cibles en fournissant une preuve visuelle directe des dynamiques cellulaires dans des organismes intacts.
- Valeur opérationnelle : Permet la standardisation entre laboratoires grâce à des protocoles de photoconversion et des réglages laser définis (488 nm à 80 % de puissance, 0,5 seconde par image ; 640 nm jusqu'à 4,5 mW pour la détection).
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en exploitant les ressources transgéniques existantes exprimant la GFP, évitant ainsi l'identification coûteuse de promoteurs *de novo* et la génération de lignées.
- Impact du portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en fournissant dès le départ des données fonctionnelles in vivo sur le comportement cellulaire, réduisant ainsi les échecs en phase avancée dus à une complexité biologique imprévue.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie confocale, en techniques de photoconversion et en séparation spectrale de la fluorescence.
- Dépend de l'accès à des systèmes confocaux à balayage laser équipés de lasers à 488, 561 et 640 nm et de jeux de filtres appropriés.
- Exige une standardisation du choix de la région d'intérêt (ROI), de la puissance laser, de la vitesse de balayage et des paramètres de pile z entre les utilisateurs afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- L'adaptation à d'autres espèces de téléostéens non apparentées au poisson zèbre peut nécessiter une optimisation de la dose d'ARNm et de l'efficacité de la photoconversion.
- Limite pratique : l'efficacité de la photoconversion dépend des niveaux d'expression protéique et de l'accessibilité des cellules cibles à la pénétration du laser dans les tissus plus épais.
