Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons

L'objectif général de cette procédure d'explant ex vivo est d'améliorer la collecte et d'élargir l'application des cellules épithéliales endodermiques aviaires afin d'étudier la fonction des enzymes et des protéines dans la médiation de l'utilisation des nutriments par les embryons aviaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'utilisation des lipides durant l'embryogenèse aviaire, telles que la manière dont les lipides du jaune sont emballés et transportés du jaune à l'embryon au cours des stades avancés du développement. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir avec succès des cellules épithéliales endodermiques fonctionnelles à partir de la membrane du sac vitellin de caille japonaise, lesquelles peuvent être utilisées comme modèle pour étudier le développement embryonnaire aviaire.

Commencez par préparer une solution de PBS 10x comme décrit dans le protocole écrit. Diluez cette solution mère de un à dix pour obtenir un PBS 1x, qui sera utilisé pour laver la membrane du sac vitellin lors de la dissection de l'endoderme. Pour préparer le milieu de culture destiné aux cellules épithéliales endodermiques, ou EEC, complétez d'abord le DMEM/F-12 avec 10 % de sérum de veau nouveau-né et 1 % de solution de pénicilline-streptomycine-amphotéricine.

Ensuite, insérez la sonde d’un pH-mètre dans le DMEM préparé au préalable. Ajoutez de l’acide chlorhydrique normal goutte à goutte au milieu jusqu’à ce que le pH soit ajusté à 7,2. Après avoir collecté environ deux douzaines d’œufs de caille fécondés, placez-les verticalement dans des récipients à œufs de manière à ce que leurs extrémités larges et non effilées, où se trouvent les poches d’air, soient orientées vers le haut.

Ensuite, transférez les œufs dans un incubateur bien ventilé réglé à 37 degrés Celsius. Après cinq jours d'incubation, examinez les œufs à l’aide d’un candéloscope. Si les embryons se sont développés normalement, vous devriez observer une structure circulaire de vaisseaux capillaires sous la chambre à air.

Sélectionnez un œuf présentant un développement normal des capillaires et nettoyez la coquille avec de l'eau fraîche et de l'éthanol à 75 %. Ensuite, ouvrez la coquille de l'œuf à partir de la position de la chambre à air à l'aide de ciseaux. Utilisez une pince pour aider délicatement à verser le contenu de l'œuf dans une boîte de culture vide de 10 cm.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour détacher l'embryon, le jaune et tout albumen de la membrane du sac vitellin, abrégée en YSM. Une fois isolée, lavez la YSM trois fois dans du PBS 1x, puis transférez-la dans une nouvelle boîte de 10 cm contenant du PBS. Ensuite, placez la boîte sous un microscope stéréo.

Ensuite, procédez à l'élimination de tout résidu d'albumen, qui est adjacent à la couche externe d'ectoderme de la membrane du sac vitellin (YSM), à l'aide de ciseaux. Poursuivez en utilisant une pince pour soulever l'ectoderme translucide et le mésoderme structural des capillaires rougeâtres à partir du bord du mésoderme sur la membrane du sac vitellin. Puis, détachez délicatement l'ectoderme et le mésoderme ensemble afin d'isoler la couche cellulaire sous-jacente d'endoderme.

Ensuite, à l’aide d’une paire de forceps, maintenez fermement la couche cellulaire endodermique jaune de la membrane. Avec une autre paire, saisissez le mésoderme capillaire et commencez à tirer le mésoderme loin du bord de jonction entre le mésoderme et l’endoderme. À l’aide d’une paire de ciseaux, découpez la couche restante d’endoderme jaune et transférez-la dans la boîte de culture de six centimètres remplie de milieu de croissance.

À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer l’endoderme de couleur jaune pâle depuis la boîte de culture de six centimètres vers un tube conique de 15 mL après la collecte du YSM, puis ajouter 15 mL de milieu de croissance préparé au préalable. Placer le tube conique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que toutes les collectes de tissus soient terminées. Commencer par dissoudre 6,5 unités de collagénase de type IV dans 10 mL de DMEM.

Ensuite, centrifuger les tubes contenant l'endoderme à 130 ×g pendant trois minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirer le milieu et utiliser une pipette pour transférer tous les échantillons d'endoderme dans une boîte de culture de six centimètres de diamètre. Puis, ajouter un millilitre de solution de collagène dans la boîte.

Avec des ciseaux courbes, découper l'endoderme prélevé de quatre embryons de caille en tranches d'environ deux à trois millimètres de taille. Ensuite, rassembler les tranches dans un tube de centrifugation de 50 mL, avec neuf millilitres de solution fraîche de collagénase, déjà présente dans le tube de centrifugation de 50 mL. Pour améliorer la prolifération cellulaire pendant l'étape d'explant, placer le tube dans un bain-marie agité réglé à 37 degrés Celsius.

Ensuite, incuber le tube conique pendant 30 minutes afin de digérer partiellement le tissu avec la collagénase. La digestion protéolytique partielle est l'étape la plus importante pour améliorer la collecte des cellules du vitellus à partir de l'endoderme de la membrane du sac vitellin. Nos données montrent une amélioration significative du taux de réussite de la culture cellulaire et de la prolifération cellulaire grâce à la procédure de digestion à la collagénase.

Après la digestion par la collagénase, centrifuger le tissu à 130 fois g pendant trois minutes à température ambiante, puis éliminer la fraction surnageante à l’aide d’une pipette. Procéder au lavage du culot en le resuspendant dans 20 mL de DMEM. Centrifuger le tube comme décrit précédemment, puis, par la suite, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 12 mL de milieu de croissance.

Ensuite, ajoutez délicatement 500 microlitres de la suspension dans chaque puits d'une plaque 24 puits. Incubez ensuite les explants d'endoderme pendant deux jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de CO2. Pendant cette période, prévoyez une prolifération cellulaire à partir des tissus.

Ensuite, incuber les cellules pendant deux jours supplémentaires. Puis, soumettre les cellules à un test de viabilité cellulaire et visualiser les résultats à l’aide d’un lecteur de plaques. Par la suite, réaliser une RT-qPCR afin d’évaluer les niveaux d’expression des marqueurs d’intérêt dans les EEC et vérifier la taille du produit de la RT-qPCR par électrophorèse sur gel, comme décrit dans le protocole écrit.

Par rapport aux explants non traités, ceux ayant subi une digestion partielle par la collagénase ont montré une prolifération cellulaire significativement accrue, comme illustré par ces graphiques et déterminé par un test t apparié, démontrant ainsi la réussite du système de culture. Afin d'évaluer les effets d'autres enzymes, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés sur des tissus traités soit par la collagénase et la dispase, soit par la collagénase seule. Au cours des cinq premiers jours d'incubation, la croissance cellulaire a été similaire dans les deux conditions.

Cependant, entre les jours six et neuf, seules les EEC traitées à la collagénase ont proliféré de manière constante, suggérant qu'une digestion partielle avec cette enzyme améliore la croissance et devrait être utilisée de préférence. Lorsqu'elles ont été observées en culture, les EEC présentaient des caractéristiques semblables à celles des adipocytes, notamment de grandes gouttelettes lipidiques circulaires, comme illustré ici. Ces cellules étaient également positives au marquage par le rouge d’huile, une technique couramment utilisée pour identifier les adipocytes.

Appuyant ces données morphologiques, la PCR quantitative en temps réel a révélé que les CEE cultivées expriment des niveaux élevés de SOAT1, une protéine qui synthétise l'ester de cholestérol à partir du cholestérol. Cela suggère davantage que les CEE cultivées présentent les caractéristiques physiologiques appropriées des adipocytes. Importants, lorsque les CEE ont été exposées à l'IBMX et à la forskoline, des facteurs qui augmentent les niveaux de l'adénosine monophosphate cyclique, ou AMPc, puis cultivées pendant 24 heures, les deux traitements ont stimulé l'expression de SOAT1, suggérant ainsi des mécanismes possibles de régulation de SOAT1 et d'utilisation des lipides dans le YSM.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre heures, durant lesquelles au moins trois échantillons peuvent être prélevés. Après cette procédure, des méthodes telles que le test d'activité de la SOAT1 ou d'autres dosages d'activité enzymatique, ainsi que des confirmations visuelles similaires, peuvent être effectuées. Ce type de dosage peut aider à répondre à d'autres questions, par exemple sur le rôle de certaines protéines et macronutriments dans les stades ultérieurs du développement embryonnaire.

Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'utilisation des nutriments embryonnaires pour explorer le mécanisme par lequel les nutriments sont utilisés et transportés dans un modèle embryonnaire aviaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'apprendre à collecter des tissus endodermiques à partir d'embryons aviaires, ainsi que de savoir comment cultiver des CEE afin d'étudier le transport et l'utilisation des nutriments embryonnaires en utilisant le modèle aviaire.