Name: Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Découvrez l'isolement de leucocytes infiltrant la peau de souris par digestion enzymatique et séparation sur gradient. Cette méthode économique permet d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires des pathologies cutanées.

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Le National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 à DC), l&#39;Association nationale Vulvodynia (prix à DC), et Macalester College soutenu ce travail. CB a reçu une bourse du Programme de Beckman Scholars Macalester College, financé par la Fondation Arnold et Mabel Beckman. BTF et TM sont pris en charge par la FRDJ 2-2011-662. Nous remercions le Dr Jason Schenkel et le Dr Juliana Lewis pour obtenir des conseils techniques, et tous les membres actuels et anciens du laboratoire Chatterjea pour leur aide et leur soutien.

Remarque: souris 8-12 semaine vieille femme ND4 Swiss Webster, classiquement hébergés avec un accès libre à la nourriture et de l&#39;eau, ont été utilisées pour ces études Le protocole expérimental utilisé (B13S1) a été approuvé par IACUC de Macalester College.. 1. Sensibilisation et Challenge Oxazolone <ol><li> Jour 0 <ol><li> Préparer chambre anesthésie par addition de 3 ml d&#39;isoflurane serviettes absorbantes placées sous maille au fond d&#39;un couvercle 4 bocal en verre G. Pour la souris femelles ND4 utilisé ici, le temps dans la chambre est de 30 à 60 secondes jusqu&#39;à ce que le sujet est correctement anesthésiés; optimiser l&#39;administration d&#39;anesthésiques pour la souche de souris utilisée. </li><li> Rasez le dos de chaque souris anesthésiée et le flanc en utilisant une tondeuse pour poils d&#39;animaux. </li></ol></li><li> Jour 1 <ol><li> Ajouter une solution à 2% de 4-éthoxyméthylène-2-phényl-2-oxazoline-5-one (Ox) dans de l&#39;éthanol absolu, et incuber à 50 ° C pendant 15 min sur une plaque en rotation dans un incubateur. </li><li> Anesthésier brefsouris en utilisant l&#39;isoflurane comme décrit dans 1.1.1 et applique 100 pi de 2% Ox au dos rasé dans plusieurs applications en série d&#39;environ 20 pi de chacun. Attendez 5-10 secondes entre les applications de série pour la solution à sécher. </li><li> Prenez soin d&#39;éviter de renverser la solution à 2% Ox sur les régions autres que l&#39;arrière, et d&#39;attendre que la solution à sécher entre les applications. </li></ol></li><li> 5-7 jours <ol><li> Préparer une solution à 1% de (Ox) dans de l&#39;éthanol absolu, et incuber à 50 ° C pendant 15 min sur une plaque en rotation dans un incubateur. </li><li> Doucement mais immobiliser fermement la souris à la peau du cou et de la queue base avec l&#39;abdomen vers le haut et le cou légèrement incliné vers le bas (semblable à une attente pour une injection intrapéritonéale) et appliquer 100 pi de 1% Ox au flanc rasé dans plusieurs applications en série et prendre le temps de sécher la peau après que décrit ci-dessus. </li><li> Pour les souris de contrôle, applique 100 pl de véhicule de l&#39;éthanol absolu pour le flan raséek. </li></ol></li></ol> 2. Flanc peau récolte <ol><li> Euthanasier la souris en utilisant du dioxyde de carbone par inhalation, et exciser soigneusement la zone souhaitée de la peau du flanc (~ 25 mm x 25 mm de la peau) avec 10 cm ciseaux chirurgicaux. </li><li> En utilisant une lame chirurgicale propre, nette, gratter l&#39;excès de graisse et du tissu conjonctif de la peau de flanc. </li><li> Placer 3 morceaux de peau de flanc de 3 souris dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de HBSS RT [avec rouge de phénol, sans calcium ou magnésium, 5 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 10 mM, 4- (2-hydroxyéthyl) -1- piperazineethanesulfonic acide (HEPES), et 10% de sérum bovin fœtal (FBS)]. </li></ol> Laver des tissus 3. Pré-digestion <ol><li> Placer le tube contenant des fragments de peau sur un plateau tournant pendant 30 min dans un incubateur sec non gazé maintenu à 37 ° C. </li><li> Vortex vigoureusement pendant 10 s à la fin de la période d&#39;incubation. </li><li> Filtrer le contenu du tube à travers une 70 umFiltre à jeter le tampon de lavage et de recueillir le tissu. Un seul filtre peut être réutilisé tout au long de la procédure entière dans un groupe de traitement biologique. </li><li> En utilisant une paire de pinces, transférer la peau du flanc de la crépine dans un nouveau 50 ml tube conique contenant 10 ml de frais, RT HBSS médias (contenant de l&#39;EDTA, HEPES, et FBS comme décrit ci-dessus). </li><li> Avec une participation de 12,5 cm paire de ciseaux chirurgicaux de dissection immergés dans le tube, émincer chaque morceau de peau de flanc de sorte que le moyen à la pièce de tissu est d&#39;environ 2,2 mm x 2,2 mm dans la zone. </li><li> Placer le tube contenant des fragments de peau sur un plateau tournant pendant 30 min dans un incubateur sec non gazé maintenu à 37 ° C. </li><li> Vortex vigoureusement pendant 10 s à la fin de l&#39;incubation, </li></ol> 4. digestion à la collagénase de la peau <ol><li> Filtrer le contenu du tube à travers une passoire 70 um, de collecter et de transférer les morceaux de peau de flanc dans un nouveau 50 ml tube conique contenant 10 ml fresh, RT HBSS médias complété avec 0,7 mg / ml collagénase D. </li><li> Placer le tube contenant du milieu de digestion et de fragments de peau sur un plateau tournant pendant 30 min dans un incubateur sec non gazé maintenu à 37 ° C. </li><li> Vortex contenu des tubes vigoureusement pendant 10 s à la fin de l&#39;incubation. </li><li> Filtrer le contenu de tube à travers une passoire 70 um dans un nouveau 50 ml tube conique; garder l&#39;écoulement contenant le tissu digéré et jeter le filtre et le flanc débris de peau. </li><li> Laver la accréditives dans 50 ml de milieu HBSS, centrifugeuse pendant 5 min à 350 g, et décanter le surnageant. </li></ol> 5. Densité centrifugation en gradient <ol><li> En utilisant une pipette sérologique, ajouter 3 ml de 67% RT gradient de densité de support de centrifugation dans une solution saline tamponnée phosphate 1X (PBS) dans un nouveau tube conique de 15 ml pour chaque échantillon. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de 44% RT densité milieux de centrifugation en gradient dans du HBSS avec du rouge de phénol. </li><li> Gentlemanly couche 5 ml de gradient de densité de support de centrifugation 44% contenant les cellules sur le dessus de la centrifugation en gradient de densité de médias échantillon de 67% en utilisant une pipette sérologique. Veillez à régler la pipette à la vitesse la plus lente, et placez la pipette le long de la paroi du tube conique. Soyez prudent de ne pas secouer, perturber ou inverser le dégradé. </li><li> Réglez l&#39;accélération à la position la plus basse, desserrer le frein, et centrifuger le gradient à 931 g pendant 20 min à température ambiante en veillant à ce que la centrifugeuse est équilibrée. </li><li> Après centrifugation, retirer délicatement le gradient de la centrifugeuse, et transporter doucement vers la paillasse tenant le tube vertical. Utilisation d&#39;un transfert de 5 ml en plastique pipette, retirer la couche de cellules à l&#39;interface du gradient de densité médias et le transfert de centrifugation de 44% et 67% à un nouveau tube de 15 ml conique. Si l&#39;interface est pas visible, il suffit de retirer environ 2 ml de liquide à 67% -44% frontière. </li><li> Remplir le tube conique contenant des cellules de la porcelainerface avec 2% de FBS dans 1X PBS glacé, des cellules de centrifugation pendant 5 min à 350 x g, et décanter le surnageant. Note: Ceci est la première fois que les cellules peuvent être refroidis / conservés au froid depuis étapes de la digestion sont à 37 ° C et les étapes de médias gradient de densité de centrifugation sont à la température ambiante. Les cellules peuvent être remises en suspension dans un rapport 1: 1 Trypan dilution bleu et comtes et des informations sur la viabilité peut être obtenue à ce stade. </li></ol> 6. Blocage et coloration pour l&#39;analyse par cytométrie en flux <ol><li> Bloquer FcyRII / récepteurs III sur les cellules pour éviter les taches d&#39;anticorps non spécifique. Pour les expériences décrites ici, faire des maîtres d&#39;anticorps mélanges dans du PBS avec 2% de FBS contenant dilution 1: 100 d&#39;anticorps non conjugué contre le CD16 / 32 (2.4G2) pour lier et bloquer FcyRII / III récepteurs. </li><li> Incuber les cellules bloqués avec des mélanges maîtres appropriées d&#39;anticorps contre CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (de 53 à 6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), et Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), ainsi que Brilliant Violet 510 en direct tache / morts pour identifier les cellules mortes. Utilisez tous les anticorps soit à la dilution recommandée par les fabricants ou préalablement optimisé par des chercheurs. Pour les expériences décrites ici, utiliser tous les anticorps au 1: 100 dilution. </li><li> Laver les cellules et remettre en suspension dans 50 ul de tampon de coloration avec du PBS 1X 2% de FBS. Garder sur la glace jusqu&#39;à ce que les données de fluorescence peuvent être acquis sur un cytomètre de flux. Remarque: Il est important d&#39;avoir des paramètres de compensation pré-optimisés avec un tissu lymphoïde et un antigène de surface de cellule commune (comme CD4 ou CD8) avant l&#39;acquisition des données de fluorescence. </li><li> Pour augmenter le nombre de cellules pour analyse par cytométrie en flux en aval, acquérir des données à partir d&#39;échantillons entières de cellules colorées. </li></ol> 7. Analyser cytométrie en flux de données utilisant des méthodes standard pour accomplir les étapes ci-dessous <ol><li> Premièrement, porte sur la région de lymphocytes de la diffusion vers l&#39;avant(région) par diffusion latérale (région) intrigue. </li><li> Ensuite, sélectionnez les cellules simples en utilisant la dispersion vers l&#39;avant (largeur) par diffusion latérale (largeur), pour éviter d&#39;analyser doublets. Cela peut également être réalisé avec une hauteur de diffusion vers l&#39;avant par parcelle de la hauteur de la dispersion latérale. </li><li> Ensuite, porte sur la filiation (CD11b, CD11c, et CD45R / B220) séronégatifs et CD3 positive des événements, d&#39;exclure les macrophages, les cellules des cellules dendritiques, et B, respectivement, et confine analyses pour le compartiment des cellules T, si l&#39;objectif est, comme ici, pour évaluer l&#39;infiltration des lymphocytes T. </li><li> Ensuite, porte sur des cellules vivantes qui excluent la tache en direct / morts. </li><li> Enfin, porte sur la population de cellules d&#39;intérêt (voir la section des résultats représentatifs). </li></ol>

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Les auteurs ont aucun intérêt financier ou autre à divulguer.

La caractérisation des changements dans les leucocytes de la peau résident dans des modèles de rongeurs de maladies de peau telles que la dermatite atopique ou le psoriasis est important pour la compréhension de connexions mécaniques entre les afflux de cellules inflammatoires et la pathologie de la maladie. Nous décrivons ici une technique économique pour isoler des leucocytes à partir du tissu de la peau avec l&#39;équipement de base dans la plupart des laboratoires de recherche biomédicale. Cette technique relativeme...

Affections de la peau allant de la dermatite de contact, l&#39;eczéma, le psoriasis, la cellulite, les infections fongiques et les abcès à des cancers de la peau non-mélanome ont été trouvés à être parmi les 50 maladies les plus répandues dans le monde, et la quatrième cause mondiale des maladies non mortelles en 2010 1. En conséquence, l&#39;étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents pathologies cutanées diverses est une zone nécessaire et actif de la recherche. Des modèles de rongeurs ont été remarquablement utiles pour la compréhension des maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique 2, 3 psoriasis, l&#39;infection ou 4 Staphylococcus aureus. Protocoles peu coûteux, efficaces et simples pour la digestion enzymatique de tissu de la peau de la souris peuvent fournir des préparations de cellules qui peuvent être utilisés pour une variété d&#39;applications en aval afin de mieux comprendre la physiopathologie de maladies de la peau. Ici, une méthode simple et économique est décrit par digestion enzymatique de la peau de souriset l&#39;isolement des tissus cutanés leucocytes infiltrants qui peut être utilisé pour la culture cellulaire, le transfert adoptif in vivo, une analyse par cytométrie de flux et triage ou des études d&#39;expression génique. L&#39;objectif global de cette procédure est de préparer une suspension cellulaire unique de leucocytes infiltrant la peau avec la viabilité cellulaire élevée tout en minimisant les coûts généralement associés à des kits de réactifs personnalisé et dissociateurs mécaniques. Existants tissu cutané méthodes de dissociation 5-7 peuvent donner lieu à l&#39;intégrité du marqueur bas de la viabilité des cellules et de la surface, ou exiger des kits d&#39;enzymes de mesure et des machines coûteuses de dissociation des tissus 8-11. Alors que la digestion des tissus de la peau de l&#39;oreille de la souris est raisonnablement répandue 12-13, digérant tissu très kératinisée de la peau (par exemple, sur le flanc) peut entraîner des préparations de cellules contaminées avec de grandes quantités de débris non-cellulaire. Dans une étude récente, Zaid et collègues digérés peau du flanc de la souris pendant 90 min dans 2,5 mg / ml dispase, Follomené par 45 min dans 3 mg / ml de collagénase 7. Dans une autre étude, ces chercheurs ont utilisé plusieurs incubations avec une digestion totale de 2,5 h, y compris l&#39;utilisation de trypsine / EDTA, la collagénase III, la dispase et 5. L&#39;utilisation de la trypsine est déconseillé pour la digestion enzymatique de la peau, comme a été montré traitement à la trypsine provenant de différents fabricants pour affecter de manière mesurable l&#39;intégrité des protéines de surface cellulaire sur des cellules de mammifère 14-15. En outre, la dispase peut avoir des effets importants sur la capacité de prolifération des cellules CD4 et CD8a T et affecter l&#39;abondance de surface d&#39;au moins 20 molécules, y compris les marqueurs d&#39;activation des cellules T commun tels que CD62L 16. D&#39;autres protocoles utilisent RPMI 1640 dans le milieu de digestion 6. Cependant, la présence de Mg2 + et Ca2 + dans du RPMI peut provoquer une agrégation de cellules 17 étendue. Un protocole idéal pour la dissociation des tissus devrait viser pour la viabilité cellulaire élevée, faibleniveaux d&#39;agrégation cellulaire, et un minimum de dommages à la cellule des protéines de surface. Préparations de cellules ganglionnaires du stroma de haute qualité ont été réalisés avec des protocoles qui utilisent plus courtes incubations enzymatiques, Ca 2+ et Mg 2+ médias libres, et d&#39;éviter la trypsine et dispase 18. Cependant, les protocoles de ce type ont pas été établies pour la dissociation de la peau entière de la souris. Ici, un protocole est décrit à dissocier, isoler, et d&#39;enrichir les leucocytes infiltrant la peau de la peau du flanc de la souris allergène en cause. Brièvement, peau excisée est pré-incubées dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du sérum fœtal bovin de 10% pendant 1 heure pour adoucir le tissu pour la digestion et éliminer tout excès de tissus morts peau ou gras. Ceci est suivi par une étape de digestion enzymatique de 30 min avec 0,7 mg / ml de collagénase D. collagénase D a des effets minimaux sur la densité de marqueurs de surface cellulaire, et aucun effet sur ​​la prolifération des cellules T in vitro 16,18, ce qui rendtrès convenable pour des applications impliquant la caractérisation des protéines de surface. Après digestion enzymatique, discontinue centrifugation en gradient de densité a été utilisé pour éliminer les cellules epitheliales et les débris de la suspension à cellule unique et un enrichissement en cellules hématopoïétiques. Surtout, cette procédure évite des coûteuses cellulaires magnétique réactifs de séparation à base de colonnes et machines de dissociation des tissus 8-11, et peut être réalisé avec l&#39;équipement et de matériaux trouvés dans un laboratoire de recherche biomédicale fondamentale. Ici, ce protocole a été utilisé pour isoler les leucocytes à partir de la peau du flanc contestées trois fois avec de l&#39;oxazolone haptène (Ox) chez des souris suisses précédemment sensibilisées ND4 (adapté à partir de 19). Les cellules ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux multi-paramétrique. Cette technique a donné une suspension de cellules avec un minimum de débris et&gt; 95% de viabilité des lymphocytes isolés qui ont été analysés par écoulement multi-paramétrique cytométrie de mesurer l&#39;infiltration de lymphocytes T et des neutrophiles dans le sk affectéedans.

<table><tbody><tr><td>HBSS au rouge de phénol, sans calcium, sans magnésium, liquide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Conserver stérile jusqu’au jour de l’utilisation.</td></tr><tr><td>HEPES, &ge ; 99,5 % (titrage)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA solution de sel disodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Conserver stérile jusqu’au jour de l’utilisation.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, USDA, Inactivé par la chaleur, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Conserver stérile jusqu’au jour de l’utilisation.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8,5-9,5 (25&deg ; C)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Conserver stérile. Percoll doit être rendu isotonique avec du PBS 10X stérile avant utilisation.</td></tr><tr><td>Kit combo de tondeuse</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&nbsp ;</td><td>Utilisez la plus grande tondeuse pour raser le flanc et le dos.</td></tr><tr><td>4-éthoxyméthylène-2-phényl-2-oxazoline-5-one</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>Dissoudre dans 100 % EtOH à 50&deg ; C pendant 15 minutes sur une plaque tournante.</td></tr><tr><td>Purifié anti-souris CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Anticorps utilisé pour bloquer la liaison d’anticorps non spécifiques lors de la coloration d’anticorps pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon ;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour l’écoulement cytométrie</td></tr><tr><td>anti-CD8&alpha ;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Anticorps utilisé pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Colorant de viabilité pour la cytométrie en flux</td></tr><tr><td>LSR Fortessa Fortton</td><td>Dickinson</td><td>N/A</td><td>Analyseur de cellules (18 paramètres)</td></tr><tr><td>Collagénase D de Clostridium histolyticumRoche</td> <td>Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Enzyme lyophilisée aliquote à 5 mg/ml dans HBSS avec du rouge de phénol, sans calcium et sans magnésium dans des aliquotes de 1 mL. Conserver immédiatement à -20&deg ; C pour une période maximale de six mois.</td></tr><tr><td>ND4 Souris femelles suisses</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 semaines ; logé de manière conventionnelle avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau et utilisé conformément aux directives IACUC du Macalester College.</td></tr></tbody></table>

isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

La dissociation de la peau murine en une suspension unicellulaire est essentielle pour l’analyse cellulaire en aval, telle que la caractérisation des cellules immunitaires infiltrantes dans des modèles de rongeurs de l’inflammation cutanée. Ici, nous décrivons un protocole pour la digestion de la peau de souris dans une solution riche en nutriments avec de la collagénase D, suivie de la séparation des cellules hématopoïétiques à l’aide d’un gradient de densité discontinu. Les cellules ainsi obtenues peuvent être utilisées pour des études in vitro, des transferts in vivo et d’autres analyses cellulaires et moléculaires en aval, y compris la cytométrie en flux. Ce protocole est une alternative efficace et économique aux dissociateurs mécaniques coûteux, aux colonnes de séparation spécialisées et aux méthodes de digestion plus sévères à base de trypsine et de dispase, qui peuvent compromettre la viabilité cellulaire ou la densité des protéines de surface pertinentes pour la caractérisation phénotypique ou la fonction cellulaire. Comme le montrent nos données représentatives, ce protocole a produit des cellules hautement viables, contenait des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires et n’a eu aucun effet sur l’intégrité des protéines marqueurs de surface courantes utilisées dans l’analyse cytométrique en flux.

La collagénase D splénocytes traités présentent des niveaux similaires de CD4 et CD8 α sur les cellules T par rapport aux témoins traités médias Tout d&#39;abord, les effets potentiels de la collagénase D sur la fréquence et la surface de la lignée et l&#39;abondance des marqueurs d&#39;activation sur des sous-ensembles de cellules T ont été évalués en utilisant le tissu lymphoïde secondaire en tant que témoin. Une suspension de s...

Ce protocole décrit la digestion enzymatique de la peau de souris dans un milieu riche en nutriments, suivie d’une séparation par gradient pour isoler les leucocytes. Les cellules ainsi dérivées peuvent être utilisées pour diverses applications en aval. Il s’agit d’une alternative efficace, économique et améliorée aux machines de dissociation des tissus et aux protocoles de digestion tissulaire basés sur la trypsine et la dispase.

Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les leucocytes infiltrant la peau en utilisant la digestion enzymatique et la séparation par gradient de densité. Cette méthode peut être appliquée à l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires dans de nombreux modèles murins de pathologies cutanées, y compris la dermatite atopique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biologie des leucocytes infiltrant la peau, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres populations de cellules résidentes.En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal à prélever la peau, ce qui comprend une élimination complète de l’excès de tissus adipeux et conjonctifs. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le prélèvement de la peau et la manipulation du gradient de densité sont difficiles à apprendre et nécessitent précision et pratique. Au moment approprié après le traitement, utilisez des ciseaux chirurgicaux de 10 centimètres pour exciser soigneusement une zone de 25 x 25 millimètres de peau de flanc rasée d’une souris adulte femelle ND4 Swiss-Webster âgée de huit à douze semaines.Utilisez une lame chirurgicale propre et tranchante pour gratter l’excès de graisse et de tissu conjonctif de la peau, puis transférez la peau dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS à température ambiante complété par EDTA, HEPES et FBS, et prédigérez le tissu sur une plaque rotative pendant 30 minutes dans un récipient sec, non gazé, Incubateur à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, faites tourbillonner vigoureusement le tube pendant dix secondes et filtrez la boue tissulaire à travers une passoire de 70 microns. Ensuite, utilisez une paire de pinces pour transférer les morceaux de peau de flanc de la passoire dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant dix millilitres de milieu HBSS frais à température ambiante, complété par EDTA, HEPES et FBS, puis utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux de dissection de 12,5 centimètres pour hacher chaque morceau de peau de flanc de sorte que le morceau de tissu moyen mesure environ 2,2 par 2,2 millimètres.Lorsque tous les morceaux ont été hachés, remettez le tube dans la plaque rotative pour une autre incubation de 30 minutes. Agitez vigoureusement le tube pendant 10 secondes à la fin de l’incubation et filtrez le contenu à travers la passoire de 70 microns. Récupérez les morceaux de peau de flanc restants dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS complétés par 0,7 milligramme par millilitre de collagénase D, et remettez le tube dans la plaque rotative pour une autre incubation de 30 minutes.Après encore 10 secondes de vortex, filtrez à nouveau le contenu du tube, cette fois en jetant les débris sur la passoire, puis remplissez le tube avec jusqu’à 50 millilitres de HBSS, EDTA, HEPES, FBS, faites tourner les cellules et décantez le surnageant. Ajoutez trois millilitres de milieu de centrifugation à gradient de densité de 67 % à température ambiante dans du PBS dans un nouveau tube conique de 15 millilitres, et remettez en suspension la pastille de cellule dans cinq millilitres de milieu de centrifugation à gradient de densité de 44 % à température ambiante dans HBSS avec du rouge de phénol. En réglant la pipette à la vitesse la plus basse, placez la pipette sur le côté du tube et superposez doucement les cellules sur le milieu de centrifugation à gradient de densité de 67 %.Lorsque vous utilisez des gradients de densité, veillez à ne pas créer de bulles et à minimiser les perturbations de l’interface de gradient. Ensuite, séparez les cellules à l’aide d’une pipette de transfert de cinq millilitres pour collecter les cellules à l’interface à la fin de la centrifugation. Comme la superposition douce du gradient et l’extraction soigneuse de l’interface des gradients sont des étapes critiques, il est sage de pratiquer la stratification du milieu de centrifugation par gradient de densité et l’élimination de l’interface avec la suspension de splénocytes murins avant de tenter la procédure avec les cellules expérimentales d’intérêt.Enfin, lavez les cellules collectées dans du PBS glacé complété par du FBS dans un tube conique de 15 millilitres et comptez le nombre de cellules viables par exclusion du bleu trypan. L’expression de surface des CD4 et CD8-alpha n’est pas affectée par la digestion de la collagénase D, car le même nombre de cellules CD4 positives et CD8-alpha positives est détecté avec ou sans digestion enzymatique. De plus, la digestion de la collagénase D ne montre aucun effet sur la densité de surface des marqueurs d’activation des lymphocytes T CD44 et CD62L sur les lymphocytes T CD4 positifs.Après séparation du gradient, environ 250 cellules immunitaires viables par millimètre carré de tissu latéral sont isolées à partir d’Oxazolone, ou souris propulsées par Ox, contre seulement quatre cellules immunitaires viables par millimètre carré de tissu chez les souris propulsées par véhicule, précédemment sensibilisées avec Ox.95 pour cent des cellules simples à faible diffusion avant et latérale chez les souris provocées par Ox, et 71 pour cent de ces cellules chez les témoins défiés par Ox sont des cellules CD45 positives vivantes, équivalent à une augmentation d’environ 67 fois de la population de cellules immunitaires CD45 positives infiltrantes dans la peau du flanc après trois provocations quotidiennes par Ox. En effet, la provocation Ox entraîne l’infiltration prononcée de lymphocytes T et de neutrophiles dans la peau du flanc, avec 42 % des cellules CD45 vivantes positives chez les animaux traités à Ox, des neutrophiles Gr-1 positifs apparents et environ 84 % des lymphocytes T CD3 positifs exprimant CD8-alpha, ou CD4, par rapport aux animaux témoins traités à l’éthanol. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en environ trois heures si elle est exécutée correctement.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de gérer le gradient de densité avec soin. N’oubliez pas de toujours utiliser un milieu de centrifugation à gradient de densité de densité à température ambiante lors de l’exécution de cette procédure. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse cytométrique en flux, le tri cellulaire, le transfert de cellules ou la culture cellulaire in vitro peuvent être effectuées pour évaluer le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la peau.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les leucocytes infiltrant la peau à l’aide de la digestion enzymatique et de la centrifugation à gradient de densité.

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Myéloïde cellule d&#39;isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoïtes

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Découvrez l'isolement de leucocytes infiltrant la peau de souris par digestion enzymatique et séparation sur gradient. Cette méthode économique permet d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires des pathologies cutanées.

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