Name: Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Découvrez la fabrication de puces à anticorps personnalisables pour l'analyse de cellules uniques. Cette méthode permet la détection simultanée de protéines sécrétées et intracellulaires, améliorant ainsi la recherche sur les biomarqueurs.

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Les auteurs tiennent à remercier le fonds de démarrage de SUNY Albany et l’accès aux installations du Centre de recherche sur le cancer de l’Université d’Albany.

<ol><li>Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoproteomic+profiling+with+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Oncoproteomic profiling with antibody microarrays.</a> Genome Med. 1 (7), (2009).</li>
<li>Angenendt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+protein+and+antibody+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Progress in protein and antibody microarray technology.</a> Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).</li>
<li>Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microarray+technologies+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microarray technologies for proteomics.</a> Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).</li>
<li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+barcode+chips+for+rapid%2C+multiplexed+analysis+of+proteins+in+microliter+quantities+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+for+monitoring+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies for monitoring immune systems.</a> Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%28%2B%29+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+delivery+of+cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+for+antisense+inhibition+of+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol-Uk%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria.</a> Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+cell-cell+interaction+functions+with+applications+to+glioblastoma+multiforme+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells.</a> Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).</li>
<li>Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cellular+architectures+are+predicted+through+the+characterization+of+two-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+the+simultaneous+quantitation+of+metabolites+and+proteins+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells.</a> J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).</li>
<li>Shi, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Vermesh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density%2C+multiplexed+patterning+of+cells+at+single-cell+resolution+for+tissue+engineering+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications.</a> Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+single-cell+functional+proteomics+for+fundamental+and+applied+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications.</a> Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).</li>
<li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-encoded+antibody+libraries%3A+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+protein-protein+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">General protein-protein cross-linking.</a> Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).</li>
<li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density%2C+microfluidics-based+DNA+microarrays%2C+with+applications+to+single+cell%2C+multiplex+assays+of+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à divulguer.

Conception de modèle de Flow est la première étape critique dans la fabrication de la puce 2-D. Pour générer deux motifs d&#39;ADN qui se chevauchent sur ​​un substrat en verre, les caractéristiques de canal de la première conception doivent être perpendiculaires à celles de la seconde (figure 1A-B). Les dessins considèrent également les applications en aval de la puce. Dans le cas de l&#39;analyse d&#39;une seule cellule, la puce à ADN est utilisée pour détecter des protéines provenant de cell...

Biopuces d&#39;anticorps ont été largement utilisés dans les études protéomiques pour les décennies à examiner la présence de protéines ciblées, y compris des biomarqueurs protéiques 1-3. Bien que ce domaine est actuellement confronté à de grands défis d&#39;autres technologies à haut débit telles que la spectrométrie de masse (MS), il ya encore beaucoup de place pour l&#39;utilitaire de puces à anticorps, principalement parce que ces appareils offrent l&#39;interprétation des données interface simple et facile avec les autres tests. Au cours des dernières années, l&#39;intégration de puces dans des échafaudages de puces a fourni la puce anticorps une nouvelle opportunité de prospérer 4-7. Par exemple, la puce de code à barres intégré dans une puce à cellule unique a été utilisé dans des études de communication cellulaire 8,9. Cette technologie présente des avantages distinctifs par rapport aux autres technologies de microréseaux disponibles. Il dispose d&#39;éléments de tableau à 10-100 um, beaucoup plus petit que le type 150 um taille utilisée dans elemen de biopuces classiquests. La construction d&#39;éléments de réseau est obtenue en utilisant de plus petites approches systématiques structuration d&#39;écoulement, ce qui donne lieu à des puces à ADN compacts capables de détecter des protéines à cellule unique sécrétées et des protéines intracellulaires. Un autre avantage est l&#39;utilisation d&#39;une configuration simple, sans instrument. Ceci est particulièrement important, car la plupart des laboratoires et les petites entreprises peuvent ne pas être en mesure d&#39;accéder microarray installations de base. Un tel code barre, des puces à anticorps disposent améliorées dosage et le débit peuvent être utilisés pour effectuer des tests hautement multiplexés sur des cellules individuelles tout en obtenant une haute sensibilité et une spécificité comparable à celle de dosage immuno-enzymatique en sandwich classique (ELISA 8). Cette technologie a trouvé de nombreuses applications dans la détection de protéines à partir de glioblastome 11.9, les cellules T 12, et des cellules tumorales circulantes 13. Alternativement, les puces à ADN de code à barres seuls ont été utilisés dans le positionnement précis de neurones et les astrocytes pour Mimicknant l&#39;assemblage in vivo des tissus du cerveau 14. Ce protocole se concentre uniquement sur les étapes expérimentales et blocs accumulation de deux dimensions (2-D) code à barres anticorps microarray qui a des applications potentielles dans la détection de biomarqueurs dans des échantillons fluidiques et dans des cellules individuelles. La technologie est basée sur une adressable simple brin, à une dimension (1-D) puces à ADN construit en utilisant des oligonucleotides qui sont orthogonales à motifs dans l&#39;espace sur des substrats de verre. Le modèle 1-D est formé lorsque les canaux d&#39;écoulement parallèles sont utilisés dans l&#39;étape de flux de motifs, et un tel motif apparaît comme bandes discrètes visuellement similaires à 1-D Universal Product Code (UPC) des codes à barres. La construction d&#39;un 2-D (n x m) réseau d&#39;anticorps - rappelle un 2-D Quick Response (QR) code matriciel - a besoin de stratégies de mise en forme plus complexes, mais permet l&#39;immobilisation d&#39;anticorps à une densité plus élevée de 8,15. La fabricationADN nécessite deux étapes de mise en forme, avec le premier motif perpendiculaires à la seconde. Les points d&#39;intersection de ces deux modèles représentent les m éléments de la matrice n x. En sélectionnant stratégiquement les séquences d&#39;ADN simple brin (ADNsb) utilisé dans l&#39;écoulement de motifs, chaque élément dans un tableau donné se voit attribuer une adresse spécifique. Cette référence spatiale est nécessaire de distinguer entre les signaux de fluorescence sur la lame de microréseau. La matrice ADN à un brin est converti en une série d&#39;anticorps par incorporation de conjugués d&#39;ADN-anticorps complémentaires, formant une plate-forme appelée bibliothèque d&#39;anticorps codé par l&#39;ADN (DEAL 16). Ce protocole vidéo décrit les étapes clés dans la création de tableaux nxm d&#39;anticorps qui comprennent la préparation (PDMS) de moules de codes à barres, flux-structuration ADNsb dans deux orientations, préparation d&#39;un anticorps-oligonucléotides conjugués DEAL, et en convertissant le tableau 3 x 3 d&#39;ADN dans un 3x 3 anticorps tableau.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 base en élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 agent de durcissement en élastomère de silicone</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Plaquettes de silicium&nbsp ;</td><td>University Wafers</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Lames de verre revêtues de poly-L-lysine</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucléotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>*Commandé sur mesure auprès d’Integrated DNA Technologies, voir Tableau 2.</td></tr><tr><td>Solution mère d’adhésif poly-L-lysine Newcomer</td><td>Supply</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sulfosuccinimidyl) subérate&nbsp ; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x Saline tamponnée au phosphate, pH 7,4</td><td>Qualité Biologique</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&Auml ; kta Explorer 100 Système de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC)</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&nbsp ;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL colonne</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Capture des anticorps</td><td>divers</td><td>*</td>La <td>sélection des anticorps dépend de l’application</td></tr><tr><td>Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)</td><td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)</td><td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique anhydre</td><td>Acros</td><td>42356</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra filtre de spin 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Revêtement de centrifugation</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie avec piston (1,0 mm de diamètre)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Scribe diamant (Style 60)</td><td>SPI fournit</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>Triméthylchlorosilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

flow-modèle fabrication guidée de haute densité barcode puces à anticorps

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

microréseau d’anticorps, en tant que technologie bien développée, est actuellement concurrencé par quelques autres technologies à haut débit établies ou émergentes. Dans ce rapport, nous rénovons la technologie des microréseaux d’anticorps en utilisant une nouvelle approche de fabrication et en introduisant de nouvelles fonctionnalités. La fabrication de notre microréseau d’anticorps à haute densité est réalisée par un modèle d’écoulement orienté perpendiculairement d’ADN simple brin et une conversion ultérieure médiée par des conjugués ADN-anticorps. Ce protocole décrit les étapes critiques de la formation de l’ADN, de la production et de la purification des conjugués ADN-anticorps et de l’évaluation de la qualité de la puce fabriquée. L’uniformité et la sensibilité sont comparables à celles des puces à ADN conventionnelles, tandis que la fabrication de nos puces ne nécessite pas l’aide d’une imprimante à matrice et peut être réalisée dans la plupart des laboratoires de recherche. L’autre avantage majeur est que la taille de nos unités de micropuces est 10 fois plus petite que celle des puces imprimées, offrant la capacité unique d’analyser les protéines fonctionnelles de cellules uniques lors de l’interfaçage avec des conceptions de micropuces génériques. Cette technologie de code-barres peut être largement utilisée dans la détection de biomarqueurs, les études de signalisation cellulaire, l’ingénierie tissulaire et une variété d’applications cliniques.

Les dessins des moules PDMS (figure 1A-1B) ont été établis à l&#39;aide d&#39;un logiciel de CAO (AutoCAD). Deux conceptions montrées canaux longs pour motif d&#39;écoulement, une horizontale et une verticale. Les parties gauche et droite de chaque modèle sont symétriques; l&#39;un d&#39;eux pourrait être entrées ou sorties. Chacun des 20 canaux est sinueuse d&#39;un bout tout le chemin à l&#39;autre extrémité. Chaque dessin est imprimé sur un photomasque de chrome <stro...

Ce protocole décrit la fabrication d&#39;une grande échelle, deux dimensions ADN ou anticorps réseau multiplexé, avec des applications potentielles dans les études de signalisation cellulaire et la détection de biomarqueurs.

Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

L’objectif global de cette méthodologie est de fabriquer une matrice d’anticorps avec des applications dans l’analyse de cellules uniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’analyse de cellules uniques, telles que : comment pouvons-nous détecter simultanément des protéines secrètes et des protéines intracellulaires à partir d’une même cellule unique. Et comment pouvons-nous fabriquer une plate-forme de micro-réseau pour atteindre cet objectif.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est personnalisable. En variant les stratégies de structuration de l’écoulement, des tableaux de différentes dimensions peuvent être créés. À l’avance, générez le master SU-8 pour les modèles de flux de code-barres.Les instructions sont fournies dans le protocole textuel. Cela implique de concevoir et de fabriquer un photo-masque chromé. Placer le masque sur une couche photo-résistante et appliquer des UV fournit le motif.Pour commencer à préparer le moule à code-barres PDMS, mélangez 40 grammes de base en élastomère de silicium avec quatre grammes d’agent de durcissement, puis remuez vigoureusement pendant 10 minutes. Ensuite, dégazez la solution d

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Nous avons décrit une procédure pour la désagrégation du cancer colorectal (CCR) pour produire des cellules viables unique, qui sont ensuite saisies sur biopuces d'anticorps reconnaissant les antigènes de surface sur mesure (CRC DotScan micropuce). Les sous-populations de cellules lié à la puce peut être profilée par multiplexage de fluorescence à l'aide d'anticorps monoclonaux marqués avec des colorants fluorescents.

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Une description de la formation d'un micro-réseau de polymère en utilisant une technique de photopolymérisation sur la puce. La caractérisation à haut débit de surface en utilisant la microscopie à force atomique, des mesures de contact avec l'eau d'angle, rayons X et spectroscopie de photoélectrons temps de vol des ions secondaires spectrométrie de masse et un dosage de la fixation des cellules est également décrit.

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Analyse d’images de codes à barres multiplexés pour l’immunoprofilage et la caractérisation de la cartographie spatiale dans l’analyse unicellulaire d’échantillons de tissus de paraffine

Découvrez la fabrication de puces à anticorps personnalisables pour l'analyse de cellules uniques. Cette méthode permet la détection simultanée de protéines sécrétées et intracellulaires, améliorant ainsi la recherche sur les biomarqueurs.

Flow-modèle Fabrication guidée de haute densité Barcode puces à anticorps

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