Name: Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la Enterococcus spp. Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Découvrez un test PCR numérique duplex pour quantifier simultanément Enterococcus spp. et le marqueur HF183 dans les eaux récréatives. Cette méthode élimine les courbes étalon et réduit les biais pour une surveillance fiable de la qualité de l'eau.

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Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.

1. Assay Mélange Préparation <ol><li> Faire des concentrations 100 pmol / L de stock pour toutes les amorces dans l&#39; eau moléculaire de qualité et des sondes de pH 8 tampon TE [Entéro F1A, Entéro R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. Note: Les sondes pour les deux cibles sont marquées par fluorescence avec différents fluorophores 7 , comme indiqué dans la liste des matériaux / équipement. </li><li> Préparer mélange maître en mélangeant, par réaction prévu, 12 ul mélange PCR numérique (2x stocks, voir Liste des Matériaux / Équipement), 0,216 ul chacun avant et amorce, 0,06 ul de chaque sonde fluorescente inverse, et 5.016 pi d&#39;eau sans nucléase (concentration finale : 900 nM de chaque amorce, 250 nM chaque sonde). Pipeter haut et en bas au moins 10 fois pour mélanger tout en prenant soin de ne pas introduire de bulles d&#39;air dans la solution. </li><li> Pipette master mix de 18 pi (de l&#39;étape 1.2) dans un tube PCR régulier ou d&#39;une plaque, le mélange dans 6 pi de matrice d&#39;ADN (extrait comme décrit Previously 13) pour faire mélange d&#39;essai pour la génération de gouttelettes. Si vous utilisez des échantillons en double exemplaire, pipette 36 pi de mélange maître et 12 matrice d&#39;ADN ul dans chaque puits. Laissez les puits répliqués correspondant vide sur la plaque. Inclure les contrôles positifs (voir la liste des matériaux / équipement) et aucun contrôle de modèle (NTC) (ie avec l&#39; eau de qualité moléculaire utilisé comme modèle). Remarque: Le contrôle positif est nécessaire pour assurer le dosage fonctionne correctement et le CNT est nécessaire pour assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de contamination à l&#39;intérieur de la plaque et de fixer la ligne de base fluorescente plus tard dans l&#39;analyse des données. Les nouveaux utilisateurs sont invités à utiliser les deux échantillons d&#39;ADN non dilué et dilué. </li></ol> 2. Génération Droplet et PCR Setup Plate <ol><li> Mélanger les mélanges de dosage par aspiration vers le bas environ 15 fois à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. Assurez-vous que la pointe de la pipette reste dans le liquide pour éviter de faire des bulles en excès dans le mélange. </li><li> Inscartouche de ert 1 (contenant 8 puits) dans un support de cartouche blanc et cliquez sur la fermeture de porte-cartouche. Cartouche 1 est maintenant fermement en place et ne peut pas être délogé du support tout en générant des gouttelettes. À l&#39;aide d&#39;une pipette à canaux multiples, le transfert en douceur 20 ul de mélange de dosage dans la position médiane de la cartouche marquée «échantillon» sans introduire de bulles d&#39;air. </li><li> Pipeter dans 70 ul d&#39;huile de génération de gouttelettes sur le côté gauche de la cartouche (marquée «Oil»). </li><li> cartouche de couverture avec un joint en vous assurant que le joint est plat et maintenu uniformément par le 4 ticks vers le bord de la cartouche. Appuyez sur le bouton vert allumé sur le générateur de gouttelettes pour ouvrir et placer la cartouche. Appuyez sur le bouton vert allumé à nouveau pour fermer le générateur. Remarque: Une fois que la porte se ferme, le bouton est grisé, la porte ne peut pas être rouvert et la génération de gouttelettes commence immédiatement poursuivre pendant environ 1 min. </li><li> Si faire plus de 8 réactions, lieu cartouche 2 dans un secondporte-cartouche blanc et préparer de la même manière que la cartouche 1, tandis que la génération des gouttelettes est en cours pour gagner du temps d&#39;installation totale. </li><li> Ouvrez la porte du générateur de gouttelettes lorsque le bouton dim éclairé devient vert indiquant la fin de la génération de gouttelettes. Retirez le support blanc de la cartouche contenant la cartouche 1, mis de côté, et le lieu cartouche 2 sur le générateur de gouttelettes. </li><li> Retirez le joint de la cartouche 1 et le jeter. transférer doucement le volume total (environ 40 pi) de gouttelettes générées à partir de la troisième colonne de la cartouche (marquée &#39;Droplets&#39;) sur une plaque PCR finale (maintenue à la température ambiante) pour le cyclage thermique. Remarque: Ne décochez le porte-cartouche blanche que l&#39;action peut briser les gouttelettes nouvellement générées; seulement ouvrir le support de la cartouche après que les gouttelettes ont été transférées à la plaque finale. </li><li> Répétez les étapes 2,1-2,7 pour les échantillons supplémentaires. </li><li> Lorsque toutes les gouttelettes sont dans la plaque finale PCR, placez un perçablecouverture feuille sur le dessus de la plaque et la placer sur un scellant pour plaques. Réglez le scellant à 180 ° C, appuyez sur &#39;Play&#39; sur le scellant et laisser joint pendant 10 sec. </li></ol> 3. Cyclisme thermique et Droplet lecture <ol><li> Placer la plaque scellée sur le cycleur thermique, qui soit compatible avec la plaque PCR finale utilisée dans l&#39;étape 2.7, et une vitesse de montée en puissance de la température de 2,0 ° C / sec. </li><li> Exécutez le programme thermique comme suit: 10 min à 95 ° C, suivie de 40 cycles de 30 s à 94 ° C et 60 sec à 60 ° C, suivie d&#39;une 10 min maintien à 98 ° C (en option: prise finale à 4 ou 15 ° C). </li><li> À la fin du cyclage, transférer la plaque à un lecteur Droplet pour la mesure automatique de la fluorescence dans chaque goutte dans chaque puits. Vous pouvez également stocker la plaque à 4 ° C jusqu&#39;à 3 jours avant gouttelette lecture. Assurez-vous que les gouttelettes sont à la température ambiante avant de procéder à la lecture. <ol><li> Ouvrez le logiciel d&#39;accompagnement pour configurer la lecture des gouttelettes. Dansle menu par défaut &quot;Setup&quot; contenant un schéma d&#39;une plaque de 96 puits vide, double cliquez sur le puits A1 pour ouvrir le menu contenant trois sections: &#39;exemples,&#39; &#39;Assay 1&#39; et &#39;Test 2.&#39; </li><li> Dans la section &quot;Sample&quot; tapez l&#39;ID d&#39;échantillon dans la case &quot;Nom&quot; et appuyez sur Entrée ou cocher la case à la droite marquée «Appliquer». Ensuite, cliquez sur le menu déroulant étiqueté «Experiment» et choisissez «RED» (détection d&#39;événements rares) et cliquez sur entrer. </li><li> Déplacer vers la section notée &#39;Essai 1.&#39; Dans la section &quot;Nom&quot; remplir le dosage (par exemple Enterococcus) et cliquez sur entrer. Dans la boîte ci-dessous intitulée &quot;Type&quot; cliquez sur le menu déroulant et choisissez «Canal 1 Unknown&quot; et cliquez sur entrer. </li><li> Déplacer vers la section notée &#39;Assay 2.&#39; Dans la section &quot;Nom&quot; remplir le dosage (par exemple HF183) et cliquez sur entrer. Dans la boîte ci-dessous intitulée «Type» cliquez sur le menu déroulant uned Sélectionnez &#39;Channel 2 Unknown &quot;et cliquez sur entrer. Toutes les informations à partir étapes 3.3.2 à 3.3.4 est maintenant présent dans le puits A1. </li><li> Nom tous les puits suivants contenant des gouttelettes. Pour gagner du temps de configuration totale, cliquez sur &quot;Shift&quot; ou &quot;Ctrl&quot;, de choisir plusieurs puits simultanément. </li><li> Lorsque la représentation numérique de la plaque reflète la plaque physique, appuyez sur &#39;OK&#39; en bas à droite du menu. Dans le nouveau menu qui apparaît en haut du schéma de la plaque, sous la section &quot;Modèle&quot; choisissez «Enregistrer sous» et le nom et enregistrer la plaque. </li><li> A gauche de l&#39;écran cliquez sur &quot;Exécuter&quot; et sélectionnez Dye Set approprié dans le pop-out fenêtre &quot;Options d&#39;exécution&quot;. La collecte des données se déclenche et affichées en temps réel dans le logiciel. </li></ol></li></ol> 4. Analyse des données et rapports <ol><li> Lorsque le lecteur est terminé et une boîte apparaît indiquant «Run Complete &#39;, cliquez sur&#39; OK &#39;. Remarque: Le douxWare affiche le fichier final de données sous la rubrique «Analyse» du logiciel. Dans cette optique, le logiciel a tous les puits de la plaque sélectionnés et par défaut tracé de données le «2D Amplitude». </li><li> Vérifier la séparation entre les gouttelettes positives et négatives. Assurez-vous que la fluorescence dans toutes les gouttelettes dans les puits NTC sont près de la ligne de base. </li><li> Cliquez sur le bouton intitulé «Événements». A droite de l&#39;histogramme présenté cliquez sur la case nommée «Total» et la boîte nommée &quot;single&quot; dans le bas pour afficher le nombre total de gouttelettes acceptées par puits. Exclure tous les puits contenant &lt;10.000 gouttelettes 7 en maintenant la touche Ctrl et en cliquant sur ​​le bien (s) à exclure. </li><li> Cliquez sur le bouton désigné comme «1D Amplitude» pour définir le seuil de fluorescence à environ un écart-type (500-700 unités de fluorescence) au-dessus des gouttelettes négatives dans les puits NTC pour les deux cibles. A l&#39;extrême gauche de l&#39;ONU d&#39;écrander &#39;Analyser Auto&#39; l&#39;montrant deux boutons de seuil, sélectionnez l&#39;icône à la droite qui a une ligne horizontale solide rose qui la traverse. </li><li> Cliquez dans la case à gauche du &#39;Seuil Set&#39; sous chacun des graphiques d&#39;amplitude et entrez les valeurs de seuil de fluorescence appropriés. Les concentrations cibles dans la copie par réaction ul sont ensuite calculés automatiquement. Remarque: Les seuils ne doivent pas être identiques pour les différentes cibles. </li><li> Exporter les résultats dans un fichier .csv en cliquant sur le bouton &quot;Exporter&quot; dans le coin supérieur gauche de l&#39;écran 1D Amplitude. Dans le fichier .csv, multiplier la concentration cible exportée par 4 pour le convertir de la copie de la cible (23S gène d&#39;Enterococcus spp. , Ou le marqueur de HF183) par réaction ul pour copier de la cible par ul matrice d&#39;ADN. </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Il y a quelques étapes critiques dans le protocole. Tout d&#39;abord, le mélange des mélanges d&#39;essai peut être difficile parce que le mélange maître est plus visqueux que les mélanges maîtres qPCR classiques. tourbillonnement simple peut conduire à un mélange insuffisant, ce qui à son tour conduit à une distribution non uniforme des matrices d&#39;ADN dans les mélanges d&#39;essai, puis dans les gouttelettes. La technique de mélange par pipetage décrit dans le protocole doit être suivi pour assurer la quantificatio...

Les méthodes quantitatives PCR (qPCR) ont été largement utilisés à des fins récréatives surveillance de la qualité de l&#39;eau et microbiennes des applications de suivi de la source, car ils sont plus rapides, plus flexibles et spécifiques par rapport aux méthodes basées sur la culture traditionnelle. Par conséquent, qPCR est recommandé pour obtenir des résultats de surveillance des eaux rapides des indicateurs fécaux généraux tels que Enterococcus spp. , Dans la version révisée de l&#39; EPA eau récréative des critères de qualité 1. De nombreux essais qPCR ont également été mis au point et validé pour identifier les sources de contamination fécale dans les eaux environnementales 2. Parmi ceux - ci, le dosage des marqueurs HF183 sont parmi les plus fréquemment utilisés pour identifier la contamination fécale 3 humaine associée. Cependant, les résultats de qPCR peuvent souvent être biaisés car elles reposent sur des courbes standards pour la quantification. qPCR quantifie concentrations inconnues de cible dans les échantillons par interpolation de leur cycle de quantification (Cq) à partir d&#39;un stancourbe de norme qui décrit une relation linéaire entre Cq et la quantité logarithmique d&#39;un ensemble de normes en série dilué. Le manque de matériel de référence standard fiable et cohérente peut donc fausser considérablement les résultats de qPCR. Des études ont montré que les résultats de qPCR différaient d&#39;environ un demi - log en utilisant des normes de différents fournisseurs et 4 par 2 fois en utilisant différents lots de normes du même fournisseur 5. PCR (RCPH) La technologie numérique quantifie un échantillon inconnu en comptant la fréquence des points positifs dans un grand nombre de RFP miniatures qui sont générés par le partitionnement d&#39; un qPCR en vrac dans des milliers ou des millions de nanolitre uniforme ou réactions picolitres 6. Il est mentionné que gouttelette PCR numérique (c. -à cet article) ou une chambre PCR numérique, respectivement, si les partitions sont des gouttelettes d&#39; eau dans l&#39;huile ( par exemple, cet article) ou de petites chambres sur une puce. Une concentration plus élevée de l&#39;échantillon se traduira par la présence de l&#39;ADN cible(PCR donc positif) dans une proportion plus élevée de partitions, une relation approchée par la loi de Poisson. En tant que tel, les résultats binaires (PCR positive ou négative) sont enregistrées et la fréquence de gouttelettes positives sont utilisées pour calculer les concentrations d&#39;échantillons inconnus directement par approximation de Poisson, ce qui élimine la nécessité d&#39;une courbe standard comme dans qPCR. Cette nature binaire de quantification par PCR numérique offre des avantages supplémentaires sur qPCR 7. Parce que l&#39;amplification retardé peut encore obtenir une PCR positive RCPH quantification est plus robuste contre l&#39;inhibition qui réduit l&#39;efficacité de l&#39;amplification. De même, RCPH quantification ne soit pas affectée par la variabilité des valeurs Cq comme est qPCR, conduisant à une plus grande précision de RCPH par rapport à qPCR 8-10. En outre, le procédé de séparation assure une très petite quantité d&#39;ADN cible présente dans chaque goutte, ce qui réduit efficacement la concurrence du substrat (pendant amplification des différentes cibles d&#39;ADN) qui sont des obstacles communs à la réalisation de duplexage (ie un test mesure simultanément deux cibles d&#39;ADN) dans qPCR. En tant que tel, si l&#39; exécution en duplex ou simplex (ie une cible est mesurée en un seul essai) RCPH produit quantification presque indiscernables des deux cibles 7,11. Le but du test de PCR numérique (EntHF183 RCPH) décrit dans cet article est d&#39;obtenir une quantification directe simultanée de l&#39;indicateur fécal général Enterococcus spp. Et le marqueur HF183 humain-fécale associée à une précision améliorée, la reproductibilité et la robustesse contre l&#39; inhibition par rapport à son qPCR homologues. Ce test a été utilisé avec succès pour quantifier la contamination fécale dans l&#39; eau douce de l&#39; environnement, l&#39; eau de mer, et diverses matières fécales 7, mais peut également être appliquée à d&#39;autres types d&#39;eaux et des eaux usées. Ce test est très prometteur pour l&#39;analyse de sédiments ou des sols en raison de sons grande tolérance à l&#39;inhibition, mais des tests supplémentaires sont nécessaires en raison de la complexité du mélange inhibiteur dans ces types d&#39;échantillons.

<table><tbody><tr><td>Microtubes à faible liaison</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>Pour le stockage de réactifs, d’échantillons/production de mélanges maîtres</td></tr><tr><td>Eau libre de nucléases</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE Tampon de pH 8</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>Hardshell 96 Well Plate</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>Pour le mélange maître initial et l’inoculation d’échantillons</td></tr><tr><td>Film d’étanchéité</td> <td>en aluminiumBioRad</td><td>359-0133</td><td>Pour sceller la plaque d’échantillonnage</td></tr><tr><td>Générateur de gouttelettes</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>Huile de génération de gouttelettes</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartouche</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Porte-cartouche</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Joint</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956 ; l pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>Pour le tannage d’échantillons/master mix à cartidge</td></tr><tr><td>200 &#956 ; l pointes de pipette</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>Pour le transfert des gouttelettes vers la plaque Twin.Tec finale</td></tr><tr><td>Twin.Tec 96 Well Plate</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>Pour le cycle thermique et la lecture des gouttelettes</td></tr><tr><td>finales Feuille de thermoscellage perçable</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>Pour sceller la plaque Twin.Tec avant le thermocyclage</td></tr><tr><td>PX1 Scelleuse de plaques PCR</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Thermalcycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96 et C1000</td><td>Seul le thermocycleur est nécessaire, pas d’optique</td></tr><tr><td>QX100 Lecteur de gouttelettes</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de gouttelettes</td><td>Huile BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Droplet PCR Supermix&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>i.e. le mélange de PCR numérique dans le logiciel</td></tr><tr><td>manuscrit QuantaSoft (v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp ;</td><td>QX100&nbsp ;</td><td>Pour l’affichage, l’analyse et l’exportation de données ddPCR</td></tr><tr><td>Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>Un autre fournisseur peut être utilisé</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCTCCATCATT</td><td>Un autre fournisseur peut être utilisé</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>Un autre fournisseur peut être utilisé, mais le florophore doit être FAM</td></tr><tr><td>HF183 Forward Primer ( HF183-1)</td><td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>Un autre fournisseur peut être utilisé</td></tr><tr><td>HF183 Reverse Primer (BthetR1)</td><td>Operon</td><td>CGTAGGAGTGGGGACCGTGT</td><td>Un autre fournisseur peut être utilisé</td></tr><tr><td>HF183 Sonde (BthetP1)</td><td>Operon</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>Un autre fournisseur peut être utilisé, mais le florophore doit être HEX (si vous utilisez VIC, la compensation matricielle appropriée doit être choisie. &nbsp ;</td></tr><tr><td>Mélange</td><td></td><td></td><td>d’ADN génomique E. faecalis et de plasmide standard HF183 (commandé auprès de l’IDT). Pour des méthodes détaillées de culture E. faecalis et des séquences du plasmide HF183 ordonné, veuillez consulter Cao et al. 2015 (doi :10.1016/j.watres.2014.12.008). Les étalons d’ADN Enterococcus disponibles dans le commerce (ATCC 29212Q-FZ) peuvent également être utilisés dans le contrôle positif à la place de l’ADN génomique E. faecalis préparé en laboratoire.</td></tr></tbody></table>

un test pcr duplex numérique pour simultanée quantification de la<em&gt; enterococcus spp.</em&gt; et le hf183 marqueur humain fecal associé dans les eaux

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Ce manuscrit décrit un test de PCR numérique duplex (EntHF183 RCPH) pour la quantification simultanée de Enterococcus spp. Et le marqueur humain HF183 fécale associée. Le EntHF183 duplex RCPH (dénommé EntHF183 RCPH de maintenant) test utilise les mêmes amorces et sondes séquences que ses PCR quantitative (qPCR) homologues individuels publiés. De même, les mêmes procédures de filtration d&#39;eau et d&#39;extraction d&#39;ADN effectuée avant qPCR sont suivies avant d&#39;exécuter RCPH. Cependant, le dosage duplex DPCR présente plusieurs avantages par rapport aux essais de qPCR. Plus important encore, le dosage RCPH élimine la nécessité d&#39;exécuter une courbe standard et donc, le biais et la variabilité associée, par quantification directe de ses objectifs. En outre, alors que duplexage (c. -à- quantification simultanée) Enterococcus et HF183 en qPCR conduit souvent à une sous - estimation grave de la cible moins abondante dans un échantillon, RCPH fournit une quantification cohérente des deux cibles, aiguisentelle quantifié individuellement ou simultanément dans la même réaction. Le dosage DPCR est également capable de tolérer des concentrations d&#39;inhibiteur de PCR qui sont un à deux ordres de grandeur plus élevées que celles tolérées par qPCR. Ces avantages font l&#39;essai EntHF183 RCPH particulièrement intéressante, car elle fournit simultanément des informations précises et reproductibles à la fois sur la contamination générale et humaine associée fécale dans les eaux environnementales sans la nécessité d&#39;exécuter deux essais qPCR séparés. En dépit de ses avantages sur qPCR, la limite de quantification supérieure du dosage RCPH avec instrumentation disponible actuellement est d&#39;environ quatre ordres de grandeur inférieure à celle obtenue par qPCR. Par conséquent, la dilution est nécessaire pour la mesure des concentrations élevées d&#39;organismes cibles, tels que ceux qui sont habituellement observés à la suite de déversements d&#39;eaux usées.

Un bon run EntHF183 duplex RCPH devrait se traduire par nombre relativement élevé de gouttelettes reconnues (ca. 10,000-17,000) et différence relativement importante (environ 5000) entre les valeurs de fluorescence pour gouttelettes négatives et positives 7. Exceptionnellement faible nombre de gouttelettes indique probablement des problèmes dans le processus de génération de gouttelettes, et un seuil de 10.000 gouttelettes est proposé sur la base des données ...

Ce manuscrit décrit un essai PCR duplex numérique qui peut être utilisé pour quantifier simultanément Enterococcus spp. , Et les marqueurs génétiques HF183 comme indicateurs de contamination fécale générale et humaine associée dans les eaux récréatives.

Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

L'objectif général de ce test de PCR numérique en duplex est de quantifier simultanément la contamination fécale générale et celle associée aux humains dans les eaux. Ce test peut aider à répondre à des questions clés concernant la surveillance de la qualité de l'eau de loisir, telles que : quelle quantité d'indicateur fécal général, c'est-à-dire d'Entérococcus, et surtout du marqueur HF183 associé aux matières fécales humaines, se trouve dans les eaux ?L'avantage principal de ce test est qu'il quantifie deux cibles dans une seule réaction et, par rapport à la qPCR, élimine la nécessité d'effectuer des courbes standards, réduisant ainsi les biais et la variabilité associés. La procédure sera démontrée par Meredith Raith, notre technicienne de recherche principale. Pour commencer cette procédure, préparez d'abord des concentrations stock de 100 micromoles par litre pour tous les amorces dans de l'eau de qualité moléculaire et pour les sondes dans un tampon TEPH 8, comme décrit dans le texte du protocole.Ensuite, préparez un mélange maître en combinant les volumes appropriés de mélange de PCR numérique, d'amorces sens et antisens, de la sonde fluorescente et d'eau sans nucléase. Pipetez de haut en bas au moins 10 fois pour bien mélanger, tout en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air dans la solution. Étant donné que le mélange maître de dPCR est plus visqueux que le mélange maître conventionnel de qPCR, il est nécessaire d'utiliser la technique de mixage par pipetage afin d'obtenir une solution homogène.Ceci permet une quantification précise par dPCR en aval. Pour préparer le mélange d'analyse pour la génération de gouttelettes afin d'analyser les échantillons en duplicata, pipetez 36 microlitres du mélange maître dans une plaque PCR ordinaire. À chacun des 36 microlitres de mélange maître, ajoutez 12 microlitres de matrice d'ADN, en laissant vides les puits correspondants des répliques sur la plaque.Inclure des contrôles positifs pour s'assurer que le test fonctionne correctement. Inclure des contrôles sans matrice, ou NTC, afin de vérifier l'absence de contamination dans la plaque et de définir ultérieurement la ligne de base de fluorescence pour l'analyse des données. Avant de préparer le générateur de gouttelettes, mélanger les mélanges de test à l'aide d'une pipette multicanal en aspirant et en expulsant les mélanges environ 15 fois.Veillez à ce que la pointe de la pipette reste immergée dans le liquide afin d'éviter la formation de bulles d'air dans le mélange. Ensuite, insérez la cartouche un contenant huit puits dans un support de cartouche blanc et refermez le support de cartouche d'un clic. La cartouche un est désormais bien en place et ne peut pas être délogée du support pendant la génération des gouttelettes.À l’aide d’une pipette multicanal, transférez délicatement 20 microlitres du mélange d’essai au centre de la cartouche marquée « échantillon », sans introduire de bulles d’air. Ajoutez 70 microlitres d’huile de génération de gouttelettes sur le côté gauche de la cartouche marqué « huile ». Recouvrez la cartouche d’un joint en veillant à ce qu’il soit bien à plat et uniformément maintenu par les quatre repères situés vers le bord de la cartouche.Appuyez sur le bouton éclairé en vert du générateur de gouttelettes pour ouvrir la porte et insérez la cartouche. Appuyez à nouveau sur le bouton pour fermer le générateur. Une fois la porte fermée, le bouton vert s’assombrit et la porte ne peut plus être rouverte.La génération de gouttelettes commencera immédiatement et se poursuivra pendant environ une minute. Pendant que la génération de gouttelettes est en cours, placez la cartouche deux dans un deuxième support de cartouche blanc et préparez-la de la même manière que la cartouche un. Lorsque la génération de gouttelettes est terminée, le bouton faiblement éclairé deviendra vert.Ouvrez la porte du générateur de gouttelettes, retirez le support blanc contenant la cartouche numéro un et mettez-le de côté. Placez la cartouche numéro deux dans le générateur de gouttelettes. Retirez le joint de la cartouche numéro un et jetez-le.Ne pas désengager le support de cartouche blanc car cette action pourrait rompre les gouttelettes nouvellement formées. À l’aide d’une pipette multicanal réglée à 40 microlitres, insérer les embouts dans la troisième colonne de la cartouche marquée « gouttelettes » selon un angle de 45 degrés et aspirer lentement toutes les gouttelettes. Les transférer vers la plaque finale de PCR en appuyant l’embout de la pipette contre la paroi du puits à environ mi-hauteur, puis expulser lentement les gouttelettes.De la même manière, lorsque la génération de gouttelettes pour la cartouche deux est terminée, retirez le joint de la cartouche deux et transférez les gouttelettes générées dans la plaque finale de PCR. Placez une couverture en feuille perforable sur la plaque et positionnez-la sur un scelleur de plaque. Réglez le scelleur à 180 degrés Celsius, appuyez sur lecture sur le scelleur, et scellez pendant 10 secondes.Pour commencer cette procédure, placez la plaque PCR finale scellée dans le thermocycleur. Utilisez un thermocycleur compatible avec la plaque PCR finale et possédant une vitesse de rampe thermique de deux degrés Celsius par seconde. Exécutez le programme thermique suivant : dix minutes à 95 degrés Celsius, suivies de 40 cycles de 30 secondes à 94 degrés Celsius et 60 secondes à 60 degrés Celsius, puis une pause de dix minutes à 98 degrés Celsius.Une fois le cyclage terminé, transférez la plaque vers un lecteur de gouttelettes pour la mesure automatique de la fluorescence dans chaque gouttelette de chaque puits. Assurez-vous que les gouttelettes sont à température ambiante avant de procéder à la lecture des gouttelettes. Commencez par ouvrir le logiciel associé afin de configurer la lecture des gouttelettes.Dans le menu de configuration par défaut contenant le schéma d'une plaque vide de 96 puits, double-cliquez sur le puits A1 pour ouvrir le menu comprenant trois sections : Échantillon, Essai 1 et Essai 2. Dans la section Échantillon, saisissez l'identifiant de l'échantillon dans la zone intitulée Nom et cochez la case située à droite marquée Appliquer. Ensuite, cliquez sur le menu déroulant intitulé expérience, sélectionnez RED pour détection d'événements rares, puis cliquez sur Entrée.Passez à la section intitulée « Assay 1 ». Dans la section Nom, saisissez le test et appuyez sur Entrée. Dans la zone ci-dessous intitulée Type, cliquez sur le menu déroulant, sélectionnez « Channel 1 Unknown » et appuyez sur Entrée.Passez à la section intitulée Essai 2. Dans la section Nom, saisissez l'essai et appuyez sur Entrée. Dans la zone située ci-dessous, intitulée Type, cliquez sur le menu déroulant, sélectionnez Inconnu canal 2 et cliquez sur Entrée.Toutes les informations provenant des étapes précédentes sont désormais présentes dans le puits A1. Nommez tous les puits suivants contenant des gouttelettes. Pour réduire le temps total de configuration, appuyez sur Maj ou Ctrl pour sélectionner plusieurs puits simultanément. Lorsque la représentation numérique de la plaque correspond à la plaque physique, appuyez sur OK en bas à droite du menu.Dans le nouveau menu qui apparaît en haut du schéma de la plaque, sélectionnez Enregistrer sous dans la section Modèle, puis nommez et enregistrez la plaque. À gauche de l'écran, cliquez sur Exécuter et sélectionnez le jeu de colorants approprié dans la fenêtre contextuelle Options d'exécution. La collecte des données commencera et sera affichée en temps réel dans le logiciel.Lorsque le lecteur a terminé et qu'une boîte apparaît indiquant « Exécution terminée », cliquez sur OK. Vérifiez la séparation entre les gouttelettes positives et négatives. Assurez-vous que les fluorescences de toutes les gouttelettes dans les puits de contrôle négatif (NTC) sont proches de la ligne de base. Cliquez sur le bouton intitulé Événements.En bas, cliquez sur la case nommée Simple et, à droite de l'histogramme affiché, cliquez sur la case nommée Total pour afficher le nombre total de gouttelettes acceptées par puits. Excluez tous les puits contenant moins de 10 000 gouttelettes en maintenant la touche de contrôle enfoncée et en cliquant sur les puits à exclure. Cliquez sur le bouton intitulé Amplitude 1D pour régler le seuil de fluorescence à environ un écart-type des gouttelettes négatives dans les puits Témoin sans matrice pour les deux cibles.À l'extrême gauche de l'écran, sous Auto Analyze où figurent deux boutons de seuil, choisissez l'icône située à droite, qui comporte une ligne horizontale rose continue. Cliquez sur la case située à gauche de Définir le seuil sous chacun des graphiques d'amplitude et saisissez les valeurs de seuil de fluorescence appropriées. Les concentrations cibles en copies par microlitre de réaction sont alors automatiquement calculées.Exporter les résultats dans un fichier CSV en cliquant sur le bouton Exporter dans le coin supérieur gauche de l'écran d'amplitude 1D. Dans le fichier CSV, multiplier la concentration cible exportée par quatre pour la convertir d'une copie de cible par microlitre de réaction en copie de cible par microlitre de matrice d'ADN. Cette figure compare les formats duplex et simplexe du test de PCR numérique.Les panneaux gauche et droit affichent respectivement la quantification d'Enterococcus et d'HF183, ainsi que les coefficients de corrélation correspondants entre les résultats en duplex et en simplex. Les lignes continues indiquent les droites de régression et la zone grise indique les erreurs standards correspondantes. Les différents types d'échantillons sont indiqués par des symboles.Les résultats sont très cohérents et souvent indistinguables, que Enterococcus et HF183 soient mesurés simultanément dans une même réaction ou séparément dans deux réactions. L'essai de PCR numérique peut également tolérer des inhibiteurs à des concentrations supérieures d'un à deux ordres de grandeur par rapport à ceux tolérés par ses homologues en qPCR. Cette figure montre la quantification par qPCR et par PCR numérique du marqueur HF183 dans de l'ADN d'eaux usées purifiées additionné de concentrations croissantes d'acide humique, qui inhibe la PCR.La quantification attendue de HF183 en l'absence d'inhibiteurs est définie par un intervalle de confiance à 95 % situé entre les deux lignes pointillées horizontales. La PCR numérique, indiquée par des triangles, continue de fournir une quantification précise jusqu'à une concentration d'acide humique de 15 nanogrammes par microlitre de réaction, tandis que la qPCR, indiquée par des croix, commence à sous-estimer à partir d'un nanogramme par microlitre et devient complètement inhibée à cinq nanogrammes par microlitre. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer ce dosage entéral en duplex HF183 par PCR numérique en gouttelettes ou un autre dosage similaire utilisant des amorces et sondes différentes.Depuis le développement de ce test duplex, publié dans Water Research en 2015, nous avons mis au point et validé un grand nombre d'autres tests d'analyse par PCR numérique ciblant des bactéries indicatrices fécales générales, des marqueurs de traçage microbien et des agents pathogènes hydriques. Ces tests permettent une quantification directe et impartiale de leurs cibles et deviennent des alternatives utiles aux tests d'analyse par qPCR dans le domaine du contrôle de la qualité de l'eau.

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