DamID-seq: L'échelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments d'ADN adénine-méthylé

L’objectif global de ce protocole est de détecter des séquences d’ADN génomique associées à des protéines d’intérêt dans les cellules animales par séquençage à haut débit. Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude de l’organisation nucléaire et de la transcription ou de la régulation dans les cellules de mammifères, telles que l’identification de régions génomiques associées à l’amyloïde nucléaire ou à des facteurs de transcription spécifiques. Les principaux avantages de cette technique sont que le séquençage à haut débit offre une résolution plus élevée que l’actif DamID d’origine, en utilisant des microréseaux d’ADN, et que cette technique permet une analyse croisée avec nos données de séquençage à haut débit.

La démonstration de la procédure sera assurée par Brennan Olson, un technicien de notre laboratoire. Pour commencer, suivez le protocole textuel pour cloner le gène d’intérêt dans le vecteur DamID. Ensuite, générez des stocks lentiviraux exprimant DamV5 POY et V5-Dam à l’aide d’un système d’expression lentivirale.

Cotransfectez le vecteur DamID avec les plasmides d’emballage lentiviral en suivant la procédure de transfection directe selon le protocole du fabricant. Assurez-vous d’inclure une étape de filtration à l’aide d’un filtre PVDF à point zéro, quatre cinq microns. Maintenant, préparez-vous à infecter les cellules avec le lentivirus.

Un jour à l’avance, passez les cellules adhérentes sur des plaques à six puits. Continuez à utiliser des antibiotiques. L’objectif est d’avoir 50 % de confluence le lendemain pour l’infection.

Le lendemain, retirez les surnageants lentiviraux DamV5 POY et V5-Dam congelés du congélateur et placez-les dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pour les décongeler. Sur les plaques de culture, retirez le milieu de culture et remplacez-le par un demi-millilitre de milieu de croissance frais sans antibiotiques. Ensuite, chargez les puits d’un millilitre de lentivirus décongelé.

Chargez deux puits avec V5-Dam, deux puits avec DamV5 POY et deux puits sans lentivirus comme contrôle négatif. Faites tourner la solution sur les cellules et remettez la plaque dans l’incubateur. 24 heures plus tard, remplacez les suspensions virales sur les cellules par deux millilitres de milieu de croissance sans antibiotiques.

Ensuite, continuez l’incubation pendant 48 heures supplémentaires. Deux jours plus tard, terminez ce processus en suivant le protocole textuel pour isoler l’ADN génomique, ce qui devrait prendre environ une heure. Ensuite, amplifiez les fragments d’ADN méthylé de l’adénine méthylée à partir de l’ADN génomique.

Ce processus prend environ deux à trois jours, et les détails sont couverts dans le protocole texte. Pour cette procédure, fragmentez d’abord l’ADN méthylé de l’adénine amplifiée. Avant d’utiliser l’ADN fragmentase, il est important de mesurer d’abord sa force pour déterminer le temps de digestion approprié.

Utilisez tous les produits de méthylPCR purifiés disponibles pour ce test de diagnostic. Commencez par mettre en place un master mix composé de six microgrammes d’ADN, 12 microlitres de tampon 10X Fragmentase, et remplissez-le d’eau jusqu’à 114 microlitres. Ensuite, faites vortex le stock de Fragmentase pendant trois secondes et ajoutez six microlitres dans le mélange principal pour un total de 120 microlitres.

Ensuite, faites tourbillonner le mélange principal pendant trois secondes. Maintenant, remplissez cinq tubes de réaction avec 20 aliquotes de microlitres de mélange maître et incubez les six tubes à 37 degrés Celsius. Retirez un tube après cinq minutes et ajoutez cinq microlitres d’EDTA pour arrêter la réaction.

Faites-le toutes les 10 minutes jusqu’à ce que tous les tubes de réaction soient collectés. Maintenant, analysez 12 virgule cinq microlitres de chaque tube, ce qui correspond à environ un demi-microgramme d’ADN et à la même quantité d’ADN non digéré sur un gel d’agorose. À partir du gel, déterminez le temps minimal nécessaire pour digérer la majorité du frottis à environ zéro virgule deux kilobases.

Utilisez-le comme temps de digestion maximal. Maintenant, configurez la fragmentation réelle, comme le pré-test, et arrêtez les digestions à six points de temps régulièrement espacés, y compris cinq minutes, et calculez le temps maximum. Suite à la digestion, prélevez les six digestions et purifiez-les à l’aide d’un kit de purification PCR, ou de billes d’immobilisation réversibles en phase solide.

Diluez l’ADN purifié dans environ 15 microlitres de tampon EB. Les étapes suivantes consistent à réparer les extrémités de l’ADN fragmenté, à ajouter des surplombs d’adénine, à ligader les adaptateurs de séquençage et à convertir les adaptateurs en forme de Y en ADN double brin. Ces étapes sont toutes détaillées dans le protocole texte et ne devraient pas prendre plus de deux jours.

Après avoir ligaturé les adaptateurs de séquençage à l’ADN fragmenté et converti les adaptateurs en forme de Y en ADN double brin, sélectionnez des fragments de la taille souhaitée. Commencez par préparer un gel d’agorose à deux pour cent dans du TAE et, en prenant des précautions, ajoutez du bromure d’éthidium à une concentration finale de 500 nanogrammes par millilitre. Faites suffisamment de couloirs pour que tous les échantillons et deux échelles soient bordés de couloirs vides.

Maintenant, ajoutez huit microlitres de colorant de charge à 10 microlitres de chaque éluat d’ADN et préparez l’échelle de 1 Kb Plus avec du colorant de charge 6X et de l’eau dans un rapport de un à un à quatre. Ensuite, chargez les voies de gel dans l’ordre suivant : échelle d’ADN, éluats d’ADN et une autre échelle d’ADN. Une fois chargé, faites fonctionner le gel à 120 volts par 60 minutes.

Plus tard, mettez des lunettes de sécurité et un écran facial pour voir brièvement le gel avec une lumière UV. Vérifiez les échelles d’ADN pour voir si le gel s’est suffisamment épuisé pour que trois tranches de gel puissent être excisées entre 300 et 400 paires de bases. Ensuite, découpez les bandes entre 300 et 400 paires de bases dans chaque voie, en utilisant toujours une nouvelle lame pour chaque voie.

Retirez le moins de gel possible pour que chaque tranche de gel soit idéalement inférieure à 100 microlitres, et transférez-la dans son propre tube de microfuge. Ensuite, extrayez l’ADN des tranches de gel selon le protocole de texte. Continuez à suivre le protocole de texte sur la façon d’enrichir les fragments modifiés de l’adaptateur de séquençage à partir de l’ADN extrait.

Ensuite, obtenez une analyse de haute qualité de l’ADN purifié par un bioanalyseur, et s’il répond aux attentes, soumettez-le au séquençage. Les lentivirus ont été modifiés pour exprimer une protéine de fusion Dam-V5-lamin B1, dont il a été vérifié qu’elle était colocalisée avec la protéine endogène de la lamine B1 par coloration par inofluorescence. Ce lentivirus et un lentivirus témoin exprimant la protéine de fusion Dam-V5 ont tous deux été utilisés pour infecter les myoblastes C2C12 de souris.

L’ADN a été collecté et amplifié pour obtenir des fragments méthylés d’adénine, comme décrit, puis séquencé. Des cartes d’interaction du génome NL ont ensuite été construites pour le chromosome un. Une piste montre les rapports log2 RPKM.

L’autre piste montre les domaines associés à la lame en noir. Ce sont des zones qui sont nettement plus associées au barrage B1 qu’au barrage témoin. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux semaines, si elle est correctement exécutée.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter les séquences d’ADN associées aux protéines d’intérêt par séquençage à haut débit, couplé à DamID. N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’éthidium et des lampes UV peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que d’attendre que le gel refroidisse avant d’ajouter du bromure d’éthidium, et de porter une protection oculaire et un écran facial doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.