Name: Identification des Kinesin-1 Cargos utilisant microscopie à fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Découvrez l'identification des cargos de Kinesin-1 par microscopie à fluorescence utilisant des mutants KIF5B sans moteur dans des cellules HeLa. Cette méthode permet de visualiser l'agrégation des cargos comme c-MYC et p53.

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La subvention de publication de Roche a couvert la publication en libre accès et la production de cet article. L’auteur remercie également E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip et Sol D. Gloria pour leur soutien et leur lecture critique du manuscrit.

1. Clonage du type sauvage de tdTomato-marqués et sans moteur KIF5B Protéines <ol><li> Amplifier l&#39;ADNc de type sauvage humain et les protéines de KIF5B sans moteur en utilisant les amorces dans le tableau 1, l&#39;ADN polymerase Taq (5 unités pour 100 ul), mélange de dNTP (2 mM pour chaque désoxynucléotide) et son tampon 10X pendant 30 cycles. Chaque cycle consiste en une étape de dénaturation (95 ° C pendant 30 secondes), une étape de recuit (45 ° C pendant 30 sec) et une étape d&#39;extension (72 ° C pendant 3 min). </li><li> Extraire le produit d&#39;ADN amplifié avec un volume égal de phénol / chloroforme (1: 1). Remarque: Le phénol est combustible et peut causer des brûlures. Le chloroforme est dangereux. Éviter tout contact direct avec eux et de les utiliser sous une hotte chimique. En variante, les produits de PCR peuvent être purifiés par divers kits. <ol><li> Tourner à 18.000 xg dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 1 min. Transférer la solution aqueuse dans un nouveau tube et on extrait avec un volume égal de chloroforme. </li><li> Tournerà 18 000 x g dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 0,5 min. Transférer la solution aqueuse dans un nouveau tube. </li><li> Mélanger la solution aqueuse avec un dixième de volume de 3 M d&#39;acétate de sodium et de deux volumes d&#39;éthanol absolu. </li><li> Tourner à 18.000 xg dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 5 min. Jeter la solution aqueuse. </li><li> Laver le culot d&#39;ADN avec deux volumes d&#39;éthanol à 75%. Jeter la solution aqueuse et sécher à l&#39;air le culot d&#39;ADN à température ambiante pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille d&#39;ADN dans 34 ul d&#39;eau. </li></ol></li><li> Digérer les produits amplifiés dans un volume final de 40 ul avec enzymes de restriction SalI (10 unités) et BamHl (10 unités) et 4 ul de tampon 10X leur à 37 ° C pendant deux heures. Résoudre les produits de digestion dans un gel d&#39;agarose (1,0% à 100 V) contenant du bromure d&#39;éthidium (0,2 pg / ml). Remarque: Le bromure d&#39;éthidium est un mutagène puissant et peut être absorbé par la peau. Par conséquent, il est important d&#39;éviter tout contact direct ou indirect avecie bromure d&#39;éthidium. </li><li> Découper les bandes correctes pour la purification par des colonnes. Peser le gel d&#39;agarose contenant le fragment d&#39;ADN. Puis le dissoudre dans le tampon de solubilisation (300 ul de 0,1 g) à 37 ° C pendant environ 20 min. </li><li> Ajouter la solution résultante à une colonne de centrifugation et dans une microcentrifugeuse à température ambiante pendant 5 sec. Jeter le accréditives. </li><li> Laver la colonne avec du tampon de solubilisation de 0,5 ml en répétant l&#39;étape 1.5. Laver la colonne de nouveau avec 0,75 ml de tampon de lavage en répétant l&#39;étape 1.5. Faites tourner la colonne pendant 2 min pour se débarrasser de la mémoire tampon de lavage restant. </li><li> Éluer le fragment d&#39;ADN avec 50 ul d&#39;eau en répétant l&#39;étape 1.5. Estimer la concentration du fragment d&#39;ADN par l&#39;exécution d&#39;une partie aliquote de celui-ci contre une échelle de taille de l&#39;ADN dans un gel d&#39;agarose (1,0% à 100 V) contenant du bromure d&#39;éthidium (0,2 pg / ml). </li><li> Ligaturer les produits purifiés (environ 100 ng) avec le vecteur ptdTomato-C1 17 (environ 100 ng) préalablement digéré par ee mêmes enzymes de restriction dans 10 pl en utilisant l&#39;ADN ligase T4 (2.000 unités) et 1 ul de tampon de ligature 10X à la température ambiante pendant 16 heures. Remarque: Le type sauvage et mutant sans moteur contient des acides aminés de 2 à 963 et 584 à 963, respectivement. Auparavant, un mutant de plus grand KIF5B sans moteur a été utilisé pour identifier sa fonction 9. Un mutant de plus petit KIF5B sans moteur a été utilisé pour les présentes études pour augmenter ses niveaux d&#39;expression. </li></ol> 2. immunofluorescence Microscopie <ol><li> Pour des cellules vivantes ou l&#39;imagerie par fluorescence indirecte, avec un grossissement égal ou inférieur à 40X, ensemencer 0,2-0,3 millions de cellules HeLa dans 1 ml de milieu complet [milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS)] dans chaque puits d&#39;une plaque de six puits. Croissance à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Pour les études d&#39;immunofluorescence indirecte avec un grossissement 40X ci-dessus, laver les verres de couverture (18 mm x 18 mm; 1,5 d&#39;épaisseur) dans brièvement de l&#39;éthanol absolu et de les sécher à l&#39;air dansles puits d&#39;une plaque à six puits, à l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination. <ol><li> Semences 0,2-0,3 millions de cellules dans 1 ml de milieu complet DMEM dans chaque puits d&#39;une plaque à six puits. </li></ol></li><li> Préparation du complexe de transfection <ol><li> Le lendemain, à l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique, diluer 0,6 pg (total) du plasmide d&#39;expression pour de type sauvage tdTomato marqués ou KIF5B sans moteur dans la présence ou l&#39;absence d&#39;un plasmide d&#39;expression pour une protéine candidate de fret (pTagCFP-c-MYC 5 ) avec 0,1 ml de milieu de transfection dans un tube de 1,6 ml à centrifuger. Note: Le vecteur pTagCFP-c-MYC exprime le c-MYC TagCFP marqués. </li><li> Ajouter 1,8 ul du réactif de transfection de 0,1 ml de milieu de transfection dans un autre tube de microcentrifugation de 1,6 ml. Typiquement, préparer un mélange maître de réactif de transfection diluée suffisant pour 12 échantillons. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter dilué 0,1 ml de réactif de transfection aux dilué 0,1 ml ADN. Mix le contenu en inversant les tubes. Faites tourner les tubes pendant 5 secondes dans une microcentrifugeuse. </li><li> Incuber pendant 45 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Lavage des cellules <ol><li> On lave les cellules ensemencées à trois reprises avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant la période d&#39;incubation pour la formation du complexe de transfection. </li><li> Remplacer le milieu des cellules ensemencées dans chaque puits avec 0,8 ml de milieu de transfection préchauffé. Retourner les plaques dans l&#39;incubateur à 37 ° C. </li></ol></li><li> La transfection de cellules <ol><li> Après une incubation de 45 min, ajouter 0,2 ml du complexe réactif DNA / transfection (préparé à l&#39;étape 2.3) goutte à goutte dans chaque puits de la plaque. </li><li> Basculer la plaque à 6 puits doucement pendant 5 secondes, avant d&#39;être remises dans l&#39;incubateur à 37 ° C. </li><li> Après 6-8 heures, remplacer le milieu avec le milieu DMEM complet. </li></ol></li><li> Pour des cellules vivantes d&#39;imagerie par fluorescence 18 <ol><li> Après une 16 heures d&#39;incubation supplémentaire d&#39;uneT 37 ° C, ajouter le colorant intercalant de l&#39;ADN Hoechst 33342 dans le milieu à une concentration finale de 1 uM. Remarque: Hoechst 33342 est un colorant intercalant de l&#39;ADN de la cellule-perméable qui colore les noyaux des cellules. </li><li> Incuber les cellules transfectées pendant 10 minutes dans l&#39;incubateur à 37 ° C avant de les examiner pour l&#39;expression de protéines fluorescentes par microscopie à fluorescence utilisant un objectif 40X. Les jeux de filtres pour DAPI, CFP, FITC et Cy3 sont (EX350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) et (Ex545 nm / Em605 nm), respectivement. Note: Si le fond est élevé en raison de l&#39;auto-fluorescence du milieu DMEM complet, milieu sans rouge de phénol est utilisé. </li></ol></li></ol> 3. Pour études immunofluorescence indirecte <ol><li> Préparation de la solution de paraformaldéhyde <ol><li> Peser la poudre de paraformaldéhyde (4 g par 100 ml de PBS) et l&#39;ajouter à PBS. Remarque: Le paraformaldéhyde est un solide inflammable et un Hazar potentiel de cancerré. Il irrite les yeux, les voies respiratoires et la peau. Par conséquent, il est important d&#39;éviter tout contact avec du paraformaldéhyde ou par inhalation. </li><li> Ajouter à la solution de NaOH (150 ul 10 N NaOH / 100 ml). </li><li> Conserver la solution à 37 à 42 ° C pendant 2-3 heures en agitant de temps. </li><li> Ajuster le pH à 7,0 par addition d&#39;acide acétique glacial à la solution (environ 75 ul / 100 ml) après que la poudre de paraformaldéhyde est dissous. </li></ol></li><li> Cibler des protéines coloration <ol><li> Après une incubation pendant 16 heures à 37 ° C, laver les cellules transfectées à la température ambiante une fois avec PBS par tourbillonnement la plaque à six puits pendant 5 sec. </li><li> Fixer les cellules avec 1 ml de fraîchement préparée, d&#39;une solution de paraformaldehyde à 4% par puits. Incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS, une fois par tourbillonnement pendant 5 secondes, la plaque à six puits. Jeter la solution. </li><li> Incuber les cellules avec 1 ml de 0,1% de Triton X-100 (dans du PBS) à température ambiante pendant 30 min. la detergent Triton X-100 se perméabiliser la membrane cellulaire pour permettre l&#39;accès de l&#39;anticorps à leurs cibles intracellulaires. </li><li> Laver les cellules avec du PBS quatre fois par tourbillonnement la plaque à six puits pendant 5 secondes à chaque fois. Jeter la solution après chaque lavage. </li><li> Incuber les cellules avec 1 ml d&#39;anticorps primaires (c-MYC anticorps de lapin ou un anticorps de souris; p53 0,1 ug / ml) dans un FBS 10% dans une solution PBS à température ambiante en secouant pendant 4 heures. </li><li> Laver avec du PBS quatre fois par tourbillonnement la plaque à six puits pendant 5 secondes à chaque fois. Jeter la solution après chaque lavage. </li><li> Incuber avec 1 ml d&#39;anticorps secondaires fluorescents colorant conjugué (Alexa Fluor anti-lapin 488 conjugué ou anti-souris d&#39;anticorps IgG; 0,5 ug / ml) dans 10% de FBS dans du PBS à la température ambiante dans l&#39;obscurité par basculement pendant 2 heures. </li><li> Laver avec du PBS quatre fois par tourbillonnement la plaque à six puits pendant 5 secondes à chaque fois. Jeter la solution après chaque lavage. </li></ol></li><li> Coloration et montage nucléaire <ol><li&gt; incuber les cellules avec l&#39;ADN 1 ml de colorant intercalant 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; 0,5 ug / ml) dans du PBS à la température ambiante, dans l&#39;obscurité pendant 10 minutes. Passez à l&#39;étape 3.4 en l&#39;absence de lamelles sont utilisés. Remarque: DAPI est un colorant intercalant d&#39;ADN qui colore les noyaux des cellules. </li><li> Appliquer 10 pi de solution de montage sur chaque lame de microscope. Monter chaque verre de couverture sur la solution de montage sur une lame de microscope. </li><li> Incuber à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant une nuit. </li><li> Sceller les bords des lamelles avec du vernis à ongles. Placez dans le noir à l&#39;intérieur d&#39;une hotte nuit pour enlever les ongles fumées polonais. </li></ol></li><li> Fluorescence Microscopy 19 <ol><li> Le lendemain, examiner les cellules par microscopie à fluorescence en utilisant un objectif 40X. Les jeux de filtres pour DAPI, CFP, FITC et Cy3 sont (EX350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) et (Ex545 nm / Em605 nm), respectivement. </li></ol></li></ol>

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Le procédé décrit utilise les propriétés du mutant KIF5B sans moteur, qui n&#39;a pas la capacité de se déplacer le long des microtubules, mais conserve la capacité de former des dimères avec le KIF5B de type sauvage et, de ce fait, permettre à la protéine tétramérique pour interagir avec les mêmes protéines cargo comme le type sauvage KIF5B. KIF5B sans moteur, par conséquent, agit comme un mutant dominant négatif et formes mislocalized agrège avec ses cargaisons. Cette méthode a fait ses preuves pour identifier la kinésine-1 cargaison c-myc (Figure 1) 5. Dans cet article, le même mutant KIF5B sans moteur a été utilisé pour identifier p53 comme une autre cargaison potentielle de Kinesin-1 (Figure 2). Ceci montre que la méthode est possible d&#39;identifier d&#39;autres chargements de la kinésine-1. En outre, la spécificité du mutant est assurée par l&#39;absence d&#39;effet du mutant de la protéine de régulation négative de c-Fos (Figure 3). Dans ce protocole, l&#39;tdTomato marqués wild-tyPE ou protéine KIF5B sans moteur est co-exprimé avec une autre protéine cargo candidat protéine marqué fluorescent. Dans ce cas, la microscopie par fluorescence des cellules vivantes et l&#39;imagerie est effectuée. La formation des agrégats peut être tracée par imagerie time-lapse. En variante, la protéine à marquage tdTomato est exprimée seule et la protéine cargo candidat à son niveau physiologique est visualisé par microscopie à immunofluorescence indirecte en utilisant des anticorps spécifiques. TdTomato la protéine fluorescente est choisie pour son éclat et 17 photostabilité. Si le fond est élevé en raison de l&#39;auto-fluorescence du milieu DMEM complet, milieu sans rouge de phénol est utilisé. Le mutant KIF5B motorless forme des dimères avec le type sauvage KIF5B stoechiométriquement. Par conséquent, il est essentiel d&#39;exprimer une quantité suffisante de mutant KIF5B sans moteur pour former des dimères avec la contrepartie de type sauvage pour inhiber son fonctionnement et à former des agrégats. Pour résoudre ce problème, l&#39;optimisation de expression du mutant sans moteur est essentiel. Il est réalisé en utilisant une petite mutant sans moteur contenant le domaine de dimérisation. En outre, l&#39;optimisation du réactif de transfection approprié et le protocole est également nécessaire. La durée de l&#39;incubation des cellules HeLa avec le réactif DNA / transfection a été optimisé dans les cellules HeLa pour l&#39;expression de protéines exogènes et la viabilité des cellules. La durée d&#39;incubation peut être optimisé pour d&#39;autres lignées cellulaires. Pour des grossissements entre 4X à 40X, pas de verres de couverture sont nécessaires. Les cellules peuvent être directement examinés dans les puits. Par conséquent, dans ce cas, le protocole est peu coûteuse et commode. Pour grossissement 40X ci-dessus, les cellules sont cultivées sur des lamelles dans les puits et, après coloration, sont montés sur des lames de microscope à l&#39;examen d&#39;objectifs à immersion. Observation d&#39;agrégats de la protéine KIF5B sans moteur est limitée par la taille du cytoplasme. Il est aisé de détecter laagrégats de cellules de mammifères. Cependant, il est relativement difficile d&#39;observer les agrégats de cellules neuronales lorsque le volume du cytoplasme est faible autour des noyaux et dans les neurites. Le protocole est utilisé pour montrer le lien entre KIF5B et ses cargaisons en plus de l&#39;in vivo deux hybrides de levure et biochimiques analyses déroulants 13-16. Tous ces tests déterminent l&#39;association dans différentes conditions physiques et leurs résultats peuvent se compléter mutuellement. En outre, l&#39;avantage de ce test de fluorescence par rapport aux autres tests est qu&#39;il peut montrer la régulation de la localisation subcellulaire des cargaisons par KIF5B (figures 1 et 2). Le protocole ne se limite pas à KIF5B et peut être utilisée pour identifier d&#39;autres protéines cargos à moteur, tels que d&#39;autres moteurs kinésine 3 et une partie des moteurs de myosine 23,24 utilisées dans le transport intracellulaire de cargaisons 3. Ces protéines motrices contiennent également des domaines moteurs pour le mouvement le long des microtubules pour les moteurs de kinésine et microfilaments pour les moteurs de myosine, et segments bispirales pour oligomérisation. La plupart d&#39;entre eux forment des homodimères 3,23. Par conséquent, une stratégie similaire peut être appliqué à eux en créant leurs sans moteur mutants négatifs dominants d&#39;identifier leurs cargaisons.

Kinésine-1 est une protéine de moteur qui médie le transport antérograde de ses cargaisons 1,2. Il est un hétérotétramère des deux sous-unités de la chaîne Kinesin Light 1 (KLC1) et deux sous-unités de chaînes Kinesin lourds (KHCs). KIF5B 1, un KHC, contient un domaine de moteur à son extrémité N-terminale, qui hydrolyse l&#39;ATP et convertit l&#39;énergie chimique en énergie mécanique pour effectuer un mouvement le long des microtubules. La région C-terminale contenant le domaine de dimérisation qui interagit avec KLC1, qui associe à cargaisons. Kinésine-1 transporte des cargaisons telles que des vésicules, des organelles et 3,4 ARNm. Récemment, KIF5B a été montré pour le transport du facteur de transcription nucléaire, c-MYC protéosomale la dégradation dans le cytoplasme 5. Trois méthodes (inhibiteur chimique, siRNA / shRNA et mutants dominant négatif) ont été utilisés pour inhiber la kinésine-1 fonction. Ils ont tous induit l&#39;agrégation de c-MYC dans le cytoplasme. Pour la dernière méthode, c-MYC n&#39;a été affectée par la negat dominanteive mutant de KIF5B, mais pas celle d&#39;une autre protéine apparentée kif5a moteur, ce qui suggère que le mutant n&#39;exerce des effets généraux sur les composants intracellulaires (tels que la perturbation des microtubules) ou sur l&#39;agrégation des protéines. Le mutant dominant négatif de KIF5B aussi n&#39;a pas affecté un autre facteur de transcription, ce qui suggère qu&#39;il n&#39;exerce des effets généraux sur les facteurs de transcription. Elle suggère plutôt que le mutant dominant négatif exerce des effets spécifiques sur ses cargaisons. L&#39;utilisation de mutants négatifs dominants est courant dans le domaine des protéines motrices. mutants sans moteur similaires de kinésines et myosines ont été utilisés précédemment. Ils ont été principalement utilisés pour démontrer les effets des mutants sur les localisations subcellulaires de leurs cargaisons ou sur les fonctions cellulaires 6-12. Moins l&#39;accent a été mis sur la relation spatiale entre les mutants et les cargos touchés par eux. Toutefois, dans certains incidents, les mutants ont été observés pour co-localiser avec leur caRGOS 6,10. L&#39;interaction entre KIF5B et ses protéines associées a déjà été confirmée par la levure in vivo de dosage à deux hybrides et biochimiques analyses déroulants telles que la co-immunoprécipitation et essais in vitro déroulants 13-16. Dans cet article, une méthode utilisant la microscopie à fluorescence visuelle supplémentaire est décrit pour identifier les protéines de fret KIF5B. Le procédé fait usage d&#39;un mutant de KIF5B sans moteur qui agit en tant que mutant négatif dominant. Il regroupe dans le cytoplasme et induit une agrégation de ses cargaisons. Le marquage de type sauvage et mutant KIF5B sans moteur avec la protéine fluorescente tdTomato 17 permet leur visualisation par microscopie à fluorescence. Les protéines de KIF5B marqués peuvent être co-exprimés avec une protéine candidate fusionnée à une protéine fluorescente différente ayant des propriétés spectrales séparées de façon appropriée la balise KIF5B. Les protéines marquées sont observées directement dans les cellules vivantessous microscopie à fluorescence. L&#39;induction de l&#39;agrégation de la protéine candidate par le mutant sans moteur KIF5B confirme que la protéine candidate est un cargo de KIF5B in vivo. En outre, les protéines de KIF5B tdTomato marqués peuvent être exprimés seuls dans les cellules pour étudier leurs effets sur les protéines cargos endogènes. Par la suite, la microscopie d&#39;immunofluorescence est réalisée dans lequel les cellules transfectées sont fixées et colorées avec un anticorps spécifique contre la protéine candidat endogène, suivi d&#39;un anticorps secondaire approprié conjugué à un colorant fluorescent. Dans ce cas, la protéine candidate endogène à son niveau physiologique est étudié. mutants sans moteur similaires d&#39;autres protéines motrices peuvent être préparés à identifier leurs cargaisons.

<table><tbody><tr><td>éthanol absolu (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (milieu de transfection)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldéhyde, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 Réactif de transfection d’ADN</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymérase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de nucléotides de qualité PCR (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>Couverture du microscope verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Échelle d’ADN</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Kit d’extraction rapide de gel</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&nbsp ;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC</td> anticorps de lapin <td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53</td> anticorps de souris <td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugué anti-lapin IgG</td> anticorps Life <td>Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugué anti-souris IgG</td> anticorps <td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>microscope fluorescent&nbsp ;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>logiciel informatique pour l’imagerie</td><td>&nbsp ; cellSens&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification des kinesin-1 cargos utilisant microscopie à fluorescence

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

La microscopie à fluorescence est utilisée pour identifier les cargaisons de kinésine-1. Récemment, il a été démontré que la chaîne lourde de la kinésine-1 (KIF5B) transporte le facteur de transcription nucléaire c-MYC pour la dégradation protéosomale dans le cytoplasme. La méthode décrite ici implique l’étude d’un mutant KIF5B sans moteur pour la microscopie à fluorescence. Les protéines KIF5B de type sauvage et sans moteur sont marquées avec la protéine fluorescente tdTomato. Le tdTomato-KIF5B de type sauvage apparaît de manière homogène dans le cytoplasme, tandis que le mutant tdTomato-KIF5B sans moteur forme des agrégats dans le cytoplasme. L’agrégation du mutant sans moteur KIF5B induit l’agrégation de son cargo c-MYC dans le cytoplasme. Par conséquent, cette méthode fournit un moyen visuel d’identifier les cargaisons de Kinesin-1. Une stratégie similaire peut être utilisée pour identifier les cargaisons d’autres protéines motrices.

Exogène exprimé KIF5B de type sauvage est apparu de façon homogène dans le cytoplasme, tandis que c-MYC est apparu principalement dans le noyau (figure 1A). Cependant, le mutant sans moteur KIF5B agrégats formés dans le cytoplasme (Figure 1A). Agrégation de l&#39;KIF5B sans moteur induit l&#39;agrégation de c-MYC. Le pourcentage de cellules exprimant agrégées TagCFP marqués c-MYC dans les cellules exprimant de type sauvage KIF5B était faible. Cependant, il était significativement plus élevée lorsque le KIF5B sans moteur a été co-exprimé (figure 1A). La co-localisation de KIF5B observé avec le mutant c-MYC (figure 1) indique que KIF5B régule la localisation subcellulaire de c-myc et c-MYC est une cargaison de kinésine-1. Les témoins négatifs dans lesquels les constructions ont été exprimés seuls sont inclus dans la partie inférieure de la figure 1A. Les résultats montrent qu&#39;il n&#39;y a pas de purge à travers intensité de fluorescence EMISSIOn. Le KIF5B motorless également induit l&#39;agrégation de la endogène c-MYC (figure 1B) et la p53 du facteur de transcription (Figure 2), ce qui indique que c-Myc et p53 sont tous les deux des cargos de la kinésine-1 et KIF5B régule la localisation subcellulaire des deux protéines endogènes. Ainsi que les résultats que l&#39;inhibiteur-1 Kinesin rose bengale lactone (RBL) 20 induit la formation d&#39;espèces de haut poids moléculaire à la fois c-Myc et cinq p53, p53 est susceptible d&#39;une cargaison de kinésine-1. Il est intéressant de noter que le facteur de transcription p53 nucléaire, comme c-MYC, est également exporté du noyau vers le cytoplasme de la dégradation par le protéasome 21,22. Le mouvement des facteurs de transcription par KIF5B semble être spécifique, car l&#39;expression du mutant KIF5B sans moteur n&#39;a pas affecté la localisation subcellulaire c-Fos ou l&#39;amener à agréger (figure 3). Les données ci-dessus démontrent que le méthod employées dans cette publication permet l&#39;identification de haute spécificité de Kinesin-1 cargaisons. Une stratégie similaire peut être appliquée à d&#39;autres protéines motrices ainsi. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Figure 1: Expression du mutant KIF5B sans moteur induit une agrégation c-MYC dans le cytoplasme (A) des cellules HeLa ont été transfectées avec de type sauvage tdTomato marqués (WT) KIF5B (rouge) et TagCFP marqués c-MYC (bleu).. tdTomato marqués WT KIF5B apparu principalement dans le cytoplasme, tandis que TagCFP-tagged c-MYC est apparu principalement dans le noyau. Cependant, le mutant sans moteur KIF5B tdTomato marqués (rouge) formée d&#39;agrégats filamenteux ou ponctuées dans le cytoplasme. L&#39;expression de la KIF5B motorless induit l&#39;agrégation de c-MYC. Le KIF5B mutant et c-MYC co-localisées ensemble (rose). Les pourcentages de cellules (%) indiquant agrégats de CFP-c-MYC (%) sont présentés. Les résultats sont présentés en tant quemoyenne ± écart type (n = 3). Les contrôles négatifs avec l&#39;expression de protéines de KIF5B tdTomato-marqués ou TagCFP marqués c-MYC avec des vecteurs vides (V) sont présentés dans le panneau inférieur. (B) Des résultats similaires ont été obtenus avec l&#39;endogène c-MYC (vert) lorsque WT tdTomato marqués ou des protéines de KIF5B sans moteur (rouge) ont été exprimées. Le mutant KIF5B motorless tdTomato marqués agrégats formés dans le cytoplasme et l&#39;agrégation de la endogène induite par c-MYC. Les deux types de granulats co-localisés dans le cytoplasme ensemble (orange). Les noyaux ont été colorés avec le colorant Hoechst 33342 ou DAPI. La barre d&#39;échelle; 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Figure 2: Expression du mutant KIF5B sans moteur induit une agrégation de p53 endogène dans til cytoplasme. Dans les cellules HeLa, exogène de type sauvage tdTomato marqués (WT) KIF5B (rouge) est apparue principalement dans le cytoplasme, tandis que le p53 endogène (vert) est apparue principalement dans le noyau. En revanche, le mutant sans moteur KIF5B tdTomato marqués (rouge) formée d&#39;agrégats dans le cytoplasme. L&#39;expression de la KIF5B motorless induit l&#39;agrégation de p53, ce qui entraîne la co-localisation de KIF5B et p53 dans le cytoplasme (jaune). L&#39;expérience a été effectuée trois fois. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI colorant. La barre d&#39;échelle; 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Figure 3:. Expression du mutant KIF5B sans moteur ne provoque pas l&#39;agrégation de c-Fos dans le cytoplasme tdTomato-étiqueté de type sauvage (WT) KIF5B (rouge) est apparuprincipalement dans le cytoplasme des cellules HeLa, tandis EGFP-c-Fos (vert) est apparu principalement dans le noyau. Au contraire, le mutant sans moteur KIF5B tdTomato marqués (rouge) formée d&#39;agrégats dans le cytoplasme. L&#39;expression de la KIF5B sans moteur n&#39;a pas induit l&#39;agrégation de c-Fos. L&#39;expérience a été effectuée quatre fois. Les noyaux des cellules ont été colorées avec du DAPI tinctoriale. La barre d&#39;échelle; 20 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> amorce inverse commune </td><td> AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC 5&#39;-3 &#39; </td></tr><tr><td> De type sauvage KIF5B amorce sens </td><td> AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT 5&#39;-3 &#39; </td></tr><tr><td> KIF5B motorless amorce sens </td><td> AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC 5&#39;-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tableau 1: Les séquences des amorces de clonage de type sauvage et des protéines de KIF5B sans moteur.

Ici, un protocole est présenté pour identifier Kinesin-1 cargaisons. Un mutant sans moteur du Kinesin-1 chaîne lourde (KIF5B) agrège dans le cytoplasme et induit une agrégation de ses cargaisons. Les deux granulats sont détectés au microscope à fluorescence. Une stratégie similaire peut être utilisée pour identifier d&#39;autres protéines cargos à moteur.

Identification des Kinesin-1 Cargos utilisant microscopie à fluorescence

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

L’objectif global de cette méthodologie est d’identifier les cargaisons de Kinesin-1 à l’aide de la microscopie à fluorescence. Cette méthode nous aide à répondre à des questions clés dans le domaine des moteurs moléculaires, telles que les cargaisons transportées par les kinésines et les myosines. Le principal avantage de cette technique est que les mutants négatifs dominants de KIF5B peuvent nous aider à identifier visuellement cette cargaison à l’aide de la microscopie fluorescente.Pour commencer, pour l’imagerie de cellules vivantes ou de fluorescence indirecte à 40X ou moins, alimentez 0,2 à 0,3 million de cellules HeLa dans un millilitre de milieu complet dans chaque puits d’une plaque à six puits. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Pour les études d’immunofluorescence indirecte avec des grossissements supérieurs à 40X, dans une enceinte de biosécurité pour éviter la contamination, utilisez de l’alcool absolu pour laver les verres de couverture et placez-les dans les puits d’une plaque à six puits pour les faire sécher à l’air.Lorsque les lamelles ont séché, déposez-les dans les puits et ensemencez 0,2 à 0,3 million de cellules dans un millilitre de DMEM complet dans chaque puits de la plaque. Cultivez les cellules pendant la nuit. Le lendemain, à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, utilisez 0,1 millilitre de milieu de transfection pour diluer 0,6 microgramme d’un plasmide d’expression KIF5B de type sauvage ou sans moteur marqué tdTomato avec ou sans plasmide exprimant une protéine cargo candidate.Dans un autre tube de microcentrifugation de 1,6 millilitre, ajoutez 1,8 microlitre de réactif de transfection à 0,1 millilitre de milieu de transfection. Ensuite, incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 0,1 millilitre du réactif de transfection dilué aux échantillons d’ADN dilués.Retournez les tubes pour mélanger le contenu et tournez pendant cinq secondes. Ensuite, incubez les échantillons à température ambiante pendant 45 minutes. Pendant la période d’incubation pour la formation du complexe de transfection, utilisez du PBS pour laver les cellules trois fois.Ajoutez ensuite 0,8 millilitres de milieu de transfection préchauffé dans chaque puits et remettez les plaques dans l’incubateur. Une fois que le réactif de transfection dilué a incubé pendant 45 minutes, ajoutez 0,2 millilitres de la solution goutte à goutte dans chaque puits de la plaque. Secouez doucement la plaque à six puits pendant cinq secondes et remettez-la dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures.Utilisez ensuite du DMEM complet pour remplacer le support. Pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes après 16 heures supplémentaires d’incubation, ajoutez la coloration intercalaire d’ADN Hoechst 33342 au milieu jusqu’à une concentration finale de 1 micromolaire et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’un objectif 40X, examinez les cellules pour l’expression de protéines fluorescentes.Pour effectuer une immunofluorescence indirecte sur des cellules qui ont été incubées avec un réactif de transfection :Après avoir préparé le paraformaldéhyde selon le protocole textuel, utilisez du PBS à température ambiante pour laver les cellules en faisant tourner la plaque à six puits pendant cinq secondes. Ajouter un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % et de PBS fraîchement préparés par puits et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Utilisez ensuite du PBS pour laver les cellules une fois en faisant tourner la plaque et jetez la solution.Ensuite, ajoutez un millilitre de 0,1 % Triton-X 100 dans du PBS dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant 30 minutes pour perméabiliser les cellules. Ensuite, utilisez du PBS pour laver les cellules quatre fois, en jetant la solution après chaque lavage. Ajoutez des anticorps primaires et incubez les cellules à température ambiante en les balançant pendant quatre heures.Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les cellules quatre fois en faisant tourner la plaque. Ajoutez ensuite un millilitre d’anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent et incubez dans l’obscurité à température ambiante avec balancement pendant deux heures. Après avoir lavé les cellules quatre fois avec du PBS, ajoutez un millilitre de DAPI et incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant dix minutes.Si vous utilisez des verres de protection avec les échantillons, appliquez 10 microlitres de solution de montage au centre de la lame de microscope et montez un verre de protection sur la solution de montage. Ensuite, incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords et incubez dans l’obscurité dans une hotte pendant la nuit.Pour effectuer la microscopie à fluorescence, utilisez un objectif 40X avec les jeux de filtres pour DAPI, CFP, FITC et Cy3 le cas échéant. Comme démontré ici, les KIFB de type sauvage exprimés de manière exogène sont apparus de manière homogène dans le cytoplasme, tandis que c-MYC est apparu principalement dans le noyau. Le mutant KIF5B sans moteur, cependant, a formé des agrégats dans le cytoplasme, ce qui a conduit à l’agrégation de c-MYC.De plus, le KIF5B sans moteur a également induit l’agrégation du c-MYC endogène et du facteur de transcription p53, indiquant que c-MYC et p53 sont tous deux les cargaisons de kinésine-1 et que KIF5B régule la localisation subcellulaire des deux protéines endogènes. Cette figure illustre que le mouvement des facteurs de transcription par KIF5B semble être spécifique car l’expression du mutant KIF5B sans moteur n’a pas affecté la localisation subcellulaire de c-Fos ni provoqué son agrégation. Ces données révèlent que la méthode démontrée dans cette vidéo permet l’identification à haute spécificité des cargaisons de Kinesin-1.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les kinésines conviennent le mieux aux cellules qui ont beaucoup de volume de cytoplasme afin que l’agrégation dans le cytoplasme puisse être facilement observée. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des moteurs moléculaires pour construire des mutants négatifs dominants similaires d’autres kinésines et myosines afin d’identifier leurs cargaisons particulières. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le mutant négatif dominant d’un moteur moléculaire pour identifier cette cargaison, à l’aide de la microscopie fluorescente.N’oubliez pas que travailler avec du phéno, du bromure d’éthidium et du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises pour éviter tout contact direct de la peau avec eux lors de cette procédure. Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans votre expérience.

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