Name: Phage médiée Livraison de Targeted ARNs Construit pour faire tomber lexpression génique dans E. coli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez une méthode de knockdown génique rapide dans E. coli utilisant des ARN antisens ciblés délivrés par phagemide M13. Cette technique permet le silençage génique sans modification génétique préalable.

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Le financement de ce travail a été fourni par la Fondation Bettencourt Schueller à l&#39;appui de l&#39;équipe de Paris Bettencourt iGEM. Nous remercions l&#39;unité de recherche de U1001 INSERM et Chantal Lotton pour l&#39;assistance technique et des conseils. Phagémide Litmus28i_J23115-B0032-GFP a été fourni par Monica Ortiz et Drew Endy de Stanford.

1. Conception et construction des vecteurs phagémide Gardant ARNs Silencing Cassettes <ol><li> De Novo Conception d&#39;ARNs Désactiv Cassettes 8 <ol><li> Identifier la séquence complète de l&#39;ARNm devant être réduit au silence en utilisant une base de données de séquence d&#39;ADN. Pour générer la séquence cible, notez les 24 premières pb de la séquence codante, de la position 1-24 commençant par le codon de démarrage (par exemple, ATG). Remarque: Taire est moins efficace lorsque d&#39; autres sites ou des segments de l&#39;ARNm sont ciblés 8. </li><li> Prenez le complément inverse de la séquence cible pour produire la séquence GUIDE pour la cassette ARNs. Voir le tableau 1 pour des exemples de TARGET et GUIDE séquences pour la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). </li><li> Pour concevoir le 292 pb cassette d&#39;expression complète de ARNs, organiser le promoteur pR, séquence GUIDE, Hfq domaine de protéine de liaison et T1 / TE séquences de terminaison de transcription en série (tableau 2). </li><li> Ajouter des sites de clonage supplémentaires de choix pour faciliter le clonage de la cassette d&#39;ARNs dans le vecteur cible. </li><li> Obtenir la cassette complète ARNs par synthèse génique commerciale ou une méthode similaire et cloner dans un vecteur phagémide avec une réplication origine f1 fonctionnelle 11. Voir d&#39;accompagnement pour la séquence complète du vecteur phagemide final. </li></ol></li><li> Modification de la séquence ciblée par une cassette d&#39;expression d&#39; ARNs existant en utilisant le site basé sur la PCR mutagenèse dirigée 12 <ol><li> Identifier la séquence GUIDE 24 pb dans une cassette d&#39;expression d&#39;ARNs existante. Remarque: Le plasmide pAB.001 annotée, utilisée dans ce travail, est disponible sous forme de fichier de séquence supplémentaire. </li><li> Conception avant et arrière amorces avec de courtes régions d&#39;homologie à la cassette ARNs existante flanquant la nouvelle séquence GUIDE 24 pb. Obtenir les amorces à travers la synthèse d&#39;oligonucléotides commerciale. Remarque: la conception Primer pour la mutagenèse dirigée est depicted à la figure 2. séquences de matrice d&#39;amorces exacte sont fournies dans le tableau 3. </li><li> Préparer une culture de 5 ml de E. coli portant le phagemide modèle ARNs d&#39;expression. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans du milieu LB avec des antibiotiques appropriés. </li><li> Extraire et purifier le modèle ARNs expression phagemide du 5 ml de culture bactérienne en utilisant un kit ADN miniprep ou méthode similaire 12. </li><li> Préparer deux réactions PCR en utilisant le phagémide modèle d&#39;expression d&#39; ARNs et de haute fidélité de la polymerase, l&#39; un avec l&#39;avant et l&#39; autre avec l&#39;amorce inverse (tableau 4). Utiliser des conditions de PCR tel que recommandé par le fournisseur de la polymérase (tableau 5). Augmenter la concentration de matrice de 10-50x supérieur à une réaction classique pour tenir compte du fait que la réaction d&#39;amorce unique ne produit pas une amplification exponentielle. </li><li> Combiner les deux réactions de PCR ci-dessus dans un tube à microcentrifugation. Anneal les produits par chauffage à 98 ° C dans un bain d&#39;eau bouillante. Immédiatement après avoir placé le tube de microcentrifugation dans le bain d&#39;eau, retirer la source de chaleur et laisser le bain pour revenir lentement à la température ambiante pendant 1-2 heures. </li><li> Pour éliminer le modèle d&#39;ARNs non mutée expression phagemide, ajouter 1 pl. L&#39;enzyme de restriction Dpnl au mélange et on incube à 37 ° C pendant 1 heure, ou le temps recommandé par le fabricant pour une digestion complète. Remarque: DpnI digère les sites cibles ne méthylés, qui sont présents sur les phagemides hôte répliqué mais pas les produits de PCR. </li><li> Transform acheté ou préparé 13 E. chimiquement compétente coli avec 1 à 5 ul du produit de PCR recuit. Isoler des colonies uniques de la souche transformée par le placage sélectif sur des plaques d&#39;agar LB contenant les antibiotiques appropriés. </li><li> Pour vérifier l&#39;incorporation de la séquence GUIDE correcte, cribler les colonies résultantes par PCR sur colonie. En utilisant une pointe de pipette 200 pi, collect une petite quantité de cellules à partir d&#39;une seule colonie transformée. Mark et de préserver la colonie d&#39;origine pour une utilisation en aval après vérification. </li><li> Ajouter les cellules recueillies à 50 ul d&#39;eau sans nucléase dans un tube à centrifuger. Mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> En utilisant un thermocycleur de paillasse ou un bain d&#39;eau bouillante, lyser les cellules par chauffage à 95 ° C pendant 2 min. </li><li> PCR amplifient la région phagémide en utilisant 1 pi de cellules lysées à la chaleur en tant que matrice d&#39;ADN. Les conditions de PCR et les protocoles du thermocycleur sont fournis dans les tableaux 6 et 7. Voir le fichier supplémentaire de séquence pAB.001 pour des séquences de vérification d&#39;amorces. </li><li> Séquencer le produit de PCR afin de vérifier l&#39;incorporation de la séquence GUIDE correcte. </li><li> Inoculer une culture de 5 ml de E. clone coli portant l&#39;expression ARNs phagemide séquence vérifiée. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans un milieu LB sélectif. </li><li> Préparer un stock de glycéroldu clone de la séquence vérifiée. Ajouter 750 ul de la culture d&#39;une nuit à 250 pi de 60% de glycérol dans un tube de cryo bouchon à vis. </li><li> Stocker le stock de glycérol à -80 ° C indéfiniment. Le reste de la culture d&#39;une nuit peut être utilisée comme source pour l&#39;expression de phagémide ARNs à l&#39;étape 2. </li></ol></li></ol> 2. Production et récolte des stocks de phagemides M13-emballés <ol><li> Préparer une culture de 5 ml de E. coli portant l&#39;expression de phagémide ARNs. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans du milieu LB avec des antibiotiques appropriés. Note: L&#39;expression de phagemide ARNs peuvent être obtenus par le biais de novo clonage comme décrit à l&#39; étape 1.1.5, ou modifié à partir d&#39; un phagemide existant et récolté à l&#39; étape 1.2.16. </li><li> De la même façon de préparer une culture de 5 ml de E. coli portant le plasmide auxiliaire M13KO7. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans un milieu LB sélectif. </li><li> Extraire et purifier l&#39;expressio ARNsn phagemide et le plasmide auxiliaire en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ADN ou d&#39;une méthode similaire 12. </li><li> Co - transformer acheté ou préparé 13 E. coli chimiquement compétentes avec 1 ul de chacune des ARNs phagemide d&#39;expression et le plasmide auxiliaire. Sélectionnez pour cotransformants par étalement sur gélose LB avec des antibiotiques sélectifs pour les deux constructions. </li><li> Préparer une culture de 10 ml à partir d&#39;une seule colonie de la souche cotransformé dans LB avec des antibiotiques sélectifs. Incuber à 37 ° C sous agitation pendant 8-12 heures ou toute la nuit. </li><li> Centrifuger la culture à 3300 xg pendant 10 min. Recueillir le surnageant et le filtre à travers un filtre de 0,2 um. Attention: En cas de déversement de médias, nettoyer la zone avec l&#39;eau de Javel diluée (0,5%) pour détruire les particules de phage infectieux. </li><li> Rangez le filtrat phagemide emballé à 4 ° C. Note: Les échantillons peuvent être conservés pendant des jours ou des semaines sans perte d&#39;activité. </li></ol> 3. Préparation des cellules F + cibles pour Silencing <ol><li> Déterminer si les cellules à cibler pour faire taire expriment le pilus F 14. Si le pilus F est déjà présent, passez à l&#39;étape 4. Note: les souches de laboratoire courantes de E. coli annotés comme F ou F + &quot;pour indiquer la présence du pilus F dans leur génome ou un plasmide. </li><li> Obtenir une souche F + E. coli tel que TOP10F &#39;. Remarque: Assurez-vous que la souche cible porte un marqueur de résistance unique afin d&#39;être séparé du donneur F-plasmide après conjugaison. </li><li> Pour introduire F pili par conjugaison avec une souche F +, préparer 5 ml de cultures à la fois la souche cible et donneur F-14 plasmide. Cultiver les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec agitation, dans du milieu LB avec des antibiotiques appropriés. </li><li> Le lendemain, diluer les deux souches 1: 100 dans 5 ml de LB sélectif et continuer la culture à 37 ° C avec agitation. </li><li> Déterminer la phase de croissance des cellules en mesurant l&#39;optdensité ical de la culture à 600 nm (DO 600) à l&#39; aide d&#39; un spectrophotomètre de paillasse. Culture des cellules pendant environ 2 heures jusqu&#39;à une DO 600 de 0,3 est atteint, ce qui indique une croissance en phase logarithmique 15. </li><li> Préparer les réactions 3 de conjugaison dans des tubes à centrifuger: 0,5 ml F-plasmide souche donneur + 0,5 ml de cible, 0,5 donneur ml F-plasmidique + 0,5 ml de milieu LB (contrôle négatif) et 0,5 ml souche cible + 0,5 ml LB médias (contrôle négatif). Laisser la conjugaison se dérouler pendant 2 heures à 37 ° C avec agitation. </li><li> Plaque 100 ul de chaque réaction de conjugaison sur agar sélectif LB avec des antibiotiques spécifiques au F-plasmide (généralement à la tetracycline) et la souche cible. Plate les réactions de contrôle négatif pour confirmer que ni donneur ou souche réceptrice expriment les résistances aux antibiotiques. </li></ol> 4. L&#39;infection par phagemides packagées pour Silencing <ol><li> Inoculer une seule colonie de cellules cibles + F dans une culture de 5 ml de LB médiun avec des antibiotiques appropriés. Incuber une nuit à 37 ° C sous agitation. </li><li> Le jour suivant, on dilue les cellules cibles F + 1: 100 dans 5 ml de milieu LB sélectif et continuer à la culture à 37 ° C sous agitation. </li><li> Déterminer la phase de croissance des cellules en mesurant la densité optique de la culture à 600 nm (DO 600) à l&#39; aide d&#39; un spectrophotomètre de paillasse. Culture des cellules pendant environ 2 heures jusqu&#39;à une DO 600 de 0,3 est atteint, ce qui indique une croissance en phase logarithmique 15. Note: L&#39;expression de pili et de l&#39;infection est le plus élevé d&#39;efficacité F dans la phase logarithmique. </li><li> Ajouter les phagemides M13-emballés (étape 2.6) aux cellules cibles dans un rapport en volume de 1: 100 pour obtenir une infection près de 99% de la population cible. Permettre à l&#39;infection de se dérouler à 37 ° C avec agitation pendant 30 à 60 min. </li><li> Doser les phénotype ARNs-silencing selon la méthode de choix. Remarque: Pour une cible de protéine fluorescente, l&#39;effet de silençage peut être quantifiéedirectement par fluorométrie 10. Alternativement, les tests phénotypiques peuvent être utilisés pour observer les conséquences phénotypiques de gène knockdown 8. </li><li> Préparer un stock de glycérol pour l&#39;hôte phagemide ARNs exprimant suivant les étapes 1.2.14-1.2.16. Remarque: le phagemide va se propager dans la souche hôte indéfiniment et peut être maintenu avec un antibiotique semblable à un plasmide conventionnel. </li></ol>

<ol><li>Ohkumo, T., Masutani, C., Eki, T., Hanaoka, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22RNAi%22%5BJournal%5D)">Use of RNAi in C. elegans.</a> RNAi. , 129-137 (2008).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (50), e2477(2011).</li>
<li>Ramadan, N., Flockhart, I., Booker, M., Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+high-throughput+RNAi+screens+in+cultured+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of high-throughput RNAi screens in cultured Drosophila cells.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2245-2264 (2007).</li>
<li>Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cell membranes.</a> Biophys J. 60 (2), 297-306 (1991).</li>
<li>Kim, W. J., Chang, C. -W., Lee, M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+siRNA+delivery+using+water+soluble+lipopolymer+for+anti-angiogenic+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Efficient siRNA delivery using water soluble lipopolymer for anti-angiogenic gene therapy.</a> J Control Release. 118 (3), 357-363 (2007).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+RNAi+for+the+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mammalian RNAi for the masses.</a> Trends Genet. 19 (1), 9-12 (2003).</li>
<li>Na, D., Yoo, S. M., Chung, H., Park, H., Park, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+using+synthetic+small+regulatory+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs.</a> Nat Biotechnol. 31 (2), 170-174 (2013).</li>
<li>Ceroni, F., Algar, R., Stan, G. -B., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cellular+capacity+identifies+gene+expression+designs+with+reduced+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cellular capacity identifies gene expression designs with reduced burden.</a> Nat Methods. 12 (5), 415-418 (2015).</li>
<li>Libis, V. K., Bernheim, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Antibiotic+Resistance+in+E.+coli+with+Engineered+Phage+Bearing+Small+Regulatory+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing of Antibiotic Resistance in E. coli with Engineered Phage Bearing Small Regulatory RNAs.</a> ACS Synth Biol. 3 (12), 1003-1006 (2014).</li>
<li>Ortiz, M. E., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+cell-cell+communication+via+DNA+messaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineered cell-cell communication via DNA messaging.</a> J Biol Eng. 6 (1), 16(2012).</li>
<li>Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+site-directed+mutagenesis+using+two+single-primer+reactions+in+parallel+to+generate+mutants+for+protein+structure-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies.</a> BMC Biotechnol. 9 (1), 61(2009).</li>
<li>Chung, C. T., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+storage+of+competent+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Recombinant+DNA+Part+I%22%5BJournal%5D)">Preparation and storage of competent Escherichia coli cells.</a> Recombinant DNA Part I. , 621-627 (1993).</li>
<li>Phornphisutthimas, S., Thamchaipenet, A., Panijpan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Conjugation in Escherichia coli.</a> Biochem Mol Biol Educ. 35 (6), 440-445 (2007).</li>
<li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Physiology+in+Luria-Bertani+Broth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li>
<li>Mittal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+efficiency+of+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Improving the efficiency of RNA interference in mammals.</a> Nat Rev Genet. 5 (5), 355-365 (2004).</li>
<li>Qi, L. S., Larson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Lu, T. K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersing+biofilms+with+engineered+enzymatic+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (27), 11197-11202 (2007).</li>
<li>Yosef, I., Manor, M., Kiro, R., Qimron, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperate+and+lytic+bacteriophages+programmed+to+sensitize+and+kill+antibiotic-resistant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (23), 7267-7272 (2015).</li>
<li>Karlsson, F., Malmborg-Hager, A. -C., Albrekt, A. -S., Borrebaeck, C. A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+comparison+of+phage+M13-infected+vs.+uninfected+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide comparison of phage M13-infected vs. uninfected Escherichia coli.</a> Can J Microbiol. 51 (1), 29-35 (2005).</li>
<li>Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveat+of+RNAi+in+plants%3A+the+off-target+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Caveat of RNAi in plants: the off-target effect.</a> Methods in molecular biology. 744, Clifton, N.J. 13-25 (2011).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+and+avoiding+siRNA+off-target+effects+for+target+identification+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 57-67 (2010).</li>
<li>Cho, S. W., Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Hagens, S., Blasi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+filamentous+phage+as+bactericidal+agents%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents: a pilot study.</a> Lett Appl Microbiol. 37 (4), 318-323 (2003).</li>
<li>Kasman, L. M., Kasman, A., Westwater, C., Dolan, J., Schmidt, M. G., Norris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+phage+replication+threshold%3A+a+mathematical+model+with+implications+for+phage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Overcoming the phage replication threshold: a mathematical model with implications for phage therapy.</a> J Virol. 76 (11), 5557-5564 (2002).</li>
<li>Chasteen, L., Ayriss, J., Pavlik, P., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+helper+phage+from+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Eliminating helper phage from phage display.</a> Nucleic Acids Res. 34 (21), e145(2006).</li>
<li>Lu, T. K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophage+targeting+gene+networks+as+adjuvants+for+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophage targeting gene networks as adjuvants for antibiotic therapy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4629-4634 (2009).</li>
<li>Bikard, D., Jiang, W., Samai, P., Hochschild, A., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+repression+and+activation+of+bacterial+gene+expression+using+an+engineered+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system.</a> Nucleic Acids Res. 41 (15), 7429-7437 (2013).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le présent procédé atteint 80% de réduction des niveaux de fluorescence mKate par rapport aux témoins non ciblés. Ceci est en ligne avec d&#39; autres méthodes knockdown d&#39;ARN, où silençage complète est pas observée et 50-90% d&#39; efficacité est typique 16,17. Au niveau phénotypique, rabattues CAT ciblées ont pu atténuer de manière significative la résistance au chloramphénicol, et l&#39;éliminer sous certaines conditions. Le phénotype knockdown était détectable au niveau de la population après seulement un post-infection quelques heures (figure 3B). Ceci illustre une caractéristique importante de la livraison basée sur les phages: une fréquence knockdown élevée peut être obtenue directement en culture discontinue sans modification génétique préalable. A la différence des modifications génétiques classiques, en utilisant une transformation de plasmide ou d&#39;intégration génomique, l&#39;infection par le phage ne nécessite pas qu&#39;une population re-cultivé à partir d&#39;une seule colonie isolée. Ceci permet aux effets de l&#39;infection par des phages pour être explored dans les populations dynamiques spatiales complexes 11, avec des structures spatiales préexistantes comme biofilms 18, ou dans les populations naturelles génétiquement mixtes 19. Une étape cruciale dans cette méthode est la production de phagemide emballé à titre élevé. La charge métabolique associé à la production de particules de phage peut conduire à des taux élevés de mutation ou perte de plasmide dans la souche de production phagemide. Il est recommandé que la souche de production phagémide être cultivées directement à partir d&#39;une seule colonie cotransformé et non réfrigérée, congelée ou sous-cultivées avant la récolte de phage. Une faible efficacité de la co-transformation peut également être observé lors de l&#39; introduction du phagemide et le plasmide auxiliaire à E. coli simultanément. Dans ce cas, des rendements plus élevés peuvent être obtenus en transformant le plasmide auxiliaire d&#39;abord, puis la préparation de cellules compétentes portant le plasmide auxiliaire pour la transformation ultérieure avec le phagémide. Phainfection gemid ou l&#39;expression d&#39;ARNs impose aussi une charge métabolique détectable sur les cellules cibles, et peuvent entraîner une certaine perturbation phénotypique. Par exemple, une réduction de la fluorescence mKate2 n&#39;a été observé même lorsque les cellules ont été infectées avec un phagemide de ciblage CAT (figure 3). L&#39; infection par le M13 est pas pensé pour déclencher des réactions de stress systémiques dans E. coli 20, mais peut modifier les modèles de transcription indirectement. Alternativement, les marqueurs de la GFP ou de résistance à l&#39;ampicilline inclus sur le phagémide peuvent concourir pour les ressources cellulaires, ce qui réduit l&#39; expression mKate2 et la croissance 9. Enfin, la cassette elle-même ARNs peut modifier globalement les profils d&#39;expression génique en dosant la protéine Hfq ou par le biais hors cible de l&#39;ARNm silençage. Effets cibles Off sont fréquents dans l&#39; ARNi in vivo ciblant 21-23, mais ils doivent encore être systématiquement étudiées pour ce système. Une limitation de cette méthode est que les effi d&#39;infectioncacité est inférieure à 100%, ce qui permet certaines bactéries non infectées à persister dans la population. Les résultats de ces travaux et les travaux antérieurs 10 suggèrent que les cellules non infectées représentent 1-10% de la population finale, et sont responsables de la plupart des phénotypes nonsilenced observées. Une variété de routes à M13-résistance sont connus, avec la perte étant mutationnelle la plus courante de l&#39; expression des pili 24. À la lumière de ces limitations, les contrôles doivent être utilisés pour confirmer les taux d&#39;infection élevés et l&#39;efficacité knockdown. Une autre limite potentielle pour certaines applications est le transfert occasionnel de contamination phage auxiliaire. Bien que M13K07 contient un signal d&#39;encapsidation muté, il peut être encapsidé dans la capside du phage à basse fréquence et transféré dans les populations infectées, ce qui entraîne des cellules compétentes pour la production de phage et la propagation continue de phages au - delà de l&#39;événement d&#39;infection initiale 25. Les modifications apportées au phage auxiliaire ont prouvé leur efficacitéà la réduction des emballages non spécifiques, bien que parfois au détriment de la production de phage réduite 26. Bactériophage Engineered sont devenus un outil indispensable pour E. biologie synthétique coli, permettant une livraison rapide de nouveaux gènes à une population croissante. Des travaux récents ont produit des circuits de communication intercellulaire 11 ou exprimé des facteurs de transcription pour supprimer la résistance aux antibiotiques voies 27. Le protocole présenté ici ajoute à une collection croissante d&#39;outils qui permettent le contrôle de la physiologie bactérienne par ARNs programmées. Nucléases CRISPR-Cas, lorsqu&#39;ils sont mutés pour éliminer l&#39; activité nucléase, ont été montré pour réprimer la transcription sur des cibles de gènes ARN-guidée 17,28. En revanche, les ARNs silençage fonctionne au niveau de translation et ne nécessite pas l&#39;expression de protéines exogènes. biotechnologies de nouvelle génération peuvent unir le contrôle de la transcription et de la traduction avec la livraison de phage médiée programmer phéno complexetypes en temps réel.

rabattues de gènes ARN médiée procèdent en deux étapes. Tout d&#39;abord, une molécule d&#39;ARN est introduit dans une lignée cellulaire ou d&#39;un organisme d&#39;étude. Deuxièmement, les protéines liant l&#39;ARN endogènes, faciliter la reconnaissance de l&#39;ARN-cible et de produire l&#39;effet de silençage. Toutes les technologies d&#39;ARN knockdown bénéficient de la nature personnalisable des ARNs synthétiques, qui peut être facilement produit pour correspondre à une cible d&#39;intérêt spécifique. Cependant, les détails moléculaires de l&#39;absorption de l&#39;ARN et le silençage varient considérablement d&#39;un système modèle, contraignant où et comment passes rabattues d&#39;ARN peuvent être appliquées. Dans les nématodes, l&#39; ARN double brin (ARNdb) molécules peut être introduit directement dans les médias ou en alimentant les vers avec une population de ARNdb exprimant E. 1,2 cellules de E. coli. Chez la drosophile, l&#39; ARNi peut être obtenue par micro - injection d&#39; embryons à partir d&#39; ARNdb 3, ou mis en œuvre dans des lignées cellulaires en ajoutant simplement l&#39; ARNdb dans le milieu de culture 4. Dans les lignées cellulaires de mammifères,synthétiques petits ARN interférents (siRNA) peuvent être délivrés à des cellules vivantes par électroporation 1,2,5, emballés dans des liposomes 3,6, ou exprimés à partir de vecteurs d&#39; ADN plasmidique 4,7. Une fois que les espèces d&#39;ARN atteint le cytosol, la voie de l&#39;ARNi repose sur le complexe RISC pour traiter ARNdb, faciliter la reconnaissance antisens de la cible, et de catalyser la répression traductionnelle, la dégradation de l&#39;ARNm, ou de la formation hétérochromatine, en fonction de l&#39;hôte. En raison de ces exigences, l&#39;ARNi classique peut être effectuée que dans les organismes qui prennent l&#39;ARN exogène efficace et expriment RISC ou une activité RISC-like. Notamment, cela exclut le modèle bactérie E. coli, qui n&#39;a pas la voie ARNi. Cependant, les progrès récents en biologie synthétique fournissent les outils nécessaires pour résoudre à la fois le problème de livraison et le problème de silence. Dans ce protocole, les constructions ARNs sont exprimés en E. coli à partir d&#39; un vecteur d&#39;ADN délivré à liVing cellules en utilisant le système phagémide / helper M13. Un phagemide est tout plasmide ayant une origine f1 phage dérivé de replication. Un plasmide auxiliaire, dans ce cas M13KO, porte toute la machinerie nécessaire pour produire des particules virales, mais pas assez compétent pour la réplication et l&#39;emballage. Quand un phagémide et plasmide auxiliaire sont co-transformées, le phagemide seul est répliqué à l&#39;origine f1, emballé et sécrétée. Le phagemide vectorisé est alors capable d&#39;infecter en direct E. coli via le pilus F. Dans ce système, l&#39;effet de silençage est produite par des cassettes d&#39;ARNs personnalisées combinant une séquence d&#39;échafaudage avec une séquence de liaison à la cible. La séquence de liaison à la cible est de 24 paires de bases antisens à un ARNm cible, typiquement au niveau du site de liaison au ribosome (RBS). La séquence d&#39;échafaudage, développé par Na et ses collègues 8, contient un motif Hfq contraignant extrait de MICC, un petit ARN régulateur endogène E. coli. La protéine Hfq stimule l&#39;ARN-ARN binding et la dégradation de l&#39; ARNm, servant un rôle dans ce système similaire à RISC dans l&#39; ARNi. La figure 1 illustre un schéma complet pour rabattues de ARNs phages à médiation, y compris la structure ARNs de cassette, vectorisation phagemide, et le mécanisme taire. En tant que méthode pour moduler l&#39; expression génique dans E. coli, ARNs silencing est simple, rapide et polyvalent. E. ciblée coli est pas surchargé au - delà de la propagation du phagemide et exprimant le ARNs. Cela peut être pertinent dans le contexte de la biologie synthétique ou la recherche fondamentale où l&#39;expression des plus grandes constructions hétérologues peut grever les ressources cellulaires 9. Phagemides avec de nouvelles cibles peuvent être produites par une seule PCR et a récolté un jour après la transformation phagémide. Enfin, presque tous les ARNm peut être ciblé. La cassette de régulation ARNs (sur un plasmide standard) a été montré pour travailler sur une variété de cibles dans le métabolisme avec des niveaux de répression typiques&gt; 90% 8. 10. Tout d&#39; abord, un phagemide emballé est introduit dans une culture de E. batch coli et les cellules utilisées pour réduire au silence l&#39; expression de la protéine fluorescente mKate2. changements de fluorescence suivants sont surveillés en temps réel. Deuxièmement, abattre le gène CAT est indiqué pour réduire la résistance au chloramphénicol phénotypique sur des plaques d&#39;agar-agar. Dans les deux cas, le phagémide lui-même porte un marqueur GFP, permettant ainsi le taux d&#39;infection à mesurer indépendamment l&#39;un de l&#39;efficacité knock-down.

<table><tbody><tr><td>Plasmide Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzyme</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Haute Fidélité Polymérase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0270L</td><td></td></tr><tr><td>M13KO7 Helper Phage</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha ; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>TOP10F' Cells</td><td>Life Technologies</td><td>C3030-03</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Sigma</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Sigma</td><td>60615-5G</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>87128-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

phage médiée livraison de targeted arns construit pour faire tomber l&#39;expression génique dans<em&gt; e. coli</em

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

rabattues de l&#39;ARN à médiation sont largement utilisés pour contrôler l&#39;expression des gènes. Cette famille de techniques polyvalent utilise de l&#39;ARN court (ARNs) qui peut être synthétisée avec une séquence quelconque, et destiné à compléter n&#39;importe quel gène ciblé pour le silençage. Étant donné que ARNs constructions peuvent être introduites à de nombreux types de cellules, directement ou en utilisant une variété de vecteurs, l&#39;expression génique peut être réprimée dans les cellules vivantes sans modification génétique laborieuse. L&#39;ARN le plus commun de la technologie knockdown, l&#39;interférence ARN (ARNi), fait usage de la reconnaissance de la séquence endogène ARN-induite silençage complexe (RISC) de médiation et de clivage de l&#39;ARNm cible. Les applications de cette technique sont donc limités à des organismes de type RISC, principalement exprimant eucaryotes. Récemment, une nouvelle génération de biotechnologistes d&#39;ARN ont développé des mécanismes alternatifs pour contrôler l&#39;expression des gènes par ARN, et ainsi rendu possible rabattues de gènes ARN médiée par des bactéries. Nous décrivons ici une méthode pour faire taire expres de gènession dans E. coli qui ressemble fonctionnellement ARNi. Dans ce système, un phagemide synthétique a été conçu pour exprimer des ARNs, qui peut conçu pour cibler une séquence quelconque. La construction d&#39;expression est délivrée à une population de E. coli avec des cellules non lytique du phage M13, après quoi il est capable de se répliquer de manière stable comme un plasmide. La reconnaissance antisens et le silençage de l&#39;ARNm cible est médié par la protéine Hfq endogènes à E. coli. Ce protocole comprend des procédés pour la conception de l&#39;ARNs antisens, la construction du vecteur phagémide, le conditionnement du phagemide dans bactériophage M13, la préparation d&#39;une population de cellules vivantes pour l&#39;infection, et en effectuant l&#39;infection elle-même. La protéine fluorescente mKate2 et chloramphénicol acétyltransférase du gène de résistance aux antibiotiques (CAT) sont ciblés pour générer des données représentatives et de quantifier l&#39;efficacité knockdown.

Silencing de mKate2 Fluorescence dans les milieux liquides La figure 1 illustre le schéma de passes rabattues ARNs médiation décrites dans ce travail, y compris la conception ARNs de cassette, vectorisation phagemide, et le mécanisme de silence. Suivant le protocole 1.2, la cassette ARNs taire du plasmide pAB.001 a été modifié pour cibler mKate. La cassette ARNs a été synthétisé et cloné dans phagemide Litmus28i_J23115-B0032-GFP, un don de Monica Ortiz et Drew Endy 11. Ce phagemide porte des marqueurs pour l&#39;expression de GFP et la résistance à la kanamycine, ce qui permet d&#39;infections réussies à suivre. stocks de phagemides emballés ont été préparés en suivant le protocole 2. Un dérivé de E. coli K12 MG1655 portant, un marqueur mKate2 chromosomique intégré exprimé constitutivement a été préparé pour l&#39; infection par le phage par conjugaison<html> avec une souche plasmide donneur F suivant le protocole 3. Les cellules ont été cultivées jusqu&#39;à la phase logarithmique moyen et le phagemide introduit suivant le protocole 4. Après l&#39;infection phagemide, 200 cultures ul ont été transférés à un lecteur de plaque de fluorescence et la fluorescence a été contrôlée en continu pendant 24 heures. La figure 3 montre l&#39;effet de silençage ARNs à médiation par l&#39;expression mKate2. La souche infectée par un phagemide anti-mKate2 montré aucune fluorescence mKate2 détectable sur fond. En revanche, cette souche a fait exprimer le marqueur GFP, indiquant l&#39;absorption réussie du phagemide. des cellules témoins non infectées ont produit une fluorescence mKate2 mais pas GFP. Un contrôle supplémentaire, dans lequel le domaine de ciblage anti mKate2 a été remplacée par une séquence de ciblage CAT n&#39;a eu aucun effet sur mKate2 fluorescence. Silencing de la Résistance chloramphénicol sur des plaques d&#39;agar contenu &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Après le protocole 1.1, une cassette ARNs taire a été produit pour cibler CAT Un dérivé de E. coli K12 MG1655 portant un constitutivement exprimé, le chromosome marqueur CAT intégré a été préparé. l&#39;infection par des phages par conjugaison avec une souche donneuse F-plasmide suivant le protocole 3. les cellules ont été cultivées jusqu&#39;à la phase logarithmique moyenne et le phagémide introduit suivant le protocole 4. Après 1 h d&#39;incubation à 37 ° C, les cellules infectées ont été dilués en série et étalés à une gamme de concentrations de chloramphenicol. les plaques ont été incubées pendant une nuit, et la proportion de cellules résistantes à chaque concentration chloramphenicol a été déterminée en comptant les unités formant colonie (CFU) le jour suivant. La figure 4 montre l&#39;effet de silençage ARNs à médiation par le phénotype de résistance au chloramphénicol. Les cellules non infectées ou des cellules infectées par le phagemide ciblant mKate2, étaient résistants àchloramphénicol à toutes les concentrations testées. En revanche, les cellules infectées par le phagemide ciblant CAT ont montré une diminution de la survie à de faibles concentrations de chloramphénicol, et près de 99% tuant à des concentrations supérieures. L&#39;ajout d&#39;ampicilline, pour sélectionner uniquement les bactéries portant le phagemide, réduit la survie de chloramphénicol à des niveaux indétectables. Ceci est cohérent avec les travaux antérieurs montrant que la fuite de l&#39; infection de phage est une voie commune pour échapper au silence 10. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> Figure 1: Gene Silencing dans E. coli avec ARNs Expression Cassettes prononcé par M13 Phage La cassette ARNs se compose de 4 modules:. le promoteur pR (un promoteur constitutif dérivé du bactériophage lambda), un domaine de ciblage 24 pb, un domaine de liaison Hfq extrait de MICC et un terminateur transcriptionnel 8 </sup&gt;. La cassette est incorporé dans un phagemide portant l&#39;origine de réplication f1 et M13 encapsidé dans la capside de M13 en utilisant l&#39;M13KO7 aide de phage. Phagemides packagées sont capables d&#39;infecter E. coli exprimant le pilus F, où commence l&#39; expression d&#39; ARNs. Le ARNs recrute alors la protéine Hfq (représenté en rouge) et se lie à une cible d&#39;ARNm antisens à proximité du site de liaison de ribosome, ce qui entraîne la répression traductionnelle et la dégradation de l&#39; ARNm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> Figure 2:. Conception d&#39; amorces et de mutagénèse dirigée du site cible ARNs Deux amorces sont conçues avec une homologie partielle avec une cassette d&#39;ARNs existante. L&#39;amorce sens contient 20 pb homologue au promoteur pR à l&#39;extrémité 5 &#39;, suivi par24 pb représentant la nouvelle séquence GUIDE, puis 18 pb homologue au domaine Hfq liaison à l&#39;extrémité 3 &#39;. L&#39;amorce inverse est le complément inverse exacte de l&#39;amorce vers l&#39;avant, avec des régions d&#39;homologie avec la cassette d&#39;ARNs existant flanquant le complément inverse de la nouvelle séquence guide. Séquences d&#39;amorces exactes sont indiquées dans le tableau 3. Les réactions de PCR unique amorces distinctes avec l&#39;avant et les amorces inverses produisent linéaire, l&#39; ADN simple brin avec la séquence modifiée souhaitée. Recuire la marche avant et arrière des produits de réaction, après nettoyage tel que décrit dans le protocole, les résultats de l&#39;ADN double brin plasmide portant la cassette ARNs modifiée souhaitée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> Figure 3: Knockdown d&#39;un journaliste mKate2 Fluorescent intégré dans le chromosome. E. coli MG1655 K12 exprimant mKate2 étaient soit non traitées (lignes rouges et barres) gauche, infecté par un phagemide anti-mKate2 (lignes vertes et bars), ou infecté par un contrôle phagemide ciblant CAT (lignes bleues et bars). (A) non traitée E. coli a atteint des densités plus élevées de saturation, ce qui indique un coût métabolique à l&#39; infection par des phages. Les lignes pointillées indiquent les écarts-types de 3 répétitions. (B) Le signal mKate2 a été réduite à des niveaux de fond près de l&#39;anti-mKate2 traités souche, mais pas dans les souches de contrôle. (C) la fluorescence de GFP, également porté par le phagemide est détectable uniquement dans les contrôles traités par phagémide. (D, E) lectures de fluorescence finales après 24 h de la croissance ont été normalisées à OD. signal de GFP, indiquant une infection de phagemide, était absent dans les contrôles non traités, mais également sensiblement réduite à la suite anti-CAT ptraitement hagemid. Cela peut indiquer des effets hors-cible du phagemide. Le signal mKate2 a été réduite par un traitement anti phagémide mKate2 par rapport aux témoins non traités. Le contrôle phagemide CAT ciblée n&#39;a montré aucun effet sur la mKate2 fluorescence. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39; écart type de 3 répétitions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> Figure 4: Knockdown de CAT Restaure chloramphénicol Sensibilité à une population génétiquement résistant E.. coli MG1655 K12 exprimant un gène CAT chromosomique intégré ont été laissés non traités (barres rouges), traité avec un phagemide de contrôle ciblant mKate2 (barres vertes), ou traité avec un phagémide exprimant un anti-CAT ARNs (barres bleues). Après 1 heure de l&#39;infection, la viabilité sur la fourmi indiquéeibiotics a été évaluée par des dilutions en série et le placage. Les souches traitées avec un anticorps anti-CAT phagémide ont été tuées de manière significative (&gt; 90%) par du chloramphénicol à des concentrations plus élevées, alors que les traitements témoins sont pas affectés. L&#39;addition d&#39;ampicilline aux plaques de culture sélectionne positivement l&#39;infection par le phagemide et élimine les cellules non infectées. Dans ces conditions, aucune des colonies résistantes au chloramphenicol ont été observés après le traitement anti-CAT. Ceci indique que la plupart des survivants représentent un échec de l&#39;infection, plutôt qu&#39;une défaillance de silençage. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart type de 3 répétitions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> séquence TARGET CAT </td><td> 5 &#39;- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3&#39; </td></tr><tr><td> séquence GUIDE DE CAT </td><td> 5 &#39;- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tableau 1:. Une séquence exemple TARGET et GUIDE pour la CAT Gene Notez la relation de complément inverse. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> promoteur pR </td><td colspan="5"> TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC </td></tr><tr><td> séquence GUIDE </td><td colspan="5"> ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT </td></tr><tr><td> domaine de liaison Hfq </td><td colspan="5"> TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG </td></tr><tr><td> T1 / TE terminateur </td><td colspan="5"> CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA </td></tr></tbody></table>Tableau 2:. Composants de séquence de la cassette ARNs Chaque séquence est écrit 5&#39;-3 &#39;. La cassette complète est la concaténation de ces 4 éléments dans l&#39;ordre et comprend 292 pb. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Forward Primer </td><td> 5 &#39;- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDE] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3&#39; </td></tr><tr><td> amorce antisens </td><td> 5 &#39;- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tableau 3: Primer Conception à Alter éléments de guidage existants L&#39;amorce sens comprend les derniers 20 pb du promoteur pR, la nouvelle séquence de GUIDE, et les 18 premières pb du domaine Hfq contraignant.. La séquence cible est le complément inverse exact de la séquence GUIDE. L&#39;amorce inverse est le complément inverse exact de l&#39;amorce sens. </p&gt; <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Le volume </td></tr><tr><td> plasmide Template </td><td> 500 ng </td></tr><tr><td> 10 Primer uM </td><td> 2,5 ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTPs </td><td> 0,4 pi </td></tr><tr><td> Haute fidélité Polymerase (2 U / pl) </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> Tampon PCR 5x </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 4: Suggestions Conditions pour le Single-Primer Mutagène PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Temp </td><td> Temps </td></tr><tr><td> dénaturation initiale </td><td> 98 ° C, </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 cycles </td><td> 98 ° C, </td><td> 10 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C, </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 72 ° C, </td><td> 120 s </td></tr><tr><td> Extension finale </td><td> 72 ° C, </td><td> 300 s </td></tr><tr><td> Stockage </td><td> 10 ° C, </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 5: Protocole suggéré Thermocycleur pour le Single-Primer Mutagène PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Le volume </td></tr><tr><td> Patron de l&#39;ADN </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 10 Forward Primer uM </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 amorce inverse iM </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> Taq 2X Master Mix </td><td> 25 ul </td></tr><tr><td> wate sans nucléaser </td><td> 23 pi </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tableau 6: Suggestions Conditions de la PCR de vérification de séquence. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Temp </td><td> Temps </td></tr><tr><td> dénaturation initiale </td><td> 95 ° C, </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 cycles </td><td> 95 ° C, </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C, </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C, </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> Extension finale </td><td> 68 ° C, </td><td> 300 s </td></tr><tr><td> Stockage </td><td> 10 ° C, </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 7: Suggestion Thermocycleur ProProtocole pour la PCR de vérification de séquence.

Nous décrivons une méthode pour inhiber l’expression génique dans une population croissante de cellules E. coli à l’aide de cassettes d’expression d’ARNs ciblées par séquence délivrées par un vecteur phagémide M13.

Phage médiée Livraison de Targeted ARNs Construit pour faire tomber l&#39;expression génique dans<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

L’objectif global de cette procédure est d’éliminer les gènes d’intérêt dans une population croissante d’E. coli. Les knockdowns de gènes sont souvent utilisés pour explorer des questions de base sur la fonction des gènes. Ces méthodes peuvent également avoir des applications en biologie synthétique.Par exemple, pour réduire au silence les gènes indésirables comme les facteurs de virulence. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée en cultures discontinues d’E.coli sans modification génétique préalable, avec des résultats observables juste après quelques heures. Pour commencer, à l’aide d’un plasmide contenant une cassette d’expression d’ARNs conçue selon le protocole texte, effectuez une mutagenèse dirigée sur la séquence en identifiant d’abord la séquence guide à 24 paires de bases dans la cassette d’expression.Concevez et synthétisez des amorces avant et arrière avec de courtes régions d’homologie avec la cassette d’ARNs existante, flanquant la nouvelle séquence guide de 24 paires de bases. Préparez une culture de cinq millilitres d’E. coli dans LB et d’antibiotiques portant le phagemide d’expression de l’ARNs modèle. Faites pousser les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant.Après avoir extrait et purifié le phagemme d’ARNs matrice de la culture, préparez deux réactions PCR, en utilisant 10 à 50 fois la quantité recommandée de matrice d’ADN pour le phagemme d’ARNs et la polymérase haute fidélité. Préparez une réaction avec l’amorce avant et une autre avec l’amorce inverse. Après avoir utilisé des conditions de PCR standard pour exécuter les réactions, combinez les deux réactions dans un tube de microcentrifugation.Ensuite, recuire les produits en les chauffant à 98 degrés Celsius dans un bain d’eau bouillante. Éteignez immédiatement la source de chaleur et laissez le bain revenir lentement à température ambiante au cours des deux prochaines heures. Pour éliminer l’ARNs matrice non muté, ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction DpnI au mélange et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure, ou pendant le temps recommandé par le fabricant pour une digestion complète.Ensuite, transformez des cellules E. coli chimiquement compétentes avec un à cinq microlitres de produit PCR recuit. Ensuite, isolez les colonies individuelles par placage sélectif sur des plaques LB avec des antibiotiques. Vérifier l’incorporation de la séquence guide correcte avec la PCR de la colonie.Utilisez une pointe de pipette de 200 microlitres pour prélever une petite quantité de cellules d’une seule colonie transformée. Ajoutez les cellules collectées à 50 microlitres d’eau sans nucléases dans un tube de microcentrifugation et mélangez par pipetage. Ensuite, à l’aide d’un thermocycleur de paillasse ou d’un bain-marie bouillant, lysez les cellules en les chauffant à 95 degrés Celsius pendant deux minutes.En utilisant un microlitre de cellules lysées comme matrice d’ADN, effectuez une PCR selon les conditions indiquées ici. Après avoir vérifié la séquence guide correcte, inoculez une culture de cinq millilitres avec le bon clone d’ARNs et cultivez les cellules pendant la nuit. Le lendemain, préparez un stock de glycérol en combinant 750 microlitres de la culture de nuit avec 250 microlitres de glycérol à 60 % dans un cryotube à bouchon à vis.Pour préparer des stocks de phagémides emballés dans du M13, préparez une culture nocturne de cinq millilitres d’E. coli, portant le phagemide d’expression de l’ARNs. Préparez également une culture de cinq millilitres d’E. coli pendant la nuit, en portant le plasmide auxiliaire M13KO7. Le lendemain, après avoir purifié l’ADN, co-transformer E. coli chimiquement compétent avec un microlitre chacun du phagemide d’expression de l’ARNs et du plasmide auxiliaire.Appliquer une plaque sur une gélose LB avec des antibiotiques pour sélectionner les deux constructions. L’expression des phagémides est un lourd fardeau pour la valeur adaptative des cellules et peut entraîner une diminution de l’efficacité de la transformation. Il peut être nécessaire d’introduire le plasmide en deux étapes de transformation séquentielle.Après avoir incubé les cellules transformées pendant la nuit à 37 degrés Celsius, préparez une culture de 10 millilitres à partir d’une seule colonie de la souche co-transformée. Le lendemain matin, centrifugez la culture à 3300 x g pendant 10 minutes. Prélever le surnageant et filtrer à travers un filtre de 0,2 micron.Conservez le filtrat de phagemid emballé à quatre degrés Celsius. Après avoir préparé les cellules cibles F+, selon le protocole de texte, inoculez une seule colonie dans une culture de cinq millilitres de milieu LB avec des antibiotiques, et cultivez pendant la nuit à 37 degrés Celsius en secouant. Le lendemain, utilisez cinq millilitres de milieu LB sélectif pour diluer les cellules cibles F+ une à cent, et poursuivez l’incubation.Cultivez les cellules pendant environ deux heures jusqu’à ce qu’une OD600 de 0,3 soit obtenue, indiquant une croissance en phase logarithmique. Les cellules ciblées pour le silençage doivent être en phase exponentielle lors de l’expression du silence du pilus F pour une infection phagémide efficace. Ajoutez un rapport de un à cent de phagemides emballés dans du M13 aux cellules cibles pour obtenir une infection de près de 99 % de la population cible.Laissez l’infection se poursuivre à 37 degrés Celsius en secouant pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, analysez le phénotype de silençage de l’ARNs comme vous le souhaitez. Suivant le protocole démontré dans cette vidéo, la cassette de silençage de l’ARNs du plasmide pAB.001 a été modifié pour devenir cible en mKate2. Cette figure montre que la souche d’E. coli infectée par le phagemid anti-mKate2 n’a montré aucune fluorescence détectable de mKate2 sur le bruit de fond. Cette souche a cependant exprimé la GFP, indiquant une absorption réussie du phagemide.Dans cette expérience, une souche d’E. coli avec une chloramphénicol acétyltransférase chromosomiquement intégrée, ou gène CAT, a été infectée par un phagéme ciblant CAT, et le silençage de la résistance au chloramphénicol par ARNs a été testé. Les cellules dans lesquelles le phagémide ciblait CAT ont montré une survie réduite à de faibles concentrations de chloramphénicol, et près de 99 % de destruction à des concentrations plus élevées. En revanche, les cellules non infectées, ou les cellules infectées par l’ARNs qui réduisait au silence mKate2, étaient résistantes au chloramphénicol à toutes les concentrations testées.Comme le montre ici, l’ajout d’ampicilline, utilisée pour sélectionner uniquement les bactéries porteuses du phagemide, a réduit la survie du chloramphénicol à des niveaux indétectables. La modification du gène cible de l’ARNs et la production d’un phagemme infecté peuvent être effectuées en cinq jours. N’oubliez pas que travailler avec des phages peut être extrêmement dangereux pour d’autres expériences en laboratoire, et que des précautions, telles que l’utilisation de matériel de laboratoire dédié, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure pour éviter une contamination indésirable.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir, de cloner et de produire des phagémides infectés, porteurs d’un ARNs pour éliminer tout gène d’intérêt dans une population d’E. coli en croissance active.

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Pour le développement de l'interférence ARN (ARNi) thérapies basées sur une nouvelle stratégie a été développée, transkingdom ARNi (tkRNAi). Cette technologie utilise des bactéries non pathogènes pour produire et livrer en épingle à cheveux courts ARN thérapeutiques (shRNA) dans les cellules cibles. Ici, tkRNAi a été appliquée avec succès pour le renversement de la multirésistance classique ABCB1 médiation (MDR) des cellules cancéreuses.

Livraison bactérienne de l&#39;ARNi Effectors: Transkingdom ARNi

Les détails article pour le protocole spécifique de site de transfection de siRNA séquence brouillée dans une culture de cellules de mammifères adhérentes à l'aide d'une matrice de micro-électrodes (MEA).

Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l&#39;aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

Cette vidéo décrit les principes du traitement par ARNi chez C. elegans et démontre un protocole pour neutraliser lin-35 dans une souche de ver transgénique.

Placage d’ARNi pour l’alimentation de C. elegans : une technique pour induire l’expression de l’ARNdb cible chez E. coli

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Cette vidéo démontre un silençage génique basé sur l’interférence CRISPR chez Leptospira pathogène. La répression ciblée de l’expression génique à l’aide d’un système CRISPR/Cas qui bloque la formation d’ARNm permet d’identifier des gènes candidats pour des études pathologiques et pharmacologiques.

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Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation des préexistants de résistance aux antibiotiques-cassette suppression des constructions comme base pour l’établissement des mutants de délétion dans autres souches d’e. coli . Ces mutations de délétion peuvent être mobilisées et insérées dans le locus correspondant d’une souche à l’aide de transduction bactériophage P1.

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Décrite ici est une méthode permettant d’analyser l’expression des gènes bactériens dans les tissus animaux au niveau cellulaire. Cette méthode fournit une ressource pour étudier la diversité phénotypique survenant dans une population bactérienne en réponse à l’environnement tissulaire lors d’une infection.

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L’administration orale d’ARNd produit par des bactéries, une méthode d’administration de l’interférence ARN (ARNi) couramment utilisée chez Caenorhabditis elegans, a été appliquée avec succès ici aux moustiques adultes. Notre méthode permet des études robustes de génétique inverse et des études de vecteurs bloquant la transmission sans l’utilisation de l’injection.

Administration efficace d’interférence ARN orale (ARNi) aux moustiques anophèles gambiens adultes

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In vitro Sélection de répresseurs transcriptionnels modifiés pour le silençage épigénétique ciblé

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Phage médiée Livraison de Targeted ARNs Construit pour faire tomber l'expression génique dans

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