Phage médiée Livraison de Targeted ARNs Construit pour faire tomber l'expression génique dans E. coli

L’objectif global de cette procédure est d’éliminer les gènes d’intérêt dans une population croissante d’E. coli. Les knockdowns de gènes sont souvent utilisés pour explorer des questions de base sur la fonction des gènes. Ces méthodes peuvent également avoir des applications en biologie synthétique.

Par exemple, pour réduire au silence les gènes indésirables comme les facteurs de virulence. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée en cultures discontinues d’E.coli sans modification génétique préalable, avec des résultats observables juste après quelques heures. Pour commencer, à l’aide d’un plasmide contenant une cassette d’expression d’ARNs conçue selon le protocole texte, effectuez une mutagenèse dirigée sur la séquence en identifiant d’abord la séquence guide à 24 paires de bases dans la cassette d’expression.

Concevez et synthétisez des amorces avant et arrière avec de courtes régions d’homologie avec la cassette d’ARNs existante, flanquant la nouvelle séquence guide de 24 paires de bases. Préparez une culture de cinq millilitres d’E. coli dans LB et d’antibiotiques portant le phagemide d’expression de l’ARNs modèle. Faites pousser les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant.

Après avoir extrait et purifié le phagemme d’ARNs matrice de la culture, préparez deux réactions PCR, en utilisant 10 à 50 fois la quantité recommandée de matrice d’ADN pour le phagemme d’ARNs et la polymérase haute fidélité. Préparez une réaction avec l’amorce avant et une autre avec l’amorce inverse. Après avoir utilisé des conditions de PCR standard pour exécuter les réactions, combinez les deux réactions dans un tube de microcentrifugation.

Ensuite, recuire les produits en les chauffant à 98 degrés Celsius dans un bain d’eau bouillante. Éteignez immédiatement la source de chaleur et laissez le bain revenir lentement à température ambiante au cours des deux prochaines heures. Pour éliminer l’ARNs matrice non muté, ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction DpnI au mélange et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure, ou pendant le temps recommandé par le fabricant pour une digestion complète.

Ensuite, transformez des cellules E. coli chimiquement compétentes avec un à cinq microlitres de produit PCR recuit. Ensuite, isolez les colonies individuelles par placage sélectif sur des plaques LB avec des antibiotiques. Vérifier l’incorporation de la séquence guide correcte avec la PCR de la colonie.

Utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour prélever une petite quantité de cellules d’une seule colonie transformée. Ajoutez les cellules collectées à 50 microlitres d’eau sans nucléases dans un tube de microcentrifugation et mélangez par pipetage. Ensuite, à l’aide d’un thermocycleur de paillasse ou d’un bain-marie bouillant, lysez les cellules en les chauffant à 95 degrés Celsius pendant deux minutes.

En utilisant un microlitre de cellules lysées comme matrice d’ADN, effectuez une PCR selon les conditions indiquées ici. Après avoir vérifié la séquence guide correcte, inoculez une culture de cinq millilitres avec le bon clone d’ARNs et cultivez les cellules pendant la nuit. Le lendemain, préparez un stock de glycérol en combinant 750 microlitres de la culture de nuit avec 250 microlitres de glycérol à 60 % dans un cryotube à bouchon à vis.

Pour préparer des stocks de phagémides emballés dans du M13, préparez une culture nocturne de cinq millilitres d’E. coli, portant le phagemide d’expression de l’ARNs. Préparez également une culture de cinq millilitres d’E. coli pendant la nuit, en portant le plasmide auxiliaire M13KO7. Le lendemain, après avoir purifié l’ADN, co-transformer E. coli chimiquement compétent avec un microlitre chacun du phagemide d’expression de l’ARNs et du plasmide auxiliaire.

Appliquer une plaque sur une gélose LB avec des antibiotiques pour sélectionner les deux constructions. L’expression des phagémides est un lourd fardeau pour la valeur adaptative des cellules et peut entraîner une diminution de l’efficacité de la transformation. Il peut être nécessaire d’introduire le plasmide en deux étapes de transformation séquentielle.

Après avoir incubé les cellules transformées pendant la nuit à 37 degrés Celsius, préparez une culture de 10 millilitres à partir d’une seule colonie de la souche co-transformée. Le lendemain matin, centrifugez la culture à 3300 x g pendant 10 minutes. Prélever le surnageant et filtrer à travers un filtre de 0,2 micron.

Conservez le filtrat de phagemid emballé à quatre degrés Celsius. Après avoir préparé les cellules cibles F+, selon le protocole de texte, inoculez une seule colonie dans une culture de cinq millilitres de milieu LB avec des antibiotiques, et cultivez pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant. Le lendemain, utilisez cinq millilitres de milieu LB sélectif pour diluer les cellules cibles F+ une à cent, et poursuivez l’incubation.

Cultivez les cellules pendant environ deux heures jusqu’à ce qu’une OD600 de 0,3 soit obtenue, indiquant une croissance en phase logarithmique. Les cellules ciblées pour le silençage doivent être en phase exponentielle lors de l’expression du silence du pilus F pour une infection phagémide efficace. Ajoutez un rapport de un à cent de phagemides emballés dans du M13 aux cellules cibles pour obtenir une infection de près de 99 % de la population cible.

Laissez l’infection se poursuivre à 37 degrés Celsius en secouant pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, analysez le phénotype de silençage de l’ARNs comme vous le souhaitez. Suivant le protocole démontré dans cette vidéo, la cassette de silençage de l’ARNs du plasmide pAB.

001 a été modifié pour devenir cible en mKate2. Cette figure montre que la souche d’E. coli infectée par le phagemid anti-mKate2 n’a montré aucune fluorescence détectable de mKate2 sur le bruit de fond. Cette souche a cependant exprimé la GFP, indiquant une absorption réussie du phagemide.

Dans cette expérience, une souche d’E. coli avec une chloramphénicol acétyltransférase chromosomiquement intégrée, ou gène CAT, a été infectée par un phagéme ciblant CAT, et le silençage de la résistance au chloramphénicol par ARNs a été testé. Les cellules dans lesquelles le phagémide ciblait CAT ont montré une survie réduite à de faibles concentrations de chloramphénicol, et près de 99 % de destruction à des concentrations plus élevées. En revanche, les cellules non infectées, ou les cellules infectées par l’ARNs qui réduisait au silence mKate2, étaient résistantes au chloramphénicol à toutes les concentrations testées.

Comme le montre ici, l’ajout d’ampicilline, utilisée pour sélectionner uniquement les bactéries porteuses du phagemide, a réduit la survie du chloramphénicol à des niveaux indétectables. La modification du gène cible de l’ARNs et la production d’un phagemme infecté peuvent être effectuées en cinq jours. N’oubliez pas que travailler avec des phages peut être extrêmement dangereux pour d’autres expériences en laboratoire, et que des précautions, telles que l’utilisation de matériel de laboratoire dédié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure pour éviter une contamination indésirable.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir, de cloner et de produire des phagémides infectés, porteurs d’un ARNs pour éliminer tout gène d’intérêt dans une population d’E. coli en croissance active.