Name: Synthèse de lor nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Découvrez la synthèse de liposomes photosensibles intégrés avec des nanoparticules d'or pour la libération contrôlée de médicaments. Cette méthode révèle le mécanisme de cavitation par microbulles sous excitation laser pulsé.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été partiellement financé par les fonds de recherche universitaire Tier-1 de Singapour Ministère de l&#39;Education (RG 64/12 à CX) et NTU-Nord-Ouest de l&#39;Institut de la nanomédecine.

1. Préparation <ol><li> Nettoyer rond de 100 ml des flacons de fond à l&#39;aide de l&#39;eau régale (1 partie d&#39;acide nitrique concentré (HNO 3) et 3 parties d&#39;acide chlorhydrique concentré (HCl)) et laver les flacons avec de l&#39;eau DI. Autoclave les flacons et les sécher dans un four à air chaud à 100 ° C pendant 15 min. Envelopper et stocker les flacons stériles jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Stériliser l&#39;ensemble mini-extrudeuse à main en utilisant 70% d&#39;éthanol. </li><li> Tourner à l&#39;évaporateur rotatif et régler la température du bain d&#39;eau chaude et de la tour de refroidissement à 37 ° C et 4 ° C, respectivement. </li><li> Préparer 60 mM calcéine solution mère en dissolvant 374 mg de calcéine dans 10 ml de 0,1 mM tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4). Ajuster le pH à 7,4 en utilisant M d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH) une solution. </li></ol> 2. Synthèse des liposomes <ol><li> Éliminer les lipides (1,2-sn-glycéro Dipalmitoyl--3-phosphocholine (DPPC), 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphocholigne (MPPC) et 1, 2-distéaroyl sn-glycéro-3-phosphoethanol-amine N - [carboxy (polyéthylèneglycol) -2000] (sel d&#39;ammonium) (DSPE-PEG2000)) du congélateur (-20 ° C) et les dégeler à la température ambiante. </li><li> Peser 15,9 mg de DPPC, 1,3 mg MPPC, et 2,8 mg DSPE-PEG2000. Dissoudre ensemble dans 2 ml de chloroforme. </li><li> Transférer la solution de chloroforme dans le ballon à fond rond stérile et on évapore le solvant en utilisant un évaporateur rotatif sous pression réduite, pour former une couche mince et sec de lipides. </li><li> Hydrater la couche lipidique à 45 ° C avec 2 ml d&#39;une solution aqueuse contenant de 30 min 1,95 ml 60 mM calcéine préparé à l&#39;étape 1.4 et 50 ul Au IP (3,36 × 10 16 particules / ml). </li><li> Préchauffer le bloc chauffant à 45 ° C. Placez un filtre à membrane de polycarbonate de 200 nm entre les supports de filtres et d&#39;assembler l&#39;ensemble mini-extrudeuse. Vérifiez la fuite potentielle avec de l&#39;eau DI. </li><li> Remplir une des seringues de 1 ml d&#39;une solution de liposomes de l&#39;étape 2.4 et EXTRUde l&#39;échantillon en faisant passer la solution à la seringue à l&#39;autre extrémité de l&#39;assemblage de mini-extrudeuse. Répétez 11 fois. </li><li> Exécuter les liposomes de synthèse à travers une colonne de dessalage PD-10 pour retirer les libres Au IP, des lipides et la calcéine en utilisant comme éluant du PBS selon le protocole du fabricant. </li><li> Stocker les échantillons dans des tubes stériles à 4 ° C et utiliser dans les 2 jours. </li></ol> 3. calcéine sortie de liposomes avec chauffage <ol><li> Calculer la molarité lipidique de la solution mère en additionnant les molarités de DPPC, MPPC et DSPE-PEG2000 dans l&#39;étape 2.2. Diluer la solution liposome boursier pour mM concentration 5 des lipides en utilisant un tampon mM PBS 0,1 (pH 7,4). Transférer les échantillons dans un tube de centrifugeuse (2 ml). </li><li> Placer le tube dans un bain d&#39;eau chaude, et d&#39;élever la température progressivement de 25 à 70 ° C. Augmenter la température à une vitesse de 1 ° C / min ici. </li><li> Collecter des aliquotes (10 ul) à différents points de température (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 et 70 ° C). </li><li> Ajouter 10 ul de 2% de Triton X-100 à 2 ml d&#39;une solution aliquote liposomale pour digérer les liposomes pendant 10 min à température ambiante et à obtenir une libération complète de calcéine. </li><li> Transférer 200 pl de la solution liposomale à chaque puits de la microplaque à 96 puits et on mesure l&#39;intensité de fluorescence des échantillons prélevés à l&#39;aide d&#39;un lecteur de microplaques à fluorescence. Les longueurs d&#39;ondes d&#39;excitation et d&#39;émission de calcéine sont 480 et 515 nm, respectivement. </li><li> Prenant l&#39;intensité de fluorescence des Triton X-100 échantillons traités comme libération de 100%, calculer le pourcentage de la calcéine libérée à chaque point de temps, en utilisant la formule: <img alt="Formule 1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> Pi est l&#39;intensité de fluorescence de la solution à un instant donné. F i et F x sont les intensités de fluorescence normalisée initiale et finale de la solution, respectivement. </li></ol> 4. calcéine Relocation de liposomes avec laser pulsé <ol><li> Transférer la solution de liposome 100 ul dans une cuvette en quartz et le placer dans un support de cuvette. Utilisez un Nd pulsé: YAG avec une durée d&#39;impulsion de 6 ns à 532 nm de longueur d&#39;onde que la source de lumière. Utilisez le suivant Paramètres Laser - Taux de répétition: 1 Hz; La densité d&#39;énergie du laser: 1 mJ / cm 2; Diamètre du faisceau: 0,5 mm. </li><li> Guider le faisceau laser collimaté à travers la cuvette de telle sorte que la lumière traverse la solution de liposomes et de recueillir des aliquotes après diverses impulsions. </li><li> Ajouter 10 ul de 2% de Triton X-100 à 2 ml d&#39;une solution aliquote liposomale pour digérer les liposomes pendant 10 min à température ambiante et à obtenir une libération complète de calcéine. </li><li> Considérant calcéine est sensible à la lumière et peut être blanchi pendant l&#39;expérience laser, pré-mesurer l&#39;effet de blanchiment de laser pulsé sur la solution de calcéine pour normaliser les données de liposome de presse. <ol><li> Plus précisément, exposer solution de calcéine (60 mM) à impulsions wi lasere fréquence de 1 Hz pour faire varier le nombre d&#39;impulsions (0, 25, 50 et 100). Mesurer l&#39;intensité de la fluorescence de calcéine avec excitation et d&#39;émission des longueurs d&#39;onde de 480 et 515 nm, respectivement, avant et après l&#39;exposition au laser. </li><li> Calculer la quantité de blanchiment (intensité de fluorescence de la calcéine avant intensité laser exposition / de fluorescence de la calcéine après le nombre d&#39;impulsions spécifique). Utiliser ce facteur pour normaliser les valeurs obtenues à partir d&#39;échantillons de liposomes en multipliant l&#39;intensité de fluorescence des liposomes avec le facteur. </li></ol></li><li> Mesurer l&#39;intensité de la fluorescence de l&#39;échantillon prélevé à l&#39;aide d&#39;un lecteur de microplaques à fluorescence à des longueurs d&#39;ondes d&#39;excitation et d&#39;émission à 480 et 515 nm, respectivement. </li><li> Prenant l&#39;intensité de fluorescence des Triton X-100 échantillons traités comme libération de 100%, calculer le pourcentage de la calcéine libérée à chaque nombre d&#39;impulsions, en utilisant la formule: <img alt="Formule 1" src="/files/ftp_upload/53619/53619formula1.jpg" /> i et F x sont les intensités de fluorescence normalisée initiale et finale de la solution, respectivement. </li></ol> 5. Mesure des impulsions de pression <ol><li> Placer 100 ml de l&#39;échantillon sur une lame de microscope et définir le focus du laser sur l&#39;échantillon. </li><li> Plongez un hydrophone d&#39;aiguille (1 mm de diamètre et 450 nV / Pa sensibilité) dans la solution. Attention: L&#39;hydrophone ne doit pas être éclairée par la lumière laser pour éviter le dommage. </li><li> Irradier l&#39;échantillon avec le laser à impulsions avec un nombre variable d&#39;impulsions (0-100) et l&#39;énergie d&#39;impulsion (20 à 160 pJ / impulsion). </li><li> Enregistrer les signaux de pression à l&#39;aide d&#39;un oscilloscope numérique. </li></ol>

<ol><li>McCoy, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+drug+delivery+from+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Triggered drug delivery from biomaterials.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).</li>
<li>Yavuz, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanocages+covered+by+smart+polymers+for+controlled+release+with+near-infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light.</a> Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).</li>
<li>Gohy, J. F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-responsive+block+copolymer+micelles%3A+design+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior.</a> Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).</li>
<li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).</li>
<li>Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+testing+of+a+new+temperature-sensitive+drug+delivery+system+for+the+treatment+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).</li>
<li>Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+drug+delivery+and+hyperthermia%3A+the+materials+design+and+preclinical+and+clinical+testing+of+low+temperature-sensitive+liposomes+used+in+combination+with+mild+hyperthermia+in+the+treatment+of+local+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Nanomed.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer.</a> Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).</li>
<li>Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+exposure+in+animals+can+be+visualized+in+the+skin+and+analysed+via+skin+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy.</a> Nat. Commun. 5, 3796(2014).</li>
<li>Paasonen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticles+enable+selective+light-induced+contents+release+from+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes.</a> J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remotely+Triggered+Liposome+Release+by+Near-Infrared+Light+Absorption+via+Hollow+Gold+Nanoshells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).</li>
<li>Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+Light-Induced+Release+from+Plasmon+Resonant+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes.</a> Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).</li>
<li>Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-IR+Remote+Release+from+Assemblies+of+Liposomes+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).</li>
<li>Mills, J. K., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolipid+incorporation+in+dipalmitoylphosphatidylcholine+bilayer+membranes+enhances+the+ion+permeability+and+drug+release+rates+at+the+membrane+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).</li>
<li>Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+Photothermal+Conversion+Efficiencies+of+Plasmonically+Heated+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles.</a> J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).</li>
<li>Chongsiriwatana, N., Barron, A. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChongsiriwatana%2C+N+%22Antimicrobial+Peptides%22">Antimicrobial Peptides</a>. Giuliani, A., Rinaldi, A. C. 618, Humana Press. 171-182 (2010).</li>
<li>Egerev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+signals+generated+by+laser-irradiated+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles.</a> Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).</li>
<li>González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+size-dependent+photoacoustic+effect+on+gold+nanoparticles+by+laser-induced+nanobubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles.</a> Appl. Phys. Lett. 96, 174104(2010).</li>
</ol>

Pas de conflit d&#39;intérêts sont déclarés.

hydratation de la couche mince est la méthode classique de préparation des liposomes. solvants organiques (chloroforme dans ce cas) ont été utilisés d&#39;abord pour dissoudre les lipides et ensuite éliminés dans un évaporateur rotatif à 37 ° C pour produire un film mince de lipides sur le flacon. Ce film lipidique a été hydraté avec la solution aqueuse contenant 60 mM calcéine et 5 nm Au IP. Au cours du processus d&#39;hydratation, la température a été maintenue à environ 50 ° C et le ballon a été agité continuellement...

La possibilité de déclencher la libération du médicament en utilisant des stimuli externes est un moyen attrayant de livrer les médicaments dans la mode spatio, temporalité et de dosage contrôlé avec une spécificité maximale et peu d&#39;effets indésirables. Parmi un large éventail de systèmes exogènes de stimuli-sensibles (lumière, champ magnétique, les ultrasons, rayonnement micro-ondes), les plates-formes légères déclenché sont attrayants, en raison de leur non-invasif, la simplicité et l&#39;adaptabilité dans les cliniques. 1 recherches approfondies dans la dernière décennie a fourni une variété de technologies de plate-forme, tels que l&#39;or responsable proche infrarouge-lumière (UA) nanocages revêtus de polymères intelligents, 2, des nanoparticules polymériques photo-labile (IP) conjugués à des médicaments, 3 et nanovésicules de porphysome auto-assemblées. 4 Cependant , ces technologies sont encore au stade de développement préclinique, et nécessitent une bonne compréhension et l&#39;optimisation des paramètres intervenant dans le processus de lancement et de suitelaminage de la libération du médicament. L&#39;un des plus simples et facilement accessibles des méthodes pour la préparation d&#39;un tel système est d&#39;intégrer Au IP avec des liposomes thermosensibles 5,6, les deux qui sont largement disponibles sur le marché et ont été largement étudiés dans les essais précliniques et cliniques, même. Malgré la limitation de l&#39;activation des tissus profonds de Au IP à leur longueur d&#39;onde plasmonique, par rapport à l&#39;UA nanostructures proche infrarouge activé (par exemple, nanocages), ce système tient toujours très prometteur lorsqu&#39;il est utilisé dans de petits animaux ou pour l&#39;administration topique chez l&#39;homme. 7 Il y a des premiers efforts en combinant au IP avec des liposomes pour la libération lumière déclenché. 8-11 Alors que la plupart d&#39;entre eux se concentrent sur ​​la nouveauté des matériaux, les problèmes d&#39;accessibilité et d&#39;évolutivité doivent être abordées. En outre, des rapports sur les mécanismes de libération à l&#39;aide de ces nanocarriers sont encore limitées. Ici, la fabrication de photo-sensibleliposomes, simultanément chargés de médicaments et hydrophiles Au NPS a été décrit. Calcéine est utilisé comme composé modèle pour évaluer l&#39;efficacité d&#39;encapsulation et le profil de libération du système. En outre, dans ce système, la lumière absorbée par les IP Au dissipe au microenvironnement entourant sous forme de chaleur, ce qui entraîne une augmentation de la température locale. Microbulles d&#39;air sont générées au cours du chauffage au laser et provoquer la rupture mécanique des liposomes (figure 1). Le mécanisme de la cavitation des microbulles est confirmée par des mesures d&#39;hydrophones.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, États-Unis)</td><td>850355P</td><td>en poudre, à conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphocholine (MPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, US)</td><td>855675P</td><td>poudre, conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanol-amine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d’ammonium) (DSPE-PEG2000)</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, États-Unis)</td><td>880120P</td><td>poudre, à conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Nanoparticules</td><td>d’or Sigma Aldrich</td><td>752568-100mL</td><td>5&nbsp ; nm, stabilisées à 0,1&nbsp ; mM PBS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875-10g</td><td>60&nbsp ; mM, pH 7,4 (ajusté à l’aide de NaOH)</td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>0,1 mM, pH 7,4</td></tr><tr><td>Eau double distillée</td><td>Millipore Milli-DI système</td><td></td><td></td>de purification d’eau</tr><tr><td>Triton X100&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma, Life Sciences</td><td>X-100</td><td>Pour perturber les liposomes afin de calculer l’encapsulation totale</td></tr><tr><td>Rotavapor&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Buchi (Suisse)</td><td>R 210</td><td>Utilisé pour la préparation du lipososme</td></tr><tr><td>Bain chauffant</td><td>Buchi (Suisse)</td><td>B 491</td><td>Utilisé pour la préparation du lipososme</td></tr><tr><td>Régulateur de vide&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Buchi (Suisse)</td><td>V-850</td><td>Utilisé pour la préparation du lipososme</td></tr><tr><td>Pompe à vide</td><td>Buchi (Suisse)</td><td>V-700</td><td>Utilisé pour la préparation du lipososme</td></tr><tr><td>Bain de recirculation avec régulateur de température</td><td>Polyscience</td><td></td><td>Utilisé pour la préparation du lipososme</td></tr><tr><td>Ensemble mini-extrudeuse avec bloc chauffant&nbsp ;</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, États-Unis)</td><td>610000</td><td>Utilisé pour l’extrusion de seringues de liposomes</td></tr><tr><td>, 1 000 &#956 ; l</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, États-Unis)</td><td>610017</td><td>Utilisé pour l’extrusion de liposomes</td></tr><tr><td>Membrane filtrante en polycarbonate, 200&nbsp ; nm</td><td>Whatmann</td><td>800281</td><td>Utilisé pour l’extrusion de liposomes</td></tr><tr><td>Support de filtre</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabama, États-Unis)</td><td>610014</td><td>Utilisé pour l’extrusion de liposomes</td></tr><tr><td>10 Coulumns de dessalage, Sephadex G-25 medium</td><td>GE Healthcare, Sciences de la vie</td><td>17-0851-01</td><td>Utilisé pour purifier les liposomes</td></tr><tr><td>Centrifugeuse&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Centrifugeuses de laboratoire Sigma</td><td>3K30</td><td>Utilisées pour concentrer la solution liposomale&nbsp ;</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Sigma</td><td>19777-H</td><td>Utilisé pour concentrer la solution liposomale&nbsp ;</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Nano ZS Malvern</td><td></td><td>Utilisé pour la détermination de la taille des liposomes et du zêtapotentiel</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Visible</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2450</td><td>Utilisé pour mesurer l’absorbance des échantillons</td></tr><tr><td>Spectrofluorimètre fluorescent. &nbsp ;</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>SpectraMax M5</td><td>Utilisé pour mesurer l’émission de fluorescence des échantillons</td></tr><tr><td>Nd :YAG Laser</td><td>NewWave Research</td><td></td><td>532 nm ; Puissance maximale : 17&nbsp ; Mj; Largeur : 406&nbsp ; NSEC ; Utilisé pour l’irradiation d’échantillons</td></tr><tr><td>HNR Hydrophone</td><td>ONDA</td><td>HNR-1000</td> 1 <td>mm de diamètre et sensibilité 450 nV/Pa, Plage de fréquence de fonctionnement appropriée : 0,25-10&nbsp ; Mhz; Étalonnage : 50 mV/Bar ; Utilisé pour mesurer les signaux acoustiques</td></tr><tr><td>Osciloscope numérique</td><td>LECORY - Wave Runner 64Xi-A</td><td></td><td>Fréquence : 600 MHz ; Fréquence d’échantillonnage maximale : 10 Gs/s (à deux canaux) ; Utilisé pour enregistrer les signaux acoustiques mesurés</td></tr></tbody></table>

synthèse de l&#39;or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur pulse laser excitation

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Les nanoparticules photosensibles (NP) ont fait l’objet d’une attention considérable en raison de leur potentiel à fournir un contrôle spatial, temporel et posologique sur la libération du médicament. Cependant, la plupart des technologies pertinentes sont encore en cours de développement et ne peuvent pas être achetées par les cliniques. Ici, nous décrivons une fabrication facile de ces NP photo-sensibles avec des NP d’or et des liposomes thermo-sensibles disponibles dans le commerce. La calcéine est utilisée comme médicament modèle pour évaluer l’efficacité de l’encapsulation et le profil cinétique de libération lors de la stimulation thermique/lumineuse. Enfin, nous montrons que cette libération photo-déclenchée est due à la rupture membranaire causée par la cavitation des microbulles, qui peut être mesurée à l’hydrophone.

Les liposomes ont été préparés en utilisant une technique mince d&#39;hydratation de film conventionnelle avec DPPC, MPPC et DSPE-PEG2000 selon un rapport molaire de 86: 10: 4 ou 7,95: 0,65. 1,39 mg / ml 12 La taille de Au IP est essentiel de déterminer la lumière pour chauffer l&#39;efficacité de conversion lors de l&#39;expérience de l&#39;excitation laser suivant. Plus la taille de Au IP, plus élevé est l&#39;efficacité de transduction. 13 Ainsi 5 nm Au IP, les p...

Ce protocole décrit un procédé de préparation simple pour nanoparticules d&#39;or intégré liposomes photosensibles avec les matériaux disponibles dans le commerce. Il montre également comment évaluer le processus de cavitation de microbulles des liposomes de synthèse sur le traitement de laser pulsé.

Synthèse de l&#39;or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

L'objectif général de ce protocole est de démontrer la synthèse de liposomes sensibles à la lumière et de révéler le mécanisme de libération contrôlée du médicament par ces liposomes sous irradiation lumineuse. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles concernant la réponse figurative des liposomes à la lumière dans le cadre de la délivrance de médicaments, où les principaux défis consistent à synthétiser les liposomes et à améliorer l'ampleur du relâchement contrôlé. Le principal avantage de cette technique réside dans la synthèse cellulaire de liposomes sensibles à la lumière à l’aide de matériaux disponibles commercialement.Les implications de cette technologie s'étendent à la thérapie des tissus superficiels. L'utilisation de procédures minimales peu invasives ainsi que d'une partie du dispositif laser rendra la plateforme technologique plus accessible aux patients. En plus d'offrir des informations sur les meilleurs soins et une administration précise des médicaments, notre système peut également être appliqué à d'autres systèmes, tels que les systèmes ani-ma-mo-rose et muqueux, grâce à des lasers guidés.Nettoyez d'abord un ballon à fond rond de 100 millilitres à l'aide d'aqua regia. Après lavage à l'eau déionisée et stérilisation en autoclave, séchez le ballon dans une étuve à air chaud à 100 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, emballez-le et conservez-le à l'abri jusqu'à utilisation.Stérilisez un ensemble d'extrudeuse manuelle à l'aide d'éthanol à 70 %. Ensuite, allumez l'évaporateur rotatif et réglez la température du bain d'eau chaude et celle de la tour de refroidissement à 37 et 4 degrés Celsius, respectivement. Préparez une solution mère de calcium à 60 millimolaire en dissolvant 374 milligrammes de calcein et 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS à 0,1 millimolaire.Régler le pH à 7,4 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium à 1 molaire. Retirer les lipides du congélateur et les décongeler à température ambiante. Une fois les lipides décongelés, dissoudre 15,9 milligrammes de DPPC, 1,3 milligramme de MPPC et 2,8 milligrammes de DSPE-PEG2000 dans deux millilitres de chloroforme.Après avoir transféré la solution de chloroforme dans un ballon rond stérile, évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif sous pression réduite afin d’obtenir un film mince et sec de lipides. Ensuite, hydrater la couche lipidique à 45 degrés Celsius avec deux millilitres de solution aqueuse contenant 1,95 millilitre de la solution de calcium préparée précédemment à 60 millimolaire et 50 microlitres de nanoparticules d’or, pendant 30 minutes. Préchauffer un bloc chauffant à 45 degrés Celsius.Placer un filtre en membrane de polycarbonate de 200 nanomètres entre les supports de filtre et assembler le kit d'extrusion miniature. Vérifier ensuite la présence éventuelle de fuites à l'aide d'eau déionisée. Remplir une des seringues avec un millilitre de la solution de liposomes préparée précédemment et extruder l'échantillon en faisant passer la solution à travers la seringue située à l'autre extrémité du mini-extrudeur assemblé.Après avoir répété la étape précédente 11 fois, faire passer les liposomes synthétisés à travers une colonne de désalinisation PD-10 pour éliminer les nanoparticules d'or libres, les lipides et la calceine, en utilisant le PBS comme éluant selon le protocole du fabricant. À la fin, conserver les échantillons dans des tubes stériles à quatre degrés Celsius. À ce stade, calculer la molarité lipidique de la solution mère en additionnant les molarités du DPPC, du MPPC et du DSPE-PEG2000.Étendre la solution mère de liposomes à une concentration lipidique de 5 millimolaire à l'aide de PBS 0,1 millimolaire, puis transférer les échantillons dans des tubes de centrifugeuse de 2 millilitres. Ensuite, placer les tubes dans un bain-marie chaud et augmenter progressivement la température de 25 à 70 degrés Celsius. Prélever des aliquotes de 10 microlitres à différents points de température.Ajouter 10 microlitres de Triton X-100 à deux pour cent à un aliquot de deux millilitres de solution liposomale afin de digérer les liposomes pendant 10 minutes à température ambiante et d'obtenir une libération complète de la calceine. Ensuite, transférer 200 microlitres de la solution liposomale dans chaque puits d'une microplaque de 96 puits. Mesurer l'intensité de fluorescence des échantillons recueillis à l'aide d'un lecteur de microplaque à fluorescence.En prenant l'intensité de fluorescence des échantillons traités au Triton X-100 comme libération à 100 pour cent, calculez le pourcentage de calceine libérée à chaque point temporel à l'aide de la formule suivante : transférez 100 microlitres de la solution de liposomes dans une cuvette en quartz et placez la cuvette dans un support de cuvette. Dirigez le faisceau laser collimaté à travers la cuvette de manière à ce que la lumière traverse la solution de liposomes. Ensuite, prélèvez des aliquotes après diverses impulsions.Après cela, ajouter 10 microlitres de Triton X-100 à 2 % à un aliquot de 2 millilitres de solution liposomale afin de digérer les liposomes pendant 10 minutes à température ambiante et d'assurer la libération complète de la calceine. Pour mesurer préalablement l'effet de photodégradation du laser sur la solution de calceine, exposer la solution à un laser pulsé à une fréquence de 1 hertz pendant un nombre de pulsations variable. Mesurer l'intensité de fluorescence de la calceine avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission respectivement de 480 et 515 nanomètres, avant et après l'exposition au laser.Après avoir calculé les quantités de blanchiment, utilisez ce facteur pour normaliser les valeurs obtenues à partir des échantillons de liposomes en multipliant l'intensité de fluorescence des liposomes par ce facteur. Ensuite, mesurez l'intensité de fluorescence de l'échantillon recueilli à l'aide d'un lecteur de microplaque à fluorescence, avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission respectivement de 480 et 515 nanomètres. En prenant l'intensité de fluorescence des échantillons traités au Triton X-100 comme libération à 100 pour cent, calculez le pourcentage de calcein libérée à chaque impulsion.Placer 100 microlitres de l'échantillon sur une lame de microscope, puis régler le foyer du laser sur l'échantillon. Le laser est guidé manuellement à travers l'échantillon ; il est donc important de s'assurer que le point focal du faisceau se situe bien à l'intérieur de l'échantillon et non sur la lame de microscope, afin d'éviter des expériences ultérieures. Ensuite, immerger une hydrophone à aiguille dans la solution.L'extrémité du hydrophone est immergée dans l'échantillon à une distance suffisante du point focal du laser. Ceci est fait afin de prévenir tout dommage induit par le laser sur l'hydrophone. Irradiez l'échantillon avec le laser à impulsions en faisant varier le nombre d'impulsions et l'énergie par impulsion.Enfin, enregistrez les signaux de pression à l'aide d'un oscilloscope numérique. Aucune différence significative du pourcentage de libération n'est observée entre les liposomes avec et sans nanoparticules d'or. Les liposomes étaient presque intacts à la température physiologique, avec un pourcentage de fuite inférieur à 10 pour cent, avec ou sans nanoparticules d'or.Lorsque la température a été augmentée à 42 degrés Celsius, de 60 à 80 pour cent du Calcein encapsulé a été libéré des Liposomes en deux minutes. Les Liposomes contenant des nano-particules d'or ont libéré le Calcein encapsulé suite à une excitation, la quantité de Calcein libérée augmentant avec le nombre d'impulsions. Les signaux acoustiques enregistrés pour les nano-particules d'or, les Liposomes avec nano-particules d'or et les Liposomes sans nano-particules d'or sont présentés ici : l'impulsion de pression, composée de phases positives et négatives, suggère la formation et la rupture de microbulles dans la solution.Comme prévu, l'amplitude du signal acoustique augmente progressivement avec l'énergie laser croissante, ce qui devrait être dû à l'intensité accrue des oscillations des particules, attribuée à la dilatation et à la contraction thermoélastiques ultérieures. Une fois maîtrisée, la fabrication des liposomes peut être réalisée en moins de 3 heures, à condition que tout le matériel en verre et les équipements soient préparés à l'avance. Lors de la tentative de libération contrôlée par laser, il est important de se rappeler que le faisceau laser doit être entièrement focalisé sur l'échantillon afin d'éviter toute perte d'énergie laser.Après cette procédure, d'autres expériences, telles que la libération commandée par laser in vitro et in vivo, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'impact des conditions physiologiques sur la libération contrôlée par laser. Après ce développement, cette technique s'avérera utile dans le domaine de la réactivité pour explorer, localiser et contrôler la libération au niveau de la peau, des yeux et des muqueuses.

synthesis-gold-nanoparticle-integrated-photo-responsive-liposomes

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous montrons la préparation et abordons la faisabilité de véhicules cellulaires contenant des nanotiges d’or pour l’imagerie photoacoustique du cancer.

Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de l&#39;or nanorods

La diffusion saturable et saturable inverse a été découverte dans des particules plasmoniques isolées et adoptée comme nouvelle méthode de contraste non blanchissant en microscopie à super-résolution. Ici, les procédures expérimentales de détection et d’extraction de la diffusion non linéaire sont expliquées en détail, ainsi que la façon d’améliorer la résolution à l’aide de la microscopie à excitation saturée.

Mesure de la diffusion non-linéarités d&#39;une nanoparticule plasmonique Simple

Nous présentons ici une méthode fiable pour surveiller l’incorporation de nanoparticules dans une matrice hôte polymère via l’encapsulation de gonflement. Nous montrons que la concentration de surface des points quantiques de séléniure de cadmium peut être visualisée avec précision grâce à l’imagerie de fluorescence en coupe transversale.

Avancée compositionnelle Analyse des Composites Nanoparticules-polymère en utilisant Direct Imaging Fluorescence

Nous décrivons une méthode de synthèse de nanoparticules or biocompatibles de 10 nm, fonctionnalisés par revêtement poly-éthylène glycol sur la surface. Ces particules peuvent être utilisés in vitro et in vivo pour livrer des produits thérapeutiques à échelle nanométrique des espaces cellulaires et extracellulaires qui sont difficiles d’accès avec des tailles de nanoparticules classiques.

Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS

Ce protocole montre la nucléation contrôlable de la cavitation dans les fantômes de gel, par le biais de l’exposition simultanée à la fois proche infrarouge lumière pulsée laser et ultrasons de haute intensité concentrée (HIFU). L’activité de la cavitation peut alors servir pour améliorer les utilisations d’imagerie et/ou thérapeutiques de HIFU.

Nucléation contrôlable de Cavitation de nanoparticules d’or plasmoniques pour renforcer la haute intensité porté Applications ultrasons

Une méthode fiable et facilement reproductible pour la préparation de neurocomanes d’or photoluminescents fonctionnables et de leur détection directe à l’intérieur des cellules HeLa par cytométrie de flux et microscopie confocale de balayage laser est décrite.

Synthèse des nanoamas d’or électroluminescents électroluminescents pour les applications biologiques

Cet article décrit les protocoles utilisés pour produire une nouvelle plate-forme de livraison de vaccins, « polybulles », pour permettre la libération retardée. Des polyesters, y compris le poly (acide lactique-co-glycolique) et la polycaprolactone, ont été utilisés pour former les polybulles et de petites molécules et antigènes ont été utilisés comme cargaison.

Production d’une plate-forme de livraison de vaccins sensibles et proches de la coquille centrale

Ce travail décrit un protocole permettant de réaliser une surveillance dynamique et non invasive du transfert de chaleur des nanoparticules d’or irradiées au laser vers les tBLM. Le système combine la spectroscopie d’impédance pour la mesure en temps réel des changements de conductance à travers les tBLM, avec un faisceau laser focalisé horizontalement qui entraîne l’éclairage des nanoparticules d’or, pour la production de chaleur.

Membranes lipidiques bicouches attachées pour surveiller le transfert de chaleur entre les nanoparticules d’or et les membranes lipidiques

Un protocole de synthèse de nanoparticules d’or d’environ 12 nm de diamètre (nanoparticules Au) dans un solvant organique est présenté. Les nanoparticules d’or sont coiffées de ligands d’oléylamine pour éviter l’agglomération. Les nanoparticules d’or sont solubles dans des solvants organiques tels que le toluène.

Synthèse des nanoparticules d’or

Les protocoles présentés peuvent être utilisés pour caractériser la réponse des microbulles marquées par fluorescence conçues pour les applications d’administration de médicaments déclenchées par ultrasons, y compris leurs mécanismes d’activation ainsi que leurs bioeffets. Cet article couvre une gamme de techniques de microscopie in vitro et in vivo réalisées pour capturer la longueur et les échelles de temps pertinentes.

Méthodes de microscopie multi-temps pour la caractérisation de microbulles marquées par fluorescence pour la libération de médicaments déclenchée par ultrasons

L’ablation laser ultrarapide dans un liquide est une technique précise et polyvalente pour synthétiser des nanomatériaux (nanoparticules [NPs] et nanostructures [NSs]) dans des environnements liquides/aériens. Les nanomatériaux ablatés par laser peuvent être fonctionnalisés avec des molécules actives Raman pour améliorer le signal Raman des analytes placés sur ou à proximité des NS/NPs.

Nanoparticules et nanostructures ultrarapides ablées par laser pour des applications de détection basées sur la diffusion Raman améliorée en surface

Découvrez la synthèse de liposomes photosensibles intégrés avec des nanoparticules d'or pour la libération contrôlée de médicaments. Cette méthode révèle le mécanisme de cavitation par microbulles sous excitation laser pulsé.

Synthèse de lor nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation (Vidéo) | JoVE Journal

Synthèse de l'or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation

Explorer plus de vidéos