Name: Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Découvrez la fabrication de puces à anticorps personnalisables pour l'analyse de cellules uniques. Cette méthode permet la détection simultanée de protéines sécrétées et intracellulaires, améliorant ainsi la recherche sur les biomarqueurs.

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Les auteurs tiennent à remercier le fonds de démarrage de SUNY Albany et l’accès aux installations du Centre de recherche sur le cancer de l’Université d’Albany.

<ol><li>Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoproteomic+profiling+with+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Oncoproteomic profiling with antibody microarrays.</a> Genome Med. 1 (7), (2009).</li>
<li>Angenendt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+protein+and+antibody+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Progress in protein and antibody microarray technology.</a> Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).</li>
<li>Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microarray+technologies+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microarray technologies for proteomics.</a> Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).</li>
<li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+barcode+chips+for+rapid%2C+multiplexed+analysis+of+proteins+in+microliter+quantities+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+for+monitoring+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies for monitoring immune systems.</a> Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%28%2B%29+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+delivery+of+cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+for+antisense+inhibition+of+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol-Uk%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria.</a> Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+cell-cell+interaction+functions+with+applications+to+glioblastoma+multiforme+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells.</a> Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).</li>
<li>Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cellular+architectures+are+predicted+through+the+characterization+of+two-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+the+simultaneous+quantitation+of+metabolites+and+proteins+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells.</a> J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).</li>
<li>Shi, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Vermesh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density%2C+multiplexed+patterning+of+cells+at+single-cell+resolution+for+tissue+engineering+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications.</a> Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+single-cell+functional+proteomics+for+fundamental+and+applied+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications.</a> Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).</li>
<li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-encoded+antibody+libraries%3A+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+protein-protein+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">General protein-protein cross-linking.</a> Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).</li>
<li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density%2C+microfluidics-based+DNA+microarrays%2C+with+applications+to+single+cell%2C+multiplex+assays+of+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à divulguer.

Conception de modèle de Flow est la première étape critique dans la fabrication de la puce 2-D. Pour générer deux motifs d&#39;ADN qui se chevauchent sur ​​un substrat en verre, les caractéristiques de canal de la première conception doivent être perpendiculaires à celles de la seconde (figure 1A-B). Les dessins considèrent également les applications en aval de la puce. Dans le cas de l&#39;analyse d&#39;une seule cellule, la puce à ADN est utilisée pour détecter des protéines provenant de cell...

Biopuces d&#39;anticorps ont été largement utilisés dans les études protéomiques pour les décennies à examiner la présence de protéines ciblées, y compris des biomarqueurs protéiques 1-3. Bien que ce domaine est actuellement confronté à de grands défis d&#39;autres technologies à haut débit telles que la spectrométrie de masse (MS), il ya encore beaucoup de place pour l&#39;utilitaire de puces à anticorps, principalement parce que ces appareils offrent l&#39;interprétation des données interface simple et facile avec les autres tests. Au cours des dernières années, l&#39;intégration de puces dans des échafaudages de puces a fourni la puce anticorps une nouvelle opportunité de prospérer 4-7. Par exemple, la puce de code à barres intégré dans une puce à cellule unique a été utilisé dans des études de communication cellulaire 8,9. Cette technologie présente des avantages distinctifs par rapport aux autres technologies de microréseaux disponibles. Il dispose d&#39;éléments de tableau à 10-100 um, beaucoup plus petit que le type 150 um taille utilisée dans elemen de biopuces classiquests. La construction d&#39;éléments de réseau est obtenue en utilisant de plus petites approches systématiques structuration d&#39;écoulement, ce qui donne lieu à des puces à ADN compacts capables de détecter des protéines à cellule unique sécrétées et des protéines intracellulaires. Un autre avantage est l&#39;utilisation d&#39;une configuration simple, sans instrument. Ceci est particulièrement important, car la plupart des laboratoires et les petites entreprises peuvent ne pas être en mesure d&#39;accéder microarray installations de base. Un tel code barre, des puces à anticorps disposent améliorées dosage et le débit peuvent être utilisés pour effectuer des tests hautement multiplexés sur des cellules individuelles tout en obtenant une haute sensibilité et une spécificité comparable à celle de dosage immuno-enzymatique en sandwich classique (ELISA 8). Cette technologie a trouvé de nombreuses applications dans la détection de protéines à partir de glioblastome 11.9, les cellules T 12, et des cellules tumorales circulantes 13. Alternativement, les puces à ADN de code à barres seuls ont été utilisés dans le positionnement précis de neurones et les astrocytes pour Mimicknant l&#39;assemblage in vivo des tissus du cerveau 14. Ce protocole se concentre uniquement sur les étapes expérimentales et blocs accumulation de deux dimensions (2-D) code à barres anticorps microarray qui a des applications potentielles dans la détection de biomarqueurs dans des échantillons fluidiques et dans des cellules individuelles. La technologie est basée sur une adressable simple brin, à une dimension (1-D) puces à ADN construit en utilisant des oligonucleotides qui sont orthogonales à motifs dans l&#39;espace sur des substrats de verre. Le modèle 1-D est formé lorsque les canaux d&#39;écoulement parallèles sont utilisés dans l&#39;étape de flux de motifs, et un tel motif apparaît comme bandes discrètes visuellement similaires à 1-D Universal Product Code (UPC) des codes à barres. La construction d&#39;un 2-D (n x m) réseau d&#39;anticorps - rappelle un 2-D Quick Response (QR) code matriciel - a besoin de stratégies de mise en forme plus complexes, mais permet l&#39;immobilisation d&#39;anticorps à une densité plus élevée de 8,15. La fabricationADN nécessite deux étapes de mise en forme, avec le premier motif perpendiculaires à la seconde. Les points d&#39;intersection de ces deux modèles représentent les m éléments de la matrice n x. En sélectionnant stratégiquement les séquences d&#39;ADN simple brin (ADNsb) utilisé dans l&#39;écoulement de motifs, chaque élément dans un tableau donné se voit attribuer une adresse spécifique. Cette référence spatiale est nécessaire de distinguer entre les signaux de fluorescence sur la lame de microréseau. La matrice ADN à un brin est converti en une série d&#39;anticorps par incorporation de conjugués d&#39;ADN-anticorps complémentaires, formant une plate-forme appelée bibliothèque d&#39;anticorps codé par l&#39;ADN (DEAL 16). Ce protocole vidéo décrit les étapes clés dans la création de tableaux nxm d&#39;anticorps qui comprennent la préparation (PDMS) de moules de codes à barres, flux-structuration ADNsb dans deux orientations, préparation d&#39;un anticorps-oligonucléotides conjugués DEAL, et en convertissant le tableau 3 x 3 d&#39;ADN dans un 3x 3 anticorps tableau.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 base en élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 agent de durcissement en élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes de silicium&nbsp ;</td><td>University Wafers</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre revêtues de poly-L-lysine</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>*Commandé sur mesure auprès d’Integrated DNA Technologies, voir Tableau 2.</td></tr><tr><td>Solution mère d’adhésif poly-L-lysine Newcomer</td><td>Supply</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sulfosuccinimidyl) subérate&nbsp ; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x Saline tamponnée au phosphate, pH 7,4</td><td>Qualité Biologique</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&Auml ; kta Explorer 100 Système de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC)</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&nbsp ;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL colonne</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Capture des anticorps</td><td>divers</td><td>*</td>La <td>sélection des anticorps dépend de l’application</td></tr><tr><td>Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)</td><td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)</td><td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique anhydre</td><td>Acros</td><td>42356</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra filtre de spin 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Revêtement de centrifugation</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie avec piston (1,0 mm de diamètre)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Scribe diamant (Style 60)</td><td>SPI fournit</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>Triméthylchlorosilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

flow-modèle fabrication guidée de haute densité barcode puces à anticorps

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

microréseau d’anticorps, en tant que technologie bien développée, est actuellement concurrencé par quelques autres technologies à haut débit établies ou émergentes. Dans ce rapport, nous rénovons la technologie des microréseaux d’anticorps en utilisant une nouvelle approche de fabrication et en introduisant de nouvelles fonctionnalités. La fabrication de notre microréseau d’anticorps à haute densité est réalisée par un modèle d’écoulement orienté perpendiculairement d’ADN simple brin et une conversion ultérieure médiée par des conjugués ADN-anticorps. Ce protocole décrit les étapes critiques de la formation de l’ADN, de la production et de la purification des conjugués ADN-anticorps et de l’évaluation de la qualité de la puce fabriquée. L’uniformité et la sensibilité sont comparables à celles des puces à ADN conventionnelles, tandis que la fabrication de nos puces ne nécessite pas l’aide d’une imprimante à matrice et peut être réalisée dans la plupart des laboratoires de recherche. L’autre avantage majeur est que la taille de nos unités de micropuces est 10 fois plus petite que celle des puces imprimées, offrant la capacité unique d’analyser les protéines fonctionnelles de cellules uniques lors de l’interfaçage avec des conceptions de micropuces génériques. Cette technologie de code-barres peut être largement utilisée dans la détection de biomarqueurs, les études de signalisation cellulaire, l’ingénierie tissulaire et une variété d’applications cliniques.

Les dessins des moules PDMS (figure 1A-1B) ont été établis à l&#39;aide d&#39;un logiciel de CAO (AutoCAD). Deux conceptions montrées canaux longs pour motif d&#39;écoulement, une horizontale et une verticale. Les parties gauche et droite de chaque modèle sont symétriques; l&#39;un d&#39;eux pourrait être entrées ou sorties. Chacun des 20 canaux est sinueuse d&#39;un bout tout le chemin à l&#39;autre extrémité. Chaque dessin est imprimé sur un photomasque de chrome <stro...

Ce protocole décrit la fabrication d&#39;une grande échelle, deux dimensions ADN ou anticorps réseau multiplexé, avec des applications potentielles dans les études de signalisation cellulaire et la détection de biomarqueurs.

Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

L’objectif global de cette méthodologie est de fabriquer une matrice d’anticorps avec des applications dans l’analyse de cellules uniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’analyse de cellules uniques, telles que : comment pouvons-nous détecter simultanément des protéines secrètes et des protéines intracellulaires à partir d’une même cellule unique. Et comment pouvons-nous fabriquer une plate-forme de micro-réseau pour atteindre cet objectif.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est personnalisable. En variant les stratégies de structuration de l’écoulement, des tableaux de différentes dimensions peuvent être créés. À l’avance, générez le master SU-8 pour les modèles de flux de code-barres.Les instructions sont fournies dans le protocole textuel. Cela implique de concevoir et de fabriquer un photo-masque chromé. Placer le masque sur une couche photo-résistante et appliquer des UV fournit le motif.Pour commencer à préparer le moule à code-barres PDMS, mélangez 40 grammes de base en élastomère de silicium avec quatre grammes d’agent de durcissement, puis remuez vigoureusement pendant 10 minutes. Ensuite, dégazez la solution de prépolymère pendant 20 minutes sous vide. Ensuite, chargez la solution dans une boîte de Pétri contenant une plaquette de silicium avec le maître SU-8 du modèle de code-barres.Versez la solution à une profondeur de 7,45 millimètres. Ensuite, dégazez le mélange dans le plat pour éliminer les bulles restantes. Suivez le dégazage en cuisant le mélange pendant une heure à 75 degrés Celsius pour durcir le PDMS.Ensuite, en coupant avec un scalpel, retirez soigneusement le moule du code-barres. Ensuite, décollez soigneusement la plaque de la gaufrette. Ensuite, coupez les bords de la dalle pour donner la forme souhaitée au moule.Terminez le moule à l’aide d’un poinçon de biopsie avec piston pour percer des trous d’un demi-millimètre au niveau des caractéristiques circulaires du motif qui représentent les entrées et les sorties. Après avoir soufflé la poussière d’une lame de verre recouverte de poly-L-lysine à l’aide d’une soufflette à l’azote, fixez le moule PDMS à la lame. Alignez soigneusement les bords du moule sur la glissière.Maintenant, faites cuire l’ensemble pendant 90 minutes à 75 degrés Celsius pour renforcer la liaison entre le PDMS et la glissière. Pendant ce temps, préparez 20 morceaux de tubes flexibles en polyéthylène pour les entrées et les sorties. Sur chaque morceau de tube, fixez une goupille creuse en acier inoxydable d’un millimètre de diamètre.Ensuite, à l’aide des broches, remplissez les longueurs d’un centimètre ou plus de poly-L-lysine. Une fois collées au verre, fixez soigneusement les goupilles aux entrées du moule. C’est l’étape la plus difficile de la préparation.Ne précipitez pas le processus. Fixez l’autre extrémité des tubes à un réservoir d’azote à pression régulée qui se compose d’un réseau de 20 vannes à trois voies et peut gérer deux moules à la fois. À l’aide de la configuration, soufflez la solution à travers le moule à 0,5 à un PSI pendant au moins six heures.Commencez par aspirer des solutions d’ADN monocaténaire fraîchement préparées dans BS-3 à travers les broches en acier inoxydable et dans le tube en polyéthylène. Ensuite, couplez le moule PDMS à la source d’azote et faites couler la solution à travers le moule à code-barres pendant environ 40 minutes ou jusqu’à ce que tous les canaux soient remplis. Ensuite, arrêtez l’écoulement et laissez le moule incuber à température ambiante pendant deux heures.Après quelques heures, faites cuire le moule à code-barres à 75 degrés Celsius pendant une heure. Une fois cuit, détachez le moule de la diapositive et lavez délicatement la lame avec 01 %SDS. Ensuite, lavez la lame trois fois avec de l’eau ultra-pure.Suivez les lavages en séchant la glissière du code-barres à l’aide d’une essoreuse à glissière. Une fois sèche, rangez la glissière du code-barres dans un tube propre de 50 millilitres. Pour continuer, suivez le protocole de texte pour valider le motif unidimensionnel.Pour effectuer la procédure de validation, bloquez la lame, hybridez-y trois ADN complémentaires de cyanine et mesurez les résultats. Le maître SU-8 pour un réseau trois par trois a un modèle d’écoulement perpendiculaire à celui de la première conception. Utilisez la méthode décrite précédemment pour créer un nouveau moule PDMS de ce motif.Pour commencer, faites de nouvelles concentrations de travail des neuf oligonucléotides. Maintenant, versez une solution de blocage BSA à trois pour cent dans les 20 canaux de la lame du réseau pendant une heure à 0,5 à un PSI. Ensuite, chargez les solutions d’ADN dans leurs canaux respectifs.Après les avoir coulés pendant environ 40 minutes, incubez la lame à température ambiante pendant deux heures pour permettre à l’ADN de s’hybrider. Ensuite, versez trois pour cent de solution de blocage BSA dans les 20 canaux pendant une heure. Cela supprimera l’ADN non hybridé.Maintenant, décollez la lame du réseau du PDMS et trempez-la une fois dans trois pour cent de BSA. Ensuite, plongez la diapositive dans PBS deux fois, suivie d’une baisse dans deux pour cent PBS. Ensuite, comme précédemment, séchez la lame à l’aide d’une toupie de microscope.Pour continuer, effectuez une étape de validation similaire à la validation des diapositives unidimensionnelles. Utilisez des oligonucléotides un-prime à neuf-prime, tous conjugués à la cyanine trois. Conservez la lame de réseau trois par trois dans un tube à centrifuger de 50 millilitres pour une utilisation ultérieure.Le protocole textuel explique en outre comment convertir la matrice d’ADN en une matrice d’anticorps. Après avoir préparé et purifié les conjugués anticorps-oligo-éléments, préparez un autre moule PDMS avec des micro-chambres. Voir le texte pour plus de détails.Accouplez ce moule avec la glissière du réseau. Maintenant, bloquez la lame avec un pour cent de BSA et incubez-la pendant une heure à température ambiante. Pendant l’incubation, préparez 200 microlitres de conjugués anticorps-oligonucléotides.Après le bloc, ajoutez le cocktail anticorps-oligo à la configuration. Laissez les anticorps incuber sur la matrice pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis nettoyez et séchez la lame avant de procéder aux trempages de lames décrits dans le protocole de texte. Après avoir suivi le protocole décrit, à l’aide d’une matrice trois par trois, le panel d’anticorps résultant a été utilisé dans la détection multiplexe, principalement via une plate-forme ELISA sandwich.Les protéines ont montré moins de 10 % de variation d’une extrémité à l’autre de la lame de verre. Sur la puce trois par trois, jusqu’à sept protéines peuvent être détectées avec une référence marquée par la cyanine trois et un contrôle négatif. Dans une expérience sur cellule unique réalisée pour une étude de tumeur, les six protéines ont toutes été détectées simultanément.Pour l’étalonnage, des protéines recombinantes ont été appliquées à un réseau à différentes concentrations. La sensibilité de détection était assez similaire à celle d’un ELISA sandwich classique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder les moisissures PDMS exemptes de particules.La poussière dans les canaux peut entraîner des réseaux avec une faible uniformité et une faible sensibilité. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer la signalisation cellule-cellule à l’aide de modèles de micro-environnements tumoraux.

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Cette vidéo présente une méthode pour détecter les souches cyanobactériennes dans un échantillon environnemental à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps. Les échantillons porteurs de diverses bactéries interagissent avec les anticorps imprimés, et l’immunomarquage avec des anticorps anti-cyanobactéries marqués au fluorophore révèle la présence de souches cyanobactériennes spécifiques par fluorescence à des endroits distincts.

Technique de détection de souches cyanobactériennes à l’aide d’une puce à microréseau d’anticorps

La présence de toxines cyanobactériennes dans les réservoirs d’eau douce destinée à la consommation humaine est une préoccupation majeure pour les autorités chargées de la gestion de l’eau. Afin d’évaluer le risque de contamination de l’eau, cet article décrit un protocole de détection sur le terrain des souches de cyanobactéries dans des échantillons liquides et solides à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps.

Protocole expérimental pour la détection cyanobactéries Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip

Nous présentons ici des gouttelettes adressable microarrays (SMA), une méthode de tableau basé de gouttelettes en mesure de déterminer l’abondance absolue de protéine dans des cellules individuelles. Nous démontrent la capacité des SMA pour caractériser l’hétérogénéité dans l’expression de la tumeur suppresseur protéine p53 dans une lignée de cellules cancéreuses humaines.

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Nous présentons un protocole pour l'utilisation d'un microarray protéique construit en imprimant des antigènes grippaux sur des lames enduites de nitrocellulose pour sonder simultanément le sérum pour plusieurs isotypes d'anticorps contre plus de 250 antigènes de différentes souches virales, permettant de mesurer l'étendue des anticorps sériques entre les sous-types de virus.

Utilisation d'un microréseau d'antigène de la grippe pour mesurer l'étendue des anticorps sériques à travers les sous-types de virus

L’analyse d’images de codes à barres multiplexés a récemment amélioré la caractérisation du microenvironnement tumoral, permettant des études approfondies de la composition cellulaire, de l’état fonctionnel et des interactions cellule-cellule. Nous décrivons ici un protocole de coloration et d’imagerie utilisant le codage à barres d’anticorps conjugués oligonucléotidiques et l’imagerie cyclique, qui permet l’utilisation d’une technique d’analyse d’images de haute dimension.

Analyse d’images de codes à barres multiplexés pour l’immunoprofilage et la caractérisation de la cartographie spatiale dans l’analyse unicellulaire d’échantillons de tissus de paraffine

Découvrez la fabrication de puces à anticorps personnalisables pour l'analyse de cellules uniques. Cette méthode permet la détection simultanée de protéines sécrétées et intracellulaires, améliorant ainsi la recherche sur les biomarqueurs.

Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps

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