Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps

L’objectif global de cette méthodologie est de fabriquer une matrice d’anticorps avec des applications dans l’analyse de cellules uniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’analyse de cellules uniques, telles que : comment pouvons-nous détecter simultanément des protéines secrètes et des protéines intracellulaires à partir d’une même cellule unique. Et comment pouvons-nous fabriquer une plate-forme de micro-réseau pour atteindre cet objectif.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est personnalisable. En variant les stratégies de structuration de l’écoulement, des tableaux de différentes dimensions peuvent être créés. À l’avance, générez le master SU-8 pour les modèles de flux de code-barres.

Les instructions sont fournies dans le protocole textuel. Cela implique de concevoir et de fabriquer un photo-masque chromé. Placer le masque sur une couche photo-résistante et appliquer des UV fournit le motif.

Pour commencer à préparer le moule à code-barres PDMS, mélangez 40 grammes de base en élastomère de silicium avec quatre grammes d’agent de durcissement, puis remuez vigoureusement pendant 10 minutes. Ensuite, dégazez la solution de prépolymère pendant 20 minutes sous vide. Ensuite, chargez la solution dans une boîte de Pétri contenant une plaquette de silicium avec le maître SU-8 du modèle de code-barres.

Versez la solution à une profondeur de 7,45 millimètres. Ensuite, dégazez le mélange dans le plat pour éliminer les bulles restantes. Suivez le dégazage en cuisant le mélange pendant une heure à 75 degrés Celsius pour durcir le PDMS.

Ensuite, en coupant avec un scalpel, retirez soigneusement le moule du code-barres. Ensuite, décollez soigneusement la plaque de la gaufrette. Ensuite, coupez les bords de la dalle pour donner la forme souhaitée au moule.

Terminez le moule à l’aide d’un poinçon de biopsie avec piston pour percer des trous d’un demi-millimètre au niveau des caractéristiques circulaires du motif qui représentent les entrées et les sorties. Après avoir soufflé la poussière d’une lame de verre recouverte de poly-L-lysine à l’aide d’une soufflette à l’azote, fixez le moule PDMS à la lame. Alignez soigneusement les bords du moule sur la glissière.

Maintenant, faites cuire l’ensemble pendant 90 minutes à 75 degrés Celsius pour renforcer la liaison entre le PDMS et la glissière. Pendant ce temps, préparez 20 morceaux de tubes flexibles en polyéthylène pour les entrées et les sorties. Sur chaque morceau de tube, fixez une goupille creuse en acier inoxydable d’un millimètre de diamètre.

Ensuite, à l’aide des broches, remplissez les longueurs d’un centimètre ou plus de poly-L-lysine. Une fois collées au verre, fixez soigneusement les goupilles aux entrées du moule. C’est l’étape la plus difficile de la préparation.

Ne précipitez pas le processus. Fixez l’autre extrémité des tubes à un réservoir d’azote à pression régulée qui se compose d’un réseau de 20 vannes à trois voies et peut gérer deux moules à la fois. À l’aide de la configuration, soufflez la solution à travers le moule à 0,5 à un PSI pendant au moins six heures.

Commencez par aspirer des solutions d’ADN monocaténaire fraîchement préparées dans BS-3 à travers les broches en acier inoxydable et dans le tube en polyéthylène. Ensuite, couplez le moule PDMS à la source d’azote et faites couler la solution à travers le moule à code-barres pendant environ 40 minutes ou jusqu’à ce que tous les canaux soient remplis. Ensuite, arrêtez l’écoulement et laissez le moule incuber à température ambiante pendant deux heures.

Après quelques heures, faites cuire le moule à code-barres à 75 degrés Celsius pendant une heure. Une fois cuit, détachez le moule de la diapositive et lavez délicatement la lame avec 01 %SDS. Ensuite, lavez la lame trois fois avec de l’eau ultra-pure.

Suivez les lavages en séchant la glissière du code-barres à l’aide d’une essoreuse à glissière. Une fois sèche, rangez la glissière du code-barres dans un tube propre de 50 millilitres. Pour continuer, suivez le protocole de texte pour valider le motif unidimensionnel.

Pour effectuer la procédure de validation, bloquez la lame, hybridez-y trois ADN complémentaires de cyanine et mesurez les résultats. Le maître SU-8 pour un réseau trois par trois a un modèle d’écoulement perpendiculaire à celui de la première conception. Utilisez la méthode décrite précédemment pour créer un nouveau moule PDMS de ce motif.

Pour commencer, faites de nouvelles concentrations de travail des neuf oligonucléotides. Maintenant, versez une solution de blocage BSA à trois pour cent dans les 20 canaux de la lame du réseau pendant une heure à 0,5 à un PSI. Ensuite, chargez les solutions d’ADN dans leurs canaux respectifs.

Après les avoir coulés pendant environ 40 minutes, incubez la lame à température ambiante pendant deux heures pour permettre à l’ADN de s’hybrider. Ensuite, versez trois pour cent de solution de blocage BSA dans les 20 canaux pendant une heure. Cela supprimera l’ADN non hybridé.

Maintenant, décollez la lame du réseau du PDMS et trempez-la une fois dans trois pour cent de BSA. Ensuite, plongez la diapositive dans PBS deux fois, suivie d’une baisse dans deux pour cent PBS. Ensuite, comme précédemment, séchez la lame à l’aide d’une toupie de microscope.

Pour continuer, effectuez une étape de validation similaire à la validation des diapositives unidimensionnelles. Utilisez des oligonucléotides un-prime à neuf-prime, tous conjugués à la cyanine trois. Conservez la lame de réseau trois par trois dans un tube à centrifuger de 50 millilitres pour une utilisation ultérieure.

Le protocole textuel explique en outre comment convertir la matrice d’ADN en une matrice d’anticorps. Après avoir préparé et purifié les conjugués anticorps-oligo-éléments, préparez un autre moule PDMS avec des micro-chambres. Voir le texte pour plus de détails.

Accouplez ce moule avec la glissière du réseau. Maintenant, bloquez la lame avec un pour cent de BSA et incubez-la pendant une heure à température ambiante. Pendant l’incubation, préparez 200 microlitres de conjugués anticorps-oligonucléotides.

Après le bloc, ajoutez le cocktail anticorps-oligo à la configuration. Laissez les anticorps incuber sur la matrice pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis nettoyez et séchez la lame avant de procéder aux trempages de lames décrits dans le protocole de texte. Après avoir suivi le protocole décrit, à l’aide d’une matrice trois par trois, le panel d’anticorps résultant a été utilisé dans la détection multiplexe, principalement via une plate-forme ELISA sandwich.

Les protéines ont montré moins de 10 % de variation d’une extrémité à l’autre de la lame de verre. Sur la puce trois par trois, jusqu’à sept protéines peuvent être détectées avec une référence marquée par la cyanine trois et un contrôle négatif. Dans une expérience sur cellule unique réalisée pour une étude de tumeur, les six protéines ont toutes été détectées simultanément.

Pour l’étalonnage, des protéines recombinantes ont été appliquées à un réseau à différentes concentrations. La sensibilité de détection était assez similaire à celle d’un ELISA sandwich classique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les moisissures PDMS exemptes de particules.

La poussière dans les canaux peut entraîner des réseaux avec une faible uniformité et une faible sensibilité. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer la signalisation cellule-cellule à l’aide de modèles de micro-environnements tumoraux.