Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la Enterococcus spp. Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux

L’objectif global de ce test de PCR numérique duplex est de quantifier simultanément la contamination fécale générale et humaine dans les eaux. Ce test peut aider à répondre à des questions clés dans la surveillance de la qualité des eaux récréatives, telles que la quantité d’indicateur fécal général, c’est-à-dire d’entérocoque et, plus important encore, de marqueur HF183 associé aux matières fécales humaines, dans les eaux.

Le principal avantage de ce test est qu’il quantifie deux cibles en une seule réaction et, par rapport à la qPCR, il élimine le besoin d’exécuter des courbes standard et donc le biais et la variabilité associés. Meredith Raith, notre technicienne de recherche principale, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, préparez d’abord des concentrations de stock de 100 micromoles par litre pour toutes les amorces dans de l’eau de qualité moléculaire et les sondes dans le tampon TEPH 8, comme décrit dans le texte du protocole.

Ensuite, préparez un Master Mix en mélangeant des quantités appropriées de mélange PCR numérique, d’amorces directes et inverses, de la sonde fluorescente et de l’eau sans nucléases. Pipeter de haut en bas au moins 10 fois pour mélanger tout en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la solution. Étant donné que le master mix dPCR est plus visqueux que le master mix qPCR conventionnel, il est nécessaire d’utiliser la technique de mélange par pipetage afin de créer une solution homogène.

Cela permet une quantification précise de la dPCR en aval. Pour fabriquer le mélange d’essai pour la génération de gouttelettes pour l’analyse d’échantillons en double, pipetez 36 microlitres du Master Mix dans une plaque PCR régulière. À chacun des Master Mix de 36 microlitres, mélangez 12 microlitres de matrice d’ADN en laissant les puits de réplication correspondants vides sur la plaque.

Incluez des contrôles positifs pour vous assurer que le test fonctionne correctement. N’incluez aucun contrôle de modèle ou NTC pour vous assurer qu’il n’y a pas de contamination à l’intérieur de la plaque et pour définir la référence fluorescente plus tard pour l’analyse des données. Avant d’installer le générateur de gouttelettes, mélangez les mélanges de dosage à l’aide d’une pipette multicanaux pour pipeter les mélanges de haut en bas environ 15 fois.

Assurez-vous que la pointe de la pipette reste dans le liquide pour éviter de faire des bulles d’accès dans le mélange. Ensuite, insérez la cartouche un contenant huit puits dans un porte-cartouche blanc et cliquez sur le porte-cartouche. La cartouche un est maintenant fermement en place et ne peut pas être délogée du support lors de la génération de gouttelettes.

À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez doucement 20 microlitres du mélange de dosage dans la position médiane de l’échantillon marqué par la cartouche sans introduire de bulles d’air. Pipette dans 70 microlitres d’huile Droplet Generation sur le côté gauche de la cartouche marquée d’huile. Couvrez la cartouche avec un joint d’étanchéité, en vous assurant que le joint est plat et maintenu uniformément par les quatre tics vers le bord de la cartouche.

Appuyez sur le bouton vert du générateur de gouttelettes pour ouvrir la porte et placer la cartouche. Appuyez à nouveau sur le bouton pour fermer le générateur. Une fois la porte fermée, le bouton vert est atténué et la porte ne peut pas être rouverte.

La génération de gouttelettes commencera immédiatement et se poursuivra pendant environ une minute. Pendant que la génération de gouttelettes est en cours, placez la deuxième cartouche dans un deuxième porte-cartouche blanc et préparez-la de la même manière que pour la première cartouche. Lorsque la génération de gouttelettes est terminée, le bouton faiblement éclairé devient vert.

Ouvrez la porte du générateur de gouttelettes, retirez le porte-cartouche blanc contenant la cartouche un et mettez-le de côté. Placez la cartouche deux dans le générateur de gouttelettes. Retirez le joint de la cartouche un et jetez-le.

Ne décliquez pas le support de cartouche blanc car l’action pourrait casser les gouttelettes nouvellement générées. À l’aide d’une pipette multicanaux réglée à 40 microlitres, insérez les pointes dans la troisième colonne de la cartouche marquée de gouttelettes à un angle de 45 degrés et pipetez lentement toutes les gouttelettes. Transférez-les sur la plaque PCR finale en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi du puits à peu près à mi-chemin et en expulsant lentement les gouttelettes.

De la même manière, lorsque la génération de gouttelettes pour la cartouche deux est terminée, retirez le joint de la cartouche deux et transférez les gouttelettes générées sur la plaque PCR finale. Placez un couvercle en aluminium perçable sur le dessus de l’assiette et placez-le sur une scelleuse d’assiettes. Réglez la scelleuse à 180 degrés Celsius, appuyez sur play sur la scelleuse et scellez pendant 10 secondes.

Pour commencer cette procédure, placez la plaque PCR finale scellée dans le thermocycleur. Utilisez un thermocycleur compatible avec la plaque PCR finale et avec une vitesse de montée en température de deux degrés Celsius par seconde. Exécutez le programme thermique suivant : dix minutes à 95 degrés Celsius, suivi de 40 cycles de 30 secondes à 94 degrés Celsius et de 60 secondes à 60 degrés Celsius, suivis d’un maintien de dix minutes à 98 degrés Celsius.

Une fois le cycle terminé, transférez la plaque sur un lecteur de gouttelettes pour la mesure automatique des fluorescents dans chaque gouttelette de chaque puits. Assurez-vous que les gouttelettes sont à température ambiante avant de procéder à la lecture des gouttelettes. Commencez par ouvrir le logiciel d’accompagnement pour configurer la lecture des gouttelettes.

Dans le menu de configuration par défaut contenant le schéma d’une plaque vide de 96 puits, double-cliquez sur le puits A1 pour ouvrir le menu contenant les trois sections, Échantillon, Essai 1 et Essai 2. Dans la section Échantillon, tapez l’ID de l’échantillon dans la zone intitulée Nom et cochez la case à droite intitulée Appliquer. Ensuite, cliquez sur le menu déroulant intitulé Expérience, choisissez ROUGE pour Détection d’événements rares et cliquez sur Entrée.

Passez à la section intitulée Essai 1. Dans la section Nom, remplissez le questionnaire et cliquez sur Entrée. Dans la zone ci-dessous intitulée Type, cliquez sur le menu déroulant, choisissez Canal 1 Inconnu et cliquez sur Entrée.

Passez à la section Essai 2. Dans la section Nom, remplissez le questionnaire et cliquez sur Entrée. Dans la zone ci-dessous intitulée Type, cliquez sur le menu déroulant, choisissez Canal 2 Inconnu et cliquez sur Entrée.

Toutes les informations des étapes précédentes sont maintenant présentes dans le puits A1.Name tous les puits suivants contenant des gouttelettes. Pour économiser le temps total de configuration, cliquez sur Maj ou Ctrl pour choisir plusieurs puits simultanément. Lorsque la représentation numérique de la plaque reflète celle de la plaque physique, appuyez sur OK en bas à droite du menu.

Dans le nouveau menu qui s’affiche en haut du schéma de plaque, sous le modèle, choisissez Enregistrer sous, puis nommez et enregistrez la plaque. À gauche de l’écran, cliquez sur Exécuter et sélectionnez le jeu de teintures approprié dans la fenêtre contextuelle des options d’exécution. La collecte des données sera lancée et s’affichera en temps réel dans le logiciel.

Lorsque le lecteur a terminé et qu’une boîte indiquant Exécuter terminé s’affiche, cliquez sur OK. Vérifiez la séparation entre les gouttelettes positives et négatives. Assurez-vous que les fluorescents dans toutes les gouttelettes dans les puits NTC sont proches de la ligne de base. Cliquez sur le bouton intitulé Événements.

En bas, cliquez sur la case nommée Unique et à droite de l’histogramme présenté, cliquez sur la case nommée Total pour afficher le nombre total de gouttelettes acceptées par puits. Excluez tous les puits contenant moins de 10 000 gouttelettes en maintenant la touche de contrôle enfoncée et en cliquant sur les puits à exclure. Cliquez sur le bouton noté Amplitude 1D pour régler le seuil fluorescent à environ un écart-type des gouttelettes négatives dans les puits NTC pour les deux cibles.

Tout à gauche de l’écran, sous l’affichage de deux boutons de seuil, choisissez l’icône à droite qui est traversée par une ligne horizontale rose continue. Cliquez sur la case à gauche de Définir le seuil sous chacun des graphiques d’amplitude et entrez les valeurs de seuil de fluorescence appropriées. Les concentrations cibles en copie par réaction de microlitre sont ensuite calculées automatiquement.

Exportez les résultats dans un fichier CSV en cliquant sur le bouton Exporter dans le coin supérieur gauche de l’écran Amplitude 1D. Dans le fichier CSV, multipliez par quatre la concentration cible exportée pour la convertir de copie de la réaction cible par microlitre en copie du modèle d’ADN cible par microlitre. Cette figure compare les formats duplex et simplex du test PCR numérique.

Les panneaux de gauche et de droite affichent respectivement Enterococcus et HF183 Quantification avec les coefficients de corrélation correspondants entre les résultats duplex et simplexes. Les lignes pleines indiquent les lignes de régression et l’ombrage gris indique les erreurs-types correspondantes. Différents types d’échantillons sont indiqués par les symboles.

Les résultats sont très cohérents et souvent impossibles à distinguer, que l’entérocoque et le HF183 soient mesurés simultanément dans une réaction ou séparément dans deux réactions. Le test PCR numérique peut également tolérer l’inhibiteur à des concentrations d’un à deux ordres de grandeur supérieures à celles tolérées par ses homologues qPCR. Cette figure montre la quantification par qPCR et PCR numérique du marqueur HF183 dans l’ADN des eaux usées propres, augmentée par l’augmentation des concentrations d’acide humique qui inhibe la PCR.

La quantification attendue du HF183 en l’absence d’inhibiteurs est définie comme un repli de confiance à 95 % entre les deux lignes pointillées horizontales. La PCR numérique désignée par des triangles continue de fournir une quantification précise jusqu’à une concentration d’acide humique de 15 nanogrammes par réaction de microlitre, tandis que la qPCR désignée par des croisements commence à sous-estimer à un nanogramme par microlitre et devient complètement inhibée à cinq nanogrammes par microlitre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer ce test PCR numérique entéral HF183 Duplex Droplet ou un autre test similaire à l’aide de différentes amorces et sondes.

Depuis le développement de ce test duplex, qui a été publié dans water research en 2015, nous avons développé et validé une multitude d’autres tests PCR numériques qui ciblent les bactéries fécales indicatrices générales, les marqueurs de suivi microbien et les agents pathogènes d’origine hydrique. Ces tests fournissent une quantification directe et impartiale de leur cible, et ils deviennent des alternatives utiles aux tests qPCR dans le domaine de l’analyse de la qualité de l’eau.