Analyse quantitative de l'expression des protéines pour l'étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d'embryons

L’objectif global de ce protocole est de quantifier les niveaux de protéines in situ dans des embryons préimplantatoires de souris. Cette méthode nous permet donc d’effectuer une analyse à haut débit d’images de microscopie confocale avec une résolution de cellule unique de manière semi-automatisée. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les concentrations en protéines sur des images confocales où il y a une forte densité nucléaire et lorsque l’on veut étudier les hétérogénéités au sein de populations cellulaires.

Pour commencer, utilisez une flamme nue sur une pipette pasteur en verre pour dessiner une extrémité capillaire à l’extrémité. Frottez doucement l’extrémité la plus éloignée de la pipette contre le capillaire, pour la casser tout en créant une extrémité émoussée. Après avoir sacrifié une souris femelle enceinte le jour souhaité du développement embryonnaire, exposez les viscères abdominaux selon le protocole textuel et localisez l’utérus.

Tenez l’extrémité cervicale, coupez à travers le col de l’utérus et tirez doucement vers le haut pour étirer les deux cornes utérines. Coupez-en la graisse en prenant soin de ne pas percer la paroi utérine. Coupez au-dessus des oviductes, sous les ovaires, pour libérer tout l’utérus, et placez-le sur une boîte de Pétri.

Ensuite, couvrez l’utérus avec du PBS et séparez les deux cornes utérines en coupant l’extrémité proximale des deux côtés du col de l’utérus. Séparez ensuite chaque oviducte de l’utérus en coupant sous l’isthme qui les relie. Sous un microscope de dissection, utilisez une seringue d’un mL avec une aiguille hypodermique pour rincer les blastocystes de l’utérus et les introduire dans un milieu de manipulation, en forçant 0,5 à 1 mL de milieu à travers chaque corne à partir de l’ouverture cervicale.

Attendez jusqu’à une à deux minutes pour que les blastocystes coulent au fond de la boîte après la chasse d’eau. Localisez ensuite les blastocystes et, à l’aide de la pipette pasteure en verre contrôlée à bouche avec une extrémité capillaire, collectez les blastocystes et transférez-les dans une goutte fraîche de milieu. Après avoir rincé les blastocystes, retirez la zone pellucide en utilisant la solution acide de Tyrode pour laver brièvement les embryons.

Dès que la zone n’est plus visible, transférez les blastocystes dans le milieu de manipulation. Lavez les blastocystes dans du PBS à température ambiante et fixez-les en les transférant à 4 % de PFA dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Après la fixation, transférez les blastocystes dans du PBS pour les stocker à quatre degrés Celsius.

Après avoir effectué l’imunofluorescence conformément au protocole de texte, utilisez une pipette à bouche fine pour faire des microgouttes de PBS ou de solution de coloration nucléaire sur la surface en verre d’un plat à fond de verre de 35 mm et couvrez-les d’huile minérale. Placez les embryons dans les microgouttes et disposez-les de manière cohérente, de préférence avec l’accès à la cavité ICM parallèle à la surface du verre, puis installez la boîte sur le support de microscope. Pour effectuer l’imagerie confocale, utilisez la puissance laser la plus faible qui offre un fort rapport signal/bruit sans blanchir les fluorophores.

Ajustez le gain et le décalage pour obtenir la plage dynamique la plus large sans surexposer l’échantillon. La capture de la majeure partie ou de la totalité de la plage de niveaux de gris facilitera la détection de petites différences d’intensité entre les images. Suivez les détails supplémentaires décrits dans le protocole textuel pour imager les embryons sur tout l’axe Z.

Suivez l’interface utilisateur graphique de l’outil de segmentation MINS (Modular Interactive Nuclear Segmentation) basé sur MATLAB pour charger une image confocale ou une pile Z entière de données brutes générées par le microscope. Pour afficher le résultat de chaque étape, cliquez sur le bouton « Afficher » correspondant. Une étiquette jaune au-dessus du bouton indique l’opération en cours.

Une balise verte indique que l’opération est terminée. Évaluez le résultat de l’étape de détection avant de passer à la segmentation. S’il n’est pas satisfaisant, modifiez les paramètres de détection et réexécutez-le.

Dans le menu « Exécuter » du mode Batch, cliquez sur Ajouter des fichiers » et chargez tous les fichiers à traiter en une seule fois. Cliquez sur Démarrer l’exécution en mode batch" et laissez le temps au logiciel de traiter les fichiers. La sortie de segmentation sera enregistrée dans le même répertoire que les fichiers d’origine.

Identifiez les faux positifs tels que les vésicules apoptotiques ou d’autres éléments qui ne sont pas des noyaux intacts mais qui peuvent avoir été identifiés comme tels par MINS. Supprimez les enregistrements correspondants pour les faux positifs de starstatistics. fichier CSV.

Conservez le fichier starstatistics. csv original pour référence ultérieure et n’en modifiez qu’une copie. Si un noyau a été sur-segmenté et présenté sous la forme de deux noyaux ou plus, fusionnez les enregistrements en faisant la moyenne de leur niveau d’intensité, ou conservez l’un des enregistrements pour cette cellule et éliminez le reste.

Pour résoudre la sous-segmentation, identifiez les événements où MINS n’a pas réussi à détecter la frontière entre deux noyaux ou plus et les a segmentés en un seul, ou où il n’a pas réussi à détecter un noyau complètement. Utilisez ImageJ pour mesurer le niveau de gris moyen pour chaque canal dans les cellules inférieures ou non segmentées. Ensuite, trouvez une section médiale du noyau inférieur ou non segmenté sur le canal ADN, à l’aide de l’outil de sélection à main levée, tracez le périmètre du noyau inférieur ou non segmenté.

Ensuite, appuyez sur Ctrl M » ou allez dans le menu « Analyser » et sélectionnez Mesure"Cela enregistrera la valeur moyenne de gris pour la zone délimitée et l’affichera dans une nouvelle fenêtre. En utilisant la même zone délimitée que celle sélectionnée dans le canal d’ADN, répétez la mesure de chacun des canaux de fluorescence d’intérêt. Les résultats seront inversés sur le précédent dans la fenêtre des résultats des mesures.

Utilisez ensuite les mesures obtenues pour remplacer les enregistrements erronés dans le fichier starstatistics. csv. Si le noyau a été sous-segmenté, dupliquez sa ligne, attribuez des ID de cellule différents à chaque nouvelle cellule et introduisez les valeurs obtenues dans ImageJ sous la colonne correspondante.

Dans ce cas, les deux cellules partageront les coordonnées spatiales. Lorsque les noyaux mitotiques doivent être considérés séparément dans l’analyse, notez-les manuellement et ajoutez les informations au fichier de données. Reportez-vous au protocole texte pour obtenir des instructions supplémentaires sur le traitement des images.

Cette figure montre des exemples de blastocystes intacts à différents stades avec une cavité élargie. Voici des exemples de bons anticorps pour un certain nombre de protéines nucléaires, notamment CDX2, GATA4, GATA6, NANOG et OCT4. Cet échantillon a été marqué avec la protéine cytoplasmique DAB2 qui donne un rapport signal/bruit élevé.

Dans ce panneau, des exemples d’une mauvaise coloration pour GATA4 avec un faible rapport signal/bruit sont montrés, où les échantillons n’ont été fixés que pendant 10 minutes. Cet anticorps anti-GATA4 particulier nécessite une fixation nocturne pour fournir un signal fort. Ces embryons ont été imagés avec un objectif d’immersion dans l’huile 40x avec une NA de 1,30 et une distance de travail de 0,21 mm. Les panneaux du milieu montrent des grossissements des ICM ou des noyaux individuels et la frontière entre eux peut être distinguée.

Les panneaux inférieurs illustrent comment plus l’embryon est avancé, plus la densité nucléaire est élevée, et donc plus le risque d’erreurs de segmentation est grand. Ces images montrent des erreurs que MINS peut commettre, telles que la détection de noyaux apoptotiques en tant que cellules vivantes, une sur-segmentation ou une sous-segmentation. Cette séquence de tranches Z révèle un événement de sous-segmentation, où deux cellules ont été identifiées comme une seule.

Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en trois à quatre jours du début à la fin, avec une charge temporelle de deux à quatre heures par jour. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler d’être très cohérent avec les conditions expérimentales, c’est-à-dire les protocoles d’immunofluorescence et les paramètres d’imagerie. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement de la souris pour effectuer une analyse quantitative in situ de l’expression des gènes et des protéines dans des cellules uniques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’acquérir des données d’image appropriées pour l’analyse quantitative de l’expression in situ.