Identification des Kinesin-1 Cargos utilisant microscopie à fluorescence

L’objectif global de cette méthodologie est d’identifier les cargaisons de Kinesin-1 à l’aide de la microscopie à fluorescence. Cette méthode nous aide à répondre à des questions clés dans le domaine des moteurs moléculaires, telles que les cargaisons transportées par les kinésines et les myosines. Le principal avantage de cette technique est que les mutants négatifs dominants de KIF5B peuvent nous aider à identifier visuellement cette cargaison à l’aide de la microscopie fluorescente.

Pour commencer, pour l’imagerie de cellules vivantes ou de fluorescence indirecte à 40X ou moins, alimentez 0,2 à 0,3 million de cellules HeLa dans un millilitre de milieu complet dans chaque puits d’une plaque à six puits. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Pour les études d’immunofluorescence indirecte avec des grossissements supérieurs à 40X, dans une enceinte de biosécurité pour éviter la contamination, utilisez de l’alcool absolu pour laver les verres de couverture et placez-les dans les puits d’une plaque à six puits pour les faire sécher à l’air.

Lorsque les lamelles ont séché, déposez-les dans les puits et ensemencez 0,2 à 0,3 million de cellules dans un millilitre de DMEM complet dans chaque puits de la plaque. Cultivez les cellules pendant la nuit. Le lendemain, à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité, utilisez 0,1 millilitre de milieu de transfection pour diluer 0,6 microgramme d’un plasmide d’expression KIF5B de type sauvage ou sans moteur marqué tdTomato avec ou sans plasmide exprimant une protéine cargo candidate.

Dans un autre tube de microcentrifugation de 1,6 millilitre, ajoutez 1,8 microlitre de réactif de transfection à 0,1 millilitre de milieu de transfection. Ensuite, incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 0,1 millilitre du réactif de transfection dilué aux échantillons d’ADN dilués.

Retournez les tubes pour mélanger le contenu et tournez pendant cinq secondes. Ensuite, incubez les échantillons à température ambiante pendant 45 minutes. Pendant la période d’incubation pour la formation du complexe de transfection, utilisez du PBS pour laver les cellules trois fois.

Ajoutez ensuite 0,8 millilitres de milieu de transfection préchauffé dans chaque puits et remettez les plaques dans l’incubateur. Une fois que le réactif de transfection dilué a incubé pendant 45 minutes, ajoutez 0,2 millilitres de la solution goutte à goutte dans chaque puits de la plaque. Secouez doucement la plaque à six puits pendant cinq secondes et remettez-la dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures.

Utilisez ensuite du DMEM complet pour remplacer le support. Pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes après 16 heures supplémentaires d’incubation, ajoutez la coloration intercalaire d’ADN Hoechst 33342 au milieu jusqu’à une concentration finale de 1 micromolaire et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’un objectif 40X, examinez les cellules pour l’expression de protéines fluorescentes.

Pour effectuer une immunofluorescence indirecte sur des cellules qui ont été incubées avec un réactif de transfection :Après avoir préparé le paraformaldéhyde selon le protocole textuel, utilisez du PBS à température ambiante pour laver les cellules en faisant tourner la plaque à six puits pendant cinq secondes. Ajouter un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % et de PBS fraîchement préparés par puits et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Utilisez ensuite du PBS pour laver les cellules une fois en faisant tourner la plaque et jetez la solution.

Ensuite, ajoutez un millilitre de 0,1 % Triton-X 100 dans du PBS dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant 30 minutes pour perméabiliser les cellules. Ensuite, utilisez du PBS pour laver les cellules quatre fois, en jetant la solution après chaque lavage. Ajoutez des anticorps primaires et incubez les cellules à température ambiante en les balançant pendant quatre heures.

Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les cellules quatre fois en faisant tourner la plaque. Ajoutez ensuite un millilitre d’anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent et incubez dans l’obscurité à température ambiante avec balancement pendant deux heures. Après avoir lavé les cellules quatre fois avec du PBS, ajoutez un millilitre de DAPI et incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant dix minutes.

Si vous utilisez des verres de protection avec les échantillons, appliquez 10 microlitres de solution de montage au centre de la lame de microscope et montez un verre de protection sur la solution de montage. Ensuite, incubez dans l’obscurité à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords et incubez dans l’obscurité dans une hotte pendant la nuit.

Pour effectuer la microscopie à fluorescence, utilisez un objectif 40X avec les jeux de filtres pour DAPI, CFP, FITC et Cy3 le cas échéant. Comme démontré ici, les KIFB de type sauvage exprimés de manière exogène sont apparus de manière homogène dans le cytoplasme, tandis que c-MYC est apparu principalement dans le noyau. Le mutant KIF5B sans moteur, cependant, a formé des agrégats dans le cytoplasme, ce qui a conduit à l’agrégation de c-MYC.

De plus, le KIF5B sans moteur a également induit l’agrégation du c-MYC endogène et du facteur de transcription p53, indiquant que c-MYC et p53 sont tous deux les cargaisons de kinésine-1 et que KIF5B régule la localisation subcellulaire des deux protéines endogènes. Cette figure illustre que le mouvement des facteurs de transcription par KIF5B semble être spécifique car l’expression du mutant KIF5B sans moteur n’a pas affecté la localisation subcellulaire de c-Fos ni provoqué son agrégation. Ces données révèlent que la méthode démontrée dans cette vidéo permet l’identification à haute spécificité des cargaisons de Kinesin-1.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les kinésines conviennent le mieux aux cellules qui ont beaucoup de volume de cytoplasme afin que l’agrégation dans le cytoplasme puisse être facilement observée. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des moteurs moléculaires pour construire des mutants négatifs dominants similaires d’autres kinésines et myosines afin d’identifier leurs cargaisons particulières. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le mutant négatif dominant d’un moteur moléculaire pour identifier cette cargaison, à l’aide de la microscopie fluorescente.

N’oubliez pas que travailler avec du phéno, du bromure d’éthidium et du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et que des précautions doivent toujours être prises pour éviter tout contact direct de la peau avec eux lors de cette procédure. Merci d’avoir regardé. Bonne chance dans votre expérience.