Name: DamID-seq: Léchelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments dADN adénine-méthylé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Découvrez la méthode DamID-seq pour cartographier les interactions protéine-ADN à l'échelle du génome dans les cellules animales. Ce protocole améliore la résolution et permet l'analyse croisée avec d'autres données de séquençage.

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Nous remercions le Dr Bas van Steensel d’avoir fourni les vecteurs d’expression des mammifères DamID. Nous remercions le Yale Center for Genome Analysis et le Genomics Core du Yale Stem Cell Center pour leurs conseils sur la préparation des banques NGS et la mise en œuvre du séquençage de l’ADN à haut débit. Ce travail a été soutenu par le financement de démarrage de la Yale School of Medicine, une subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (12SDG11630031) et une subvention de démarrage de Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).

<ol><li>van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling+using+targeted+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase.</a> Nat Genet. 27, 304-308 (2001).</li>
<li>van Steensel, B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+in+vivo+DNA+targets+of+chromatin+proteins+using+tethered+dam+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase.</a> Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).</li>
<li>Fu, A. Q., Adryan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+overlapping+and+adjacent+signals+from+genome-wide+ChIP+and+DamID+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays.</a> Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).</li>
<li>Guelen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+human+chromosomes+revealed+by+mapping+of+nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions.</a> Nature. 453, 948-951 (2008).</li>
<li>Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+directly+stimulate+expression+of+developmental+and+cell-cycle+genes+inside+the+nucleoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm.</a> Cell. 140, 360-371 (2010).</li>
<li>Kubben, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+lamin+A-+and+progerin-interacting+genome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions.</a> Chromosoma. 121, 447-464 (2012).</li>
<li>Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+nuclear+membrane+proteins+Man1+and+Ima1+link+to+two+different+types+of+chromatin+at+the+nuclear+periphery+in+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe.</a> Nucleus. 3, 77-87 (2012).</li>
<li>Harr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+targeting+of+chromatin+to+the+nuclear+lamina+is+mediated+by+chromatin+state+and+A-type+lamins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins.</a> J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Aguilera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+links+emerin+to+neuromuscular+junction+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 15, R21(2014).</li>
<li>Wu, F., Yao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+at+the+nuclear+periphery+characterized+by+genome-wide+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping.</a> BMC Genomics. 14, 591(2013).</li>
<li>Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Vogel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heterochromatin+proteins+form+large+domains+containing+KRAB-ZNF+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes.</a> Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).</li>
<li>Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+as+opposed+to+local%2C+antisilencing+is+mediated+redundantly+by+the+euchromatic+factors+Set1+and+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).</li>
<li>Shimbo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD3+localizes+at+promoters%2C+gene+bodies+and+enhancers+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes.</a> PLoS Genet. 9, e1004028(2013).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+by+the+Drosophila+Myc%2C+Max%2C+Mad%2FMnt+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network.</a> Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).</li>
<li>Artegiani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tox%3A+a+multifunctional+transcription+factor+and+novel+regulator+of+mammalian+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis.</a> EMBO J. , (2014).</li>
<li>Schuster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID+in+C.+elegans+reveals+longevity-associated+targets+of+DAF-16%2FFoxO%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO.</a> Mol Syst Biol. 6, 399(2010).</li>
<li>Bianchi-Frias, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+transcriptional+repression+targets+and+cofactor+recruitment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila.</a> PLoS Biol. 2, e178(2004).</li>
<li>Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+associates+with+chromatin+to+repress+genome+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).</li>
<li>Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+targets+of+the+D.+melanogaster+DSXF+protein+and+the+evolution+of+sexual+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development.</a> Development. 138, 2761-2771 (2011).</li>
<li>Germann, S., Gaudin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+in+vivo+protein-DNA+interactions+in+plants+by+DamID%2C+a+DNA+adenine+methylation-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method.</a> Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).</li>
<li>Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+LHP1+protein+colocalizes+with+histone+H3+Lys27+trimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling%2C+DamID+and+the+emerging+landscape+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).</li>
<li>Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID%3A+mapping+of+in+vivo+protein-genome+interactions+using+tethered+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase.</a> Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).</li>
<li>de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+HP1+binding+in+Drosophila%3A+developmental+plasticity+and+genomic+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals.</a> Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).</li>
<li>DamID mammalian vectors. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm">http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm</a> (2015).</li>
<li>Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/">https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/</a> (2015).</li>
<li>Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/">https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/</a> (2015).</li>
<li>Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).</li>
<li>Encode Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS Biol. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Asp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+remodeling+of+the+epigenetic+landscape+during+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).</li>
<li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).</li>
<li>Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+new+methods+for+in+situ+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics.</a> Genome Biol. 15, 110(2014).</li>
<li>Navin, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genomics%3A+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer genomics: one cell at a time.</a> Genome Biol. 15, 452(2014).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Kind, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dynamics+of+genome-nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions.</a> Cell. 153, 178-192 (2013).</li>
<li>Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+profiling+of+gene+expression+and+chromatin+binding+without+cell+isolation%3A+assaying+RNA+Pol+II+occupancy+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells.</a> Dev Cell. 26, 101-112 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La question de savoir si les protéines marquées par un barrage conservent les fonctions des protéines endogènes devrait être examinée avant une expérience DamID-seq. La localisation subcellulaire des protéines de l’enveloppe nucléaire marquées par Barrage doit toujours être déterminée et comparée à celle des protéines endogènes. Pour étudier les facteurs de transcription, il est suggéré d’examiner si la protéine de fusion Dam-peut sauver les fonctions de la protéine endogène dans la régulation de l’expression des gènes. ...

ADN identification adénine méthyltransférase (DamID) 1,2 est une méthode pour détecter les interactions protéine-ADN in vivo et est une approche alternative à immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) 3. Il utilise une quantité relativement faible de cellules et ne nécessite pas de reticulation chimique de l&#39;ADN ou de protéines avec un anticorps hautement spécifique. Ce dernier est particulièrement utile lorsque la protéine cible est associée de façon lâche ou indirectement avec de l&#39;ADN. DamID a été utilisé avec succès pour cartographier les sites de liaison d&#39;une variété de protéines y compris des protéines d&#39;enveloppe nucléaire 4-10, 11-13 protéines associées à la chromatine, les enzymes modifiant la chromatine, 14 facteurs de transcription et des co-facteurs d&#39;ARNi 15-18 et 19 machines. Le procédé est applicable dans de nombreux organismes, y compris S. 13 cerevisiae, S. 7 pombe, C. 9,17 elegans, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 ainsi que la souris et cellules humaines lignes 6,8,10,23,24. Le développement de l&#39;essai DamID était basée sur la détection spécifique de fragments d&#39;ADN adénine-méthylé dans des cellules eucaryotes qui ne disposent pas la méthylation 2 adénine endogène. Une protéine de fusion exprimée, consistant en la protéine de liaison à l&#39;ADN d&#39;intérêt et E. adénine méthyltransférase coli DNA (barrage), peut méthyler la base adénine dans des séquences GATC qui sont à proximité spatiale (la plus significative au sein de 1 kb et jusqu&#39;à environ 5 ko) pour les sites de liaison de la protéine dans le génome 2. Les fragments d&#39;ADN peuvent être modifiées spécifiquement amplifiés et hybrides à des puces pour détecter les sites de fixation génomiques de la protéine d&#39;intérêt 1,25,26. Cette méthode originale a été DamID limitée par la disponibilité de puces et la densité de sondes prédéterminées. Nous avons donc intégré séquençage à haut débit dansà DamID 10 et désigné la méthode que DamID-seq. Le grand nombre de courte lectures généré à partir DamID-seq permet une localisation précise des interactions protéine-ADN pangénomique. Nous avons constaté que DamID-seq fourni une résolution plus élevée et une plage dynamique plus large que DamID par microarray pour l&#39;étude du génome nucléaire lamina (NL) 10 associations. Cette méthode permet une meilleure sonder les associations NL au sein des structures de gènes 10 et facilite les comparaisons avec d&#39;autres données de séquençage à haut débit, tels que ChIP-seq et de l&#39;ARN-Seq. Le protocole DamID-seq décrit ici a été initialement développé pour la cartographie du génome NL 10 associations. Nous avons généré une protéine de fusion de souris ou attacher Lamin B1 humaine à E. coli ADN adénine méthyltransférase et testé le protocole 3T3 souris fibroblastes embryonnaires, C2C12 myoblastes de souris 10 et IRM90 fibroblastes pulmonaires de foetus humain (données non publiées). Dans ce protocole, nous commençons avec constructing vecteurs et exprimant Dam-captifs protéines de fusion par l&#39;infection lentiviral dans des cellules mammifères 24. Ensuite, nous décrivons les protocoles détaillés de l&#39;amplification de fragments d&#39;ADN adénine-méthylé et de préparer des bibliothèques de séquençage qui devraient être applicables dans d&#39;autres organismes.

<table><tbody><tr><td>ViraPower Lentiviral Expression</td><td>Systems Life Technologies</td><td>K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 et K371-20</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzyme Mix</td><td>Life Technologies</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme Mix</td><td>Life Technologies</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de mouchoirs (250)</td><td>QIAGEN</td><td>69506 ou 69504&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Gateway pDONR 201</td><td>Life Technologies</td><td>11798-014</td><td></td></tr><tr><td>293T cellules</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25300054">Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol</a></td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Marque Tris</td><td></td><td></td><td>non critique</td></tr><tr><td>Marque EDTA</td><td></td><td></td><td>non critique</td></tr><tr><td>200 Proof Marque EtOH</td><td></td><td></td><td>non critique</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td>marque non critique</td></tr><tr><td>Acétate</td><td></td><td></td> de sodium <td>marque non critique</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td>fourni avec</td></tr><tr><td>tampon adaptateurs DamID « AdRt » et « AdRb"</td><td>Séquences intégrées des technologies</td><td></td><td>d’ADN disponibles en réf. 24 ; pas de phosphorylation de l’extrémité 5' ou 3' pour éviter l’auto-ligature.</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche Life Science</td><td>10481220001</td><td>fourni avec tampon</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543</td><td>fourni avec tampon</td></tr><tr><td>DamID PCR primer « AdR_PCR"</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>séquences disponibles en réf. 24</td></tr><tr><td>Désoxynucléotide (dNTP) Solution Set</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446</td><td>100 mM chacun des dATP, dCTP, dGTP et dTTP</td></tr><tr><td>Avantage 2 Mélange de polymérase</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>fourni avec tampon</td></tr><tr><td>1Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787018</td><td>1.0 & micro ; g/&micro ; l</td></tr><tr><td>Kit de purification PCR QIAquick QIAGEN</td><td></td><td>28104 ou 28106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR MinElute</td><td>QIAGEN</td><td>28004 ou 28006</td><td>pour un volume d’élution inférieur à 30 & micro ; l</td></tr><tr><td>Les billes SPRI / Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>appliquent un mélange supplémentaire et un temps d’élution plus long si inférieur à 40 & micro ; l tampon d’élution est utilisé</td></tr><tr><td>Tampon EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348</td><td>fourni avec tampon</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase I, grand (Klenow) Fragment</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynuleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3' &#8594 ; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>fourni avec</td></tr><tr><td>adaptateurs de séquençage</td> tampon <td>Séquences intégrées de DNA Technologies</td><td></td><td>disponibles en réf. 28</td></tr><tr><td>Kit de ligature rapide</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>utilisé dans 3.4.3 ; fourni avec un tampon de réaction de ligature rapide et une amorce de séquençage rapide de l’ADN Ligase T4</td></tr> 1 <tr><td>et 2</td> séquences <td>de technologies</td><td></td><td>d’ADN intégrées disponibles en réf. 28</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2101 ou KK2102</td><td>fournies avec KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer et 10 mM dNTP mix agarose</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4679</td><td></td></tr><tr><td>bromure d’éthidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>QIAquick Kit d’extraction de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704 ou 28706</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725121 ou 1725122</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td></td><td></td><td>de marque non critique</td></tr><tr><td>0,45 &#956 ; m Filtre</td><td></td><td></td> PVDF <td>de marque non critique</td></tr><tr><td>25 ml Seringe</td><td></td><td></td><td>de marque non critique</td></tr><tr><td>10 cm Plaques</td><td></td><td></td> de culture tissulaire <td>de marque non critique</td></tr><tr><td>Plaques</td><td></td><td></td> de culture tissulaire 6 puits <td>de marque non critique</td></tr><tr><td>S1000 Thermocycleur</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermocycleur</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>pour qPCR</td></tr><tr><td>Vortex Mixeur</td><td></td><td></td><td>Marque non critique</td></tr><tr><td>Marque de Dry Block Heater ou Thermomixer</td><td></td><td></td><td>non critique</td></tr><tr>Marque de<td>microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td>non critique</td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse sur gel avec alimentation</td><td></td><td></td><td>Marque non critique</td></tr><tr><td>Support</td><td></td><td></td> <td>magnétiquepour la purification de l’ADN avec des billes SPRI ; doit contenir des tubes de 1,5 à 2 ml ; marque non critique</td></tr><tr><td>Transilluminateur</td><td></td><td></td> UV <td>marque non critique</td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse E-gel</td><td>Life Technologies</td><td>G6400, G6500, G6512ST</td><td></td></tr></tbody></table>

damid-seq: l&#39;échelle du génome cartographie des protéine-adn interactions par séquençage à haut débit de fragments d&#39;adn adénine-méthylé

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

Le test d’identification de l’ADN adénine méthyltransférase (DamID) est une méthode puissante pour détecter les interactions protéine-ADN à la fois localement et à l’échelle du génome. Il s’agit d’une approche alternative à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Une protéine de fusion exprimée composée de la protéine d’intérêt et de l’ADN adénine méthyltransférase d’E. coli peut méthyler la base adénine dans des motifs GATC près des sites d’interactions protéine-ADN. Les fragments d’ADN méthylés par l’adénine peuvent alors être amplifiés et détectés de manière spécifique. Le test original DamID détecte les emplacements génomiques des fragments d’ADN méthylé par hybridation avec des microréseaux d’ADN, ce qui est limité par la disponibilité des microréseaux et la densité des sondes prédéterminées. Dans cet article, nous rapportons le protocole détaillé d’intégration du séquençage de l’ADN à haut débit dans DamID (DamID-seq). Le grand nombre de lectures courtes générées par DamID-seq permet de détecter et de localiser les interactions protéine-ADN à l’échelle du génome avec une précision et une sensibilité élevées. Nous avons utilisé le test DamID-seq pour étudier les interactions génome-lame nucléaire (NL) dans les cellules de mammifères, et avons remarqué que DamID-seq fournit une haute résolution et une large plage dynamique dans la détection des interactions génome-NL. L’approche DamID-seq permet de sonder les associations NL au sein des structures génétiques et de comparer les cartes d’interaction génome-NL avec d’autres données génomiques fonctionnelles, telles que le ChIP-seq et le RNA-seq.

La protéine de fusion Dam-V5-LMNB1 a été vérifiée pour être co-localisé avec le protéine endogène Lamin B par immunofluorescence (Figure 1). L&#39;amplification par PCR réussie de fragments d&#39;ADN adénine-méthylé est une étape clé pour DamID-seq. Les échantillons expérimentaux devraient amplifier un frottis de 0,2 - 2 ko, tandis que les contrôles négatifs (sans Dpnl, sans ligase ou sans matrice PCR) devrait...

Nous décrivons ici un essai en couplant l&#39;identification ADN adénine méthyltransférase (DamID) pour le séquençage à haut débit (DamID-seq). Cette méthode améliorée offre une résolution plus élevée et une plage dynamique plus large, et permet l&#39;analyse des données DamID-Seq en conjonction avec d&#39;autres données de séquençage à haut débit tels que ChIP-seq, ARN-Seq, etc.

DamID-seq: L&#39;échelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments d&#39;ADN adénine-méthylé

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

L’objectif global de ce protocole est de détecter des séquences d’ADN génomique associées à des protéines d’intérêt dans les cellules animales par séquençage à haut débit. Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude de l’organisation nucléaire et de la transcription ou de la régulation dans les cellules de mammifères, telles que l’identification de régions génomiques associées à l’amyloïde nucléaire ou à des facteurs de transcription spécifiques. Les principaux avantages de cette technique sont que le séquençage à haut débit offre une résolution plus élevée que l’actif DamID d’origine, en utilisant des microréseaux d’ADN, et que cette technique permet une analyse croisée avec nos données de séquençage à haut débit.La démonstration de la procédure sera assurée par Brennan Olson, un technicien de notre laboratoire. Pour commencer, suivez le protocole textuel pour cloner le gène d’intérêt dans le vecteur DamID. Ensuite, générez des stocks lentiviraux exprimant DamV5 POY et V5-Dam à l’aide d’un système d’expression lentivirale.Cotransfectez le vecteur DamID avec les plasmides d’emballage lentiviral en suivant la procédure de transfection directe selon le pro

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Analyse de l'interaction de la chromatine par Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) est une méthode...

Analyse de l&#39;interaction avec la chromatine Tag appariés Fin de séquençage (Chia-PET) pour la cartographie des interactions Chromatine et transcription Comprendre le règlement

ADN et les protéines sont-séquence spécifiquement étiquetés avec une affinité ou groupes rapporteurs fluorescents à l'aide ADN ou de protéines méthyltransférases et analogues de cofacteur synthétiques. En fonction de la spécificité du cofacteur des enzymes, aziridine ou doubles analogues de cofacteurs activés sont utilisés pour l'étiquetage d'une ou deux étapes.

Étiquetage spécifique de la séquence des acides nucléiques et des protéines avec Methyltransferases et le cofacteur Analogues

Le séquençage d’amplicon au bisulfite (BSAS) est une méthode de quantification de la méthylation de la cytosine dans les régions génomiques ciblées d’intérêt. Cette méthode utilise la conversion au bisulfite associée à l’amplification par PCR des régions cibles avant le séquençage de nouvelle génération pour produire une quantification absolue de la méthylation de l’ADN à un niveau spécifique à la base.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

Identifier les cibles directes de molécules du génome ciblage reste un défi majeur. Pour comprendre comment les molécules de liaison à l'ADN engagent le génome, nous avons développé une méthode qui repose sur la réticulation de petites molécules à isoler la chromatine (COSMIC).

La cartographie du génome à l&#39;échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

Nous présentons ici un protocole pour enquêter sur génome large méthylation de l'ADN dans les études de patients cliniques à grande échelle de dépistage en utilisant le séquençage de l'ADN méthyl-Binding Capture (MBDCap-seq ou MBD-seq) la technologie et de la bioinformatique ultérieures analyse pipeline.

Méthyl-liaison par capture d&#39;ADN de séquençage pour les tissus du patient

Nous décrivons le clivage endogène de la chromatine couplé au séquençage à haut débit (ChEC-seq), une méthode orthogonale à l'immunoprécipitation à la chromatine (ChIP) pour cartographier les sites de liaison des protéines à l'échelle du génome avec des protéines de fusion à la nucléase micrococcie (MNase).

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Séquençage en profondeur des populations de levures sélectionnées pour les interactions 2-hybride de levure positive potentiellement donne une mine de renseignements sur les protéines qui interagissent de partenaire. Nous décrivons ici l’exploitation d’outils bioinformatiques précis et à jour de logiciels sur mesure pour analyser les données de séquençage de ces écrans.

Analyse informatique des données de séquence d’écrans de 2-hybride de levure lot

La détermination précise des emplacements liant les protéines dans l’ensemble du génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. Ici nous décrivons une méthode génomique de cartographie qui traite l’ADN chromatin-immunoprécipité avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) suivie du séquençage à haut débit. Cette méthode détecte les interactions protéine-ADN avec une résolution cartographique proche de la paire de base et un rapport signal-bruit élevé chez les neurones mammifères.

Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

L’interaction d’un remodeleur de chromatine dépendant de l’ATP avec un ligand d’ADN est décrite à l’aide de la spectroscopie CD. Les changements conformationnels induits sur un promoteur de gène analysés par les pics générés peuvent être utilisés pour comprendre le mécanisme de régulation transcriptionnelle.

Spectroscopie CD pour étudier les interactions ADN-protéine

Le protocole fournit des instructions pour modifier l’ARN avec du sulfate de diméthyle pour les expériences de profilage mutationnel. Il comprend le sondage in vitro et in vivo avec deux méthodes alternatives de préparation de bibliothèque.

Criblage de la structure de l’ARN avec le profilage mutationnel du sulfate de diméthyle avec séquençage in vitro et dans les cellules

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer semi-quantitativement les niveaux globaux de m⁶A en utilisant le blot de points. L’ARN total est extrait, dénaturé, taché sur une membrane en nylon, sondé avec un anticorps anti-m⁶A, et visualisé par chimiluminescence. L’intensité du signal, quantifiée par l’analyse en niveaux de gris ImageJ, reflète l’abondance relative de méthylation, offrant un flux de travail reproductible pour la recherche.

Essai par blot de points pour détecter les niveaux globaux de modification de l’ARNde la N 6-méthyladenosine

Découvrez la méthode DamID-seq pour cartographier les interactions protéine-ADN à l'échelle du génome dans les cellules animales. Ce protocole améliore la résolution et permet l'analyse croisée avec d'autres données de séquençage.

DamID-seq: Léchelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments dADN adénine-méthylé (Vidéo) | JoVE Journal

DamID-seq: L'échelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments d'ADN adénine-méthylé

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