Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les leucocytes infiltrant la peau en utilisant la digestion enzymatique et la séparation par gradient de densité. Cette méthode peut être appliquée à l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires dans de nombreux modèles murins de pathologies cutanées, y compris la dermatite atopique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biologie des leucocytes infiltrant la peau, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres populations de cellules résidentes.

En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal à prélever la peau, ce qui comprend une élimination complète de l’excès de tissus adipeux et conjonctifs. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le prélèvement de la peau et la manipulation du gradient de densité sont difficiles à apprendre et nécessitent précision et pratique. Au moment approprié après le traitement, utilisez des ciseaux chirurgicaux de 10 centimètres pour exciser soigneusement une zone de 25 x 25 millimètres de peau de flanc rasée d’une souris adulte femelle ND4 Swiss-Webster âgée de huit à douze semaines.

Utilisez une lame chirurgicale propre et tranchante pour gratter l’excès de graisse et de tissu conjonctif de la peau, puis transférez la peau dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS à température ambiante complété par EDTA, HEPES et FBS, et prédigérez le tissu sur une plaque rotative pendant 30 minutes dans un récipient sec, non gazé, Incubateur à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, faites tourbillonner vigoureusement le tube pendant dix secondes et filtrez la boue tissulaire à travers une passoire de 70 microns. Ensuite, utilisez une paire de pinces pour transférer les morceaux de peau de flanc de la passoire dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant dix millilitres de milieu HBSS frais à température ambiante, complété par EDTA, HEPES et FBS, puis utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux de dissection de 12,5 centimètres pour hacher chaque morceau de peau de flanc de sorte que le morceau de tissu moyen mesure environ 2,2 par 2,2 millimètres.

Lorsque tous les morceaux ont été hachés, remettez le tube dans la plaque rotative pour une autre incubation de 30 minutes. Agitez vigoureusement le tube pendant 10 secondes à la fin de l’incubation et filtrez le contenu à travers la passoire de 70 microns. Récupérez les morceaux de peau de flanc restants dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de HBSS complétés par 0,7 milligramme par millilitre de collagénase D, et remettez le tube dans la plaque rotative pour une autre incubation de 30 minutes.

Après encore 10 secondes de vortex, filtrez à nouveau le contenu du tube, cette fois en jetant les débris sur la passoire, puis remplissez le tube avec jusqu’à 50 millilitres de HBSS, EDTA, HEPES, FBS, faites tourner les cellules et décantez le surnageant. Ajoutez trois millilitres de milieu de centrifugation à gradient de densité de 67 % à température ambiante dans du PBS dans un nouveau tube conique de 15 millilitres, et remettez en suspension la pastille de cellule dans cinq millilitres de milieu de centrifugation à gradient de densité de 44 % à température ambiante dans HBSS avec du rouge de phénol. En réglant la pipette à la vitesse la plus basse, placez la pipette sur le côté du tube et superposez doucement les cellules sur le milieu de centrifugation à gradient de densité de 67 %.

Lorsque vous utilisez des gradients de densité, veillez à ne pas créer de bulles et à minimiser les perturbations de l’interface de gradient. Ensuite, séparez les cellules à l’aide d’une pipette de transfert de cinq millilitres pour collecter les cellules à l’interface à la fin de la centrifugation. Comme la superposition douce du gradient et l’extraction soigneuse de l’interface des gradients sont des étapes critiques, il est sage de pratiquer la stratification du milieu de centrifugation par gradient de densité et l’élimination de l’interface avec la suspension de splénocytes murins avant de tenter la procédure avec les cellules expérimentales d’intérêt.

Enfin, lavez les cellules collectées dans du PBS glacé complété par du FBS dans un tube conique de 15 millilitres et comptez le nombre de cellules viables par exclusion du bleu trypan. L’expression de surface des CD4 et CD8-alpha n’est pas affectée par la digestion de la collagénase D, car le même nombre de cellules CD4 positives et CD8-alpha positives est détecté avec ou sans digestion enzymatique. De plus, la digestion de la collagénase D ne montre aucun effet sur la densité de surface des marqueurs d’activation des lymphocytes T CD44 et CD62L sur les lymphocytes T CD4 positifs.

Après séparation du gradient, environ 250 cellules immunitaires viables par millimètre carré de tissu latéral sont isolées à partir d’Oxazolone, ou souris propulsées par Ox, contre seulement quatre cellules immunitaires viables par millimètre carré de tissu chez les souris propulsées par véhicule, précédemment sensibilisées avec Ox.95 pour cent des cellules simples à faible diffusion avant et latérale chez les souris provocées par Ox, et 71 pour cent de ces cellules chez les témoins défiés par Ox sont des cellules CD45 positives vivantes, équivalent à une augmentation d’environ 67 fois de la population de cellules immunitaires CD45 positives infiltrantes dans la peau du flanc après trois provocations quotidiennes par Ox. En effet, la provocation Ox entraîne l’infiltration prononcée de lymphocytes T et de neutrophiles dans la peau du flanc, avec 42 % des cellules CD45 vivantes positives chez les animaux traités à Ox, des neutrophiles Gr-1 positifs apparents et environ 84 % des lymphocytes T CD3 positifs exprimant CD8-alpha, ou CD4, par rapport aux animaux témoins traités à l’éthanol. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en environ trois heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de gérer le gradient de densité avec soin. N’oubliez pas de toujours utiliser un milieu de centrifugation à gradient de densité de densité à température ambiante lors de l’exécution de cette procédure. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse cytométrique en flux, le tri cellulaire, le transfert de cellules ou la culture cellulaire in vitro peuvent être effectuées pour évaluer le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la peau.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les leucocytes infiltrant la peau à l’aide de la digestion enzymatique et de la centrifugation à gradient de densité.