Name: Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Découvrez la culture primaire de cellules épithéliales endodermiques de membrane vitelline de caille japonaise pour étudier le métabolisme lipidique et le transport des nutriments chez l'embryon aviaire.

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Le financement pour le développement du protocole actuel est particulièrement soutenue par &quot;But du Plan Université Top&quot; de l&#39;Université nationale de Taiwan, Taiwan (subvention ID-104R350144), ainsi que le Ministère de la science et de la technologie de Taiwan (subvention ID: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). Nous remercions tout particulièrement le Centre de biotechnologie de l&#39;Université nationale de Taiwan pour fournir une salle d&#39;animaux et de l&#39;espace de laboratoire pour l&#39;étude en cours.

NOTE: Cette procédure est une modification d&#39;un modèle de poulet protocole de culture développé par Bauer et al 2013 et Nakazawa et al, 2011. 2,9.. 1. Préparer sain Embryonic Jour 5 Embryons de Quail japonaise <ol><li> Placer 1 mâle et 3 femelles sexuellement matures caille japonaise ensemble dans la même cage. Aliments pour animaux d&#39;approvisionnement et de l&#39; eau ad libitum. Ajustez la lumière dans la salle des animaux à 14 h de lumière et 10 heures d&#39;obscurité. </li><li> Collecter les œufs fécondés dans des sacs en plastique chaque jour dans l&#39;après-midi et les garder dans un 16 ° C réfrigérateur pour retarder le taux d&#39;embryons de croissance. </li><li> Après avoir recueilli un nombre suffisant d&#39;oeufs dans un délai de deux semaines, incuber les oeufs fécondés dans un incubateur à 37 ° avec une bonne ventilation pendant cinq jours. </li></ol> 2. Préparer Basal Medium et Wash Solutions <ol><li> Utiliser DMEM / F-12 (ajusté à pH 7,2) comme milieu de croissance, et la compléteravec 10% de nouveau sérum de veau né (NBCS) et 1% Pen-Strep Ampho. Solution (PSA; Pénicilline, 10 5 unités / L; streptomycine, 100 mg / L; amphotéricine B, 0,25 mg / L). </li><li> Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration 10 fois pour le stockage; utiliser la solution 1x PBS (contenant du NaCl, 137,93 mM, KCl, 2,667 mM, KH 2 PO 4, 1.471 mM, Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; ajuster le pH à 7,2) pour laver et humidifier le jaune sac membrane tout séparer l&#39;endoderme du jaune d&#39;oeuf et de l&#39;albumine. </li><li> Utiliser un milieu DMEM (ajusté à pH 7,2) afin de remettre en suspension les granulés de l&#39;endoderme. </li></ol> 3. Collection de CPE primaire de YSMs Quail japonais <ol><li> Incuber les œufs récoltés pendant 5 jours (étape 1.3). Examinez les oeufs par un candler d&#39;oeuf pour confirmer le développement embryonnaire normal. NOTE: Le jour embryonnaire 5, la limite de YSM mésoderme est très clair et les couches embryonnaires 3 sont moins étroitement liés entre eux, de sorte qu&#39;il est facile d&#39;obendoderme tain. Utilisez uniquement les oeufs montrant le développement de la circulation capillaire normale pour les collections YSM. </li><li> Nettoyez la coquille soigneusement à l&#39;aide d&#39;eau douce et 75% d&#39;éthanol. Ouvrez la coquille de la position de la cellule de l&#39;air par une paire de ciseaux, retirez délicatement sur et recueillir la totalité YSM par des pinces et les placer dans une boîte de culture de 10 cm rempli de 37 ° C 1x PBS. </li><li> En utilisant une paire de ciseaux supprimer l&#39;embryon, le jaune et le blanc d&#39;oeuf, et doucement laver le YSM avec 1x PBS trois fois et placer YSM en solution PBS dans une boîte de culture de 10 cm. </li><li> Utilisez une pince et une paire de ciseaux pour enlever l&#39;ectoderme de YSM. Utiliser 2 forceps, une pour maintenir fermement la couche de cellules d&#39;origine endodermique, et l&#39;autre pour maintenir le mésoderme capillaire. </li><li> Sous un microscope à dissection, séparer et on sépare l&#39;endoderme du bord du mésoderme dans la direction vers l&#39;embryon. Collecter l&#39;endoderme jaune clair dans 50 ml tubes de centrifugation en utilisant un compte-gouttes et dans 15 ml de milieu de croissance dans un C wat 37 °bain er jusqu&#39;à ce que toutes les collections de tissus sont terminés. </li></ol> 4. Digestion de l&#39;endoderme tranches par collagénase Digestion <ol><li> Fraîchement dissoudre 6,5 unités de collagénase de type IV dans 10 ml de DMEM. </li><li> Centrifuger les tubes de 50 ml (3,4) à 130 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le milieu et placer tous les endoderme dans une boîte de culture de 6 cm à l&#39;aide d&#39;une pipette. Ajouter une solution de collagénase 1 ml à cette boîte de culture. </li><li> Trancher l&#39;endoderme recueillies à partir de 2 embryons de caille avec une paire de ciseaux courbes jusqu&#39;à ce que la taille de chaque tranche est d&#39;environ 2 à 3 mm. Utilisez un compte-gouttes, de collecter toutes les tranches dans un tube centrifuge de 50 ml le long avec 9 ml de solution de collagénase fraîche. </li><li> Digest le tissu avec de la collagénase pendant 30 min dans un bain-marie agitateur 37 ° C à 175 tours par minute. Cette digestion partielle avec de la collagénase est utilisée pour améliorer la prolifération des cellules des explants. </li><li> Centrifuger à 130 g pendant 3 min à température ambiante et retirez délicatement la fraction de surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette. Laver le culot en suspension dans 20 ml de DMEM et de retirer la fraction de surnageant après centrifugation à 130 x g pendant 3 min. </li><li> Remettre en suspension le culot avec 12 ml de milieu de croissance (DMEM / F12 avec 10% de NBCS et 1% de PSA) et des semences doucement et également dans une plaque à 24 puits (chaque solution de cellules bien avec 500 ul). </li><li> Incuber des explants de tissu à 37 ° C dans 5% de CO2 dans l&#39; air pendant 2 jours pour permettre aux cellules de proliférer sur des tissus. </li><li> Laisser incuber les cellules pendant 2 jours et caractériser la viabilité des cellules par un protocole de dosage de la viabilité cellulaire. 15 NOTE: les cellules vivantes maintiennent un environnement réducteur dans le cytosol. Résazurine, l&#39;ingrédient actif, est un composé perméable aux cellules non-toxique qui est de couleur bleue et pratiquement non-fluorescent. Lorsqu&#39;ils sont ajoutés à des cultures de cellules, la résazurine est réduite à la résorufine dans le cytosol par les enzymes mitochondriales. Résorufine est de couleur rouge et très fluorescent. Les cellules viables convertissent de façon continue à la résazurine résorufine, increAsing la fluorescence globale et la couleur du milieu de culture des cellules environnantes. </li><li> Effectuer endoderme cellules épithéliales isolement de l&#39; ARN total, la transcription inverse et quantitative PCR en temps réel du gène marqueur expression de l&#39; ARNm comme décrit. 16,17 <ol><li> Utiliser la PCR transcriptase inverse pour détecter SOAT1 ARNm (sens: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; anti-sens: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; produit PCR = 168 pb) comme marqueur spécifique des cellules CEE. Utilisez β-actine ARNm (sens: 5&#39;TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;; antisens: 5&#39;GTGATGGACTCTGGTGATGG-3&#39;; produit PCR = 151 pb) comme un gène de ménage et de contrôle interne. </li><li> Utiliser une électrophorèse sur gel pour détecter la taille du produit de la RT-PCR quantitative. Préparer 1% de gel d&#39;agarose, et mélanger 10 ul produit qPCR avec 2 ul colorant de chargement. Charge 10 mélange ul dans chaque puits dans le gel d&#39;agarose à 1%, et exécuter le gel par 100V pendant 30 min. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
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<li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li>
<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
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<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3%CE%B2%2F%CE%B2-Catenin+signaling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li>
</ol>

Il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts. Nous n’avons reçu aucun financement d’une entreprise privée.

Parce que le système de culture précédente a qu&#39;un succès limité, un meilleur système de culture est nécessaire. La caille YSM endoderme japonaise nécessite un traitement avec des enzymes protéolytiques telles que la collagénase pour desserrer les jonctions cellule-cellule pour obtenir une meilleure performance de la croissance dans les explants ex-vivo. Nos données montrent que le nombre de cellules provenant du traitement de digestion partielle ont été supérieures à partir de la culture de tissu non digéré après l...

La ressource nutritive majeure de l&#39;embryon aviaire est le jaune, composé de 33% de lipides, 17% de protéines et 1% de cendres. 1 Au cours du développement embryonnaire, la membrane de la vésicule ombilicale (YSM) croît de l&#39; intérieur de la cavité abdominale de l&#39; embryon et recouvre progressivement le jaune d&#39; oeuf surface. Commençant à jour embryonnaire 2, l&#39; expression des gènes associés au métabolisme des lipides et de l&#39; angiogenèse est progressivement augmentée en YSM et le YSM développe lentement projections villosités-like. 8,9 Ces projections augmentent l&#39; absorption des nutriments de jaune pour soutenir le développement embryonnaire. Le YSM est un tissu extra - embryonnaire qui contient trois couches germinales, endoderme, mésoderme et ectoderme. 14 L&#39;ectoderme jaune sac fait face à l&#39;albumen et des liens avec la membrane vitelline pour couvrir délicatement le sac jaune. Les cellules épithéliales endodermiques sont confrontés directement vers le jaune d&#39;œuf et servent de portails d&#39;utilisation des éléments nutritifs. 6 Comme étend la YSM, endodermique cellules épithéliales (CPE) peut être divisé par shape et la fonctionnalité en deux groupes, zone vitellines et la zone vasculosa. 7 Zone vitelline est composé de cellules endodermiques et est éloigné de l&#39;embryon; zone vasculosa est composé de cellules mésodermiques et couvre les CPE différenciées avec les vaisseaux sanguins et les tissus conjonctifs. Par jour embryonnaire 5, le jaune est totalement couvert par l&#39;ectoderme et l&#39;endoderme de YSM et la région vasculaire a connu une croissance rapide. La YSM absorbe, recompose et libère les lipides (comme le jaune dérivé très lipoprotéines de basse densité) et des protéines dans le système circulatoire embryonnaire. 9, 2 Par conséquent, nous avons mis en place un système primaire japonais de caille embryonnaire endodermique épithéliales de culture cellulaire, pour étudier les mécanismes de lipides l&#39;utilisation en YSM pendant le développement embryonnaire aviaire. Lipides tels que les triacylglycérols, de la lécithine, un phospholipide et un ester de cholestérol (EC) sont les principales sources d&#39;énergie pour les embryons aviaires. Aux premiers stades de leur développement, les lipides du jaune sont composed de seulement 1,3% CE et il monte à 10-15% à mi-parcours du développement embryonnaire aviaire 3, 11 ester de cholestérol. est synthétisée à partir du cholestérol par stérol O-acyltransférase 1 (SOAT1) dans aviaire embryon YSM. 4 La forme de stockage du cholestérol est CE, C&#39;est effectuée dans les lipoprotéines, et les lipoprotéines sont transportées par la circulation vers les tissus. 13 Une semaine avant l&#39; éclosion il y a une croissance rapide des embryons d&#39; oiseaux. Environ 68% du contenu en lipides restant dans le jaune sont absorbés au cours de cette étape. 10 Le mécanisme par lequel les lipides sont utilisés jaune d&#39; oeuf peut être clarifiée par un modèle de recherche CEE. Un protocole de culture CEE du poulet a été mis en place pour atteindre cet objectif de recherche. 2, 9 Toutefois, en raison du faible taux de réussite des explants de tissus, une procédure de culture cellulaire CEE améliorée est nécessaire pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l&#39; utilisation des nutriments par embryons d&#39;oiseaux au cours du développement.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco de Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>Pour laver les granulés EECs</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco de Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>Comme milieu de base dans la culture des EECs</td></tr><tr><td>NBCS</td><td>Gibco de Life technologies</td><td>16010-159</td><td>Comme sérum d’approvisionnement dans la culture des EECs</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. Solution</td><td>BI (Biological Industries)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>Pour atténuer l’infection possible&nbsp ;</td></tr><tr><td>Collagénase Type IV</td><td>Gibco de Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>&nbsp ; La collagénase est une protéase avec une spécificité pour la liaison entre un acide aminé neutre (X) et la glycine dans la séquence Pro-XGly-Pro. Comme protéase pour la dissociation des cellules du tissu primaire.</td></tr><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>FALCON&reg ; </td><td>REF-353047</td><td>Pour les CEE pour fixer et raccorder des</td></tr><tr><td>tubes à centrifuger en PP de 50 ml</td><td>Corning&reg ; CentriStarTM</td><td>430829</td><td>Pour le transport des membranes et la digestion enzymatique</td></tr><tr><td>50 ml Tube à fond conique avec capuchon</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>Pour le transport des membranes et la digestion enzymatique</td></tr><tr><td>Bain d’agitation réciproque</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>Pour une meilleure digestion enzymatique sur les membranes</td></tr></tbody></table>

primaire endodermique des cellules épithéliales de la culture yolk sac membrane de japonais quail embryons

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Nous avons établi un modèle épithélial de culture de cellules endodermiques (CEE) pour étudier la fonction de certaines enzymes et des protéines dans la médiation de l&#39;utilisation des nutriments par les embryons aviaires au cours du développement. Fécondés oeufs de caille japonaise ont été incubées à 37 ° C pendant 5 jours, puis jaunes d&#39;membranes sac (YSM) ont été collectées pour établir le système de culture CEE. Nous avons isolé la couche endoderme embryonnaire de YSM et tranché la membrane en 2 - 3 pièces mm et partiellement digéré avec de la collagénase avant le semis dans des plaques de culture de 24 puits. Les CPE prolifèrent sur le tissu et sont prêts pour les études de culture cellulaire. Nous avons constaté que les CPE a des caractéristiques typiques de YSM in vivo, par exemple, l&#39; accumulation de gouttelettes lipidiques, l&#39; expression de la stérol O-acyltransférase et la lipoprotéine lipase. Le traitement de la digestion partielle a augmenté de manière significative le taux de réussite de la culture CEE. Utilisant les CPE, nous avons démontré que l&#39;expression de SOAT1 a été réglementé par le AMPc dla protéine kinase A ependent voie connexe. Ce système de culture caille japonaise CEE primaire est un outil utile pour étudier le transport des lipides embryonnaire et de clarifier le rôle des gènes impliqués dans la médiation de l&#39;utilisation des nutriments dans YSM pendant le développement embryonnaire aviaire.

Afin d&#39;atteindre l&#39;objectif d&#39;établir un modèle cellulaire cohérente et utile, nous devons développer et stabiliser le taux et le rendement des CPE aviaires prolifération. Nous avons comparé l&#39;incubation directe de l&#39;endoderme sans digestion enzymatique avec l&#39;endoderme partiellement digéré avec des enzymes protéolytiques, telles que la collagénase ou collagénase plus 0,6 U de dispase. Dispase est un groupe amino-endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidique...

Pour étudier le mécanisme d’utilisation des lipides dans les membranes du sac vitellin pendant les derniers stades du développement embryonnaire aviaire, nous avons établi un système de culture de cellules épithéliales endodermiques embryonnaires primaires de caille japonaise.

Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

L'objectif général de cette procédure d'explant ex vivo est d'améliorer la collecte et d'élargir l'application des cellules épithéliales endodermiques aviaires afin d'étudier la fonction des enzymes et des protéines dans la médiation de l'utilisation des nutriments par les embryons aviaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'utilisation des lipides durant l'embryogenèse aviaire, telles que la manière dont les lipides du jaune sont emballés et transportés du jaune à l'embryon au cours des stades avancés du développement. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir avec succès des cellules épithéliales endodermiques fonctionnelles à partir de la membrane du sac vitellin de caille japonaise, lesquelles peuvent être utilisées comme modèle pour étudier le développement embryonnaire aviaire.Commencez par préparer une solution de PBS 10x comme décrit dans le protocole écrit. Diluez cette solution mère de un à dix pour obtenir un PBS 1x, qui sera utilisé pour laver la membrane du sac vitellin lors de la dissection de l'endoderme. Pour préparer le milieu de culture destiné aux cellules épithéliales endodermiques, ou EEC, compléte

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Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre la nouvelle culture, une méthode par laquelle les embryons de poulet sont cultivées en dehors de l'œuf jusqu'à 24 heures. Cette méthode permet d'étudier le développement précoce (ligne primitive à 14 soms.), Une période correspondant à E7-9 chez la souris. Les applications de cette technique comprennent l'électroporation, l'hybridation in situ et immunohistochimie.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

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Une approche pour l'analyse des migrations et le destin éventuel de cellules aviaires de la crête neurale chez la caille-poulet embryons chimériques est décrite. Cette méthode est une technique simple et directe pour le traçage des cellules de la crête neurale au cours de la migration et la différenciation qui seraient autrement difficiles à distinguer au sein d'un embryon de poulet non manipulée.

Analyse de la migration des crêtes neurales et la différenciation par la Croix-espèces transplantation

Ici, nous présentons une nouvelle technique de culture d’embryons de poussin ex ovo pour l’imagerie en accéléré à l’aide de la lumière transmise et de la microscopie à fluorescence. Le sandwich de papier filtre immergé est une variante de la technique bien établie du support de papier filtre1 qui permet de cultiver des embryons de poussins entièrement immergés dans un milieu de culture liquide.

Un filtre Sandwich de papier Submergé Long terme Ovo Ex Time-lapse Imaging of Early Chick Embryons

Cet article fournit une approche de mise à jour du système classique caille-poulet chimère pour étudier la formation des organes, en combinant les nouvelles procédures expérimentales in vitro et in ovo .

Approche en deux étapes pour explorer et fin-début de la Formation des organes dans le modèle aviaire : le Thymus et des glandes parathyroïdes organogenèse paradigme

Nous présentons ici un organotypique cultivant protocole pour cultiver des organes embryonnaires de poulet in vitro. En utilisant cette méthode, le développement des tissus embryonnaires de poulet peut être étudié, tout en conservant un haut degré de contrôle sur le milieu de culture.

Méthode de Culture organotypique pour étudier le développement des tissus embryonnaires de poulet

Cet article fournit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires pures de caille et poulet des embryons qui peuvent être combinés pour former ex vivo organes chimérique.

Isolement des tissus embryonnaires et la Formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du Thymus

Ce protocole décrit l'isolement des cellules épithéliales de différentes régions anatomiques de la membrane amniotique humaine pour déterminer leur hétérogénéité et leurs propriétés fonctionnelles pour l'application possible dans les modèles cliniques et physiopathologiques.

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

La membrane chorio-allantoïdienne (CAM) de l’embryon aviaire est un outil très utile et applicable pour divers domaines de recherche. Un modèle ex ovo spécial de CAM de caille japonaise convient à l’investigation de traitement photodynamique.

Membrane chorio-allantoïdienne de caille - Un outil pour le diagnostic photodynamique et la thérapie

Ce protocole polyvalent décrit l’isolement des cellules de la crête neurale prémigratoire (CCN) par l’excision des plis neuraux crâniens des embryons de poussins. Lors du placage et de l’incubation, les NCC migrateurs émergent des explants de plis neuraux, ce qui permet d’évaluer la morphologie et la migration des cellules dans un environnement 2D simplifié.

Préparation et analyse morphologique de cultures de cellules de crête neurale crânienne de poussin

Découvrez la culture primaire de cellules épithéliales endodermiques de membrane vitelline de caille japonaise pour étudier le métabolisme lipidique et le transport des nutriments chez l'embryon aviaire.

Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons

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