Name: Analyse quantitative de lexpression des protéines pour létude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire dembryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Découvrez l'analyse quantitative de l'expression protéique in situ dans les embryons de souris préimplantatoires. Cette méthode à haut débit utilise la microscopie confocale avec une résolution cellulaire unique pour étudier la spécification des lignées.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs tiennent à remercier Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan et Panagiotis Xenopoulos, pour leur contribution au traitement, à l’analyse et à la représentation des données, Berenika Plusa pour son aide dans la conception du protocole d’immunofluorescence et des tests d’anticorps, ainsi que les membres du laboratoire Hadjantonakis pour leurs commentaires sur le manuscrit et sur le développement de ce protocole. Les travaux de notre laboratoire sont soutenus par les National Institutes of Health R01-HD052115 et R01-DK084391, ainsi que par NYSTEM N13G-236.

<ol><li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li>
<li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+a+blastocyst%3A+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li>
<li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+get+together%3A+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2015).</li>
<li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+2D%2F3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li>
<li>Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li>
<li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li>
<li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li>
<li>Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).</li>
<li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li>
<li>Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li>
<li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li>
<li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li>
<li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li>
<li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li>
<li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li>
<li>Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li>
<li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%3A+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li>
<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
<li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%2C+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li>
<li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+RR+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).</li>
<li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial%3A+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li>
<li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1%2C+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li>
<li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le présent protocole décrit une méthode pour effectuer une analyse quantitative de l&#39;ensemble de montage immunofluorescence sur préimplantatoire des embryons de souris de la scène. Un protocole robuste d&#39;immunofluorescence 22 est suivie par haute résolution, l&#39;ensemble du montage imagerie confocale et par la segmentation d&#39;images en utilisant un morceau sur mesure de logiciels 4. Alors que le choix du protocole d&#39;immunofluorescence est pas critique, on retrouve celle présentée i...

L&#39;embryon préimplantatoire de souris est un modèle pour étudier l&#39;émergence et le maintien de la pluripotence in vivo, ainsi que d&#39;un modèle pour l&#39;étude de la spécification du destin cellulaire et de novo épithélialisation chez les mammifères. Les étapes de pré-implantation du développement des mammifères sont dédiés à la mise en place des trois lignées cellulaires qui composent le blastocyste, à savoir l&#39;épiblaste pluripotentes - qui donne lieu à la plupart des tissus somatiques et les cellules germinales - et deux lignées extra-embryonnaires, le trophectoderme (TE) et endoderme primitif (PRE) (figure 1A) 1,2. Ce protocole décrit les procédures à (1) des embryons de souris récolte et fixer stade préimplantatoire, (2) effectuer immunofluorescence pour marquer des protéines d&#39;intérêt, (3) d&#39;effectuer l&#39;ensemble du montage imagerie utilisant un microscope confocal avec des capacités et des z-sectionnement (4) effectuer la segmentation nucléaire d&#39;images confocale et analyse d&#39;image quantitative ultérieure. Ce pipeline permet til impartiales mesure des niveaux de protéines pour l&#39;attribution des identités de cellules de caractériser les sous-populations de cellules in situ. Ce protocole peut être effectuée en moins de 3 à 4 jours pour un même portée (généralement jusqu&#39;à 10 embryons de souris), de la collecte d&#39;embryons à l&#39;analyse de données (figure 1B). L&#39;analyse simultanée de plusieurs portées augmenterait l&#39;imagerie et l&#39;analyse des données charge de temps, prolongeant ainsi la longueur totale du protocole. L&#39;embryon de souris au stade préimplantatoire est un système expérimental traitable qui, compte tenu de sa petite taille et la morphologie stéréotypée 3, est bien adapté pour l&#39;imagerie de toto de processus cellulaires avec une résolution seule cellule. Pour mener à bien un impartiale, l&#39;analyse au niveau des systèmes d&#39;un nombre statistiquement pertinent d&#39;embryons, un système automatisé, d&#39;un pipeline d&#39;analyse quantitative est souhaitable. Cependant, en raison de la densité élevée nucléaire de la masse cellulaire interne (ICM) du blastocyste ( <strong&gt; Figure 1A, 2D), les plates-formes de segmentation d&#39;image conventionnels ne parviennent pas à fournir une précision suffisante pour établir un workflow automatisé ou semi-automatisé. D&#39;autre part, la segmentation manuelle, bien que corrects, ne permet pas le traitement de grandes cohortes de cellules et d&#39;embryons, ni approprié pour une détermination objective et reproductible des identités de cellules - ce qui est particulièrement important lorsque l&#39;on étudie les stades de développement, où les modes de marqueur expression n&#39;a pas entièrement résolue (par exemple, ne présentent pas une distribution binaire sur une population). Nous avons récemment développé et validé une méthode de segmentation d&#39;image adaptée aux embryons au stade de pré-implantation de la souris et des cellules de souris embryonnaires souches (CES) qui atteint une grande précision, tout en exigeant utilisateur minimale entrée 4-8. Le pipeline d&#39;analyse présentée ici tourne autour de l&#39;outil de segmentation d&#39;image basé sur MATLAB modulaire Interactive segmentation nucléaire (MIN) 4. MN performs segmentation nucléaire sans surveillance sur des lots importants de Z-piles confocale après que l&#39;utilisateur a établi un nombre minimal de propriétés de l&#39;image, en utilisant une interface utilisateur graphique (GUI) (tableau 1) 4. Ce pipeline est avéré efficace pour la génération de données à haut débit sur ​​l&#39;expression des protéines et la localisation cellulaire à la fois de type sauvage, expérimentalement traitée et les embryons et les CES 5-7 génétiquement modifié. Dans le présent protocole, nous décrivons l&#39;application de minutes pour la segmentation d&#39;images d&#39;embryon préimplantatoire stade. Pour des exemples de performances mn à CES s&#39;il vous plaît se référer à 4,7. L&#39;étape automatisée de segmentation nucléaire permet de réduire considérablement la charge de temps du processus d&#39;identification de cellule, alors que les mesures spatiales et intensité de fluorescence permettent une détermination objective des identités de cellules et la production de cartes en trois dimensions de domaines d&#39;expression génique et la position des cellules dans l&#39;embryon (figure 1C </strong&gt;). Par ailleurs, l&#39;évolutivité de ce flux de travail, il est applicable à l&#39;analyse des portées individuelles à travers de grandes cohortes d&#39;embryons expérimentalement traitées, ou des embryons de différentes origines génétiques 5,6. MN est disponible gratuitement au http://katlab-tools.org (le logiciel nécessite une licence MATLAB). Aucune approche développée à ce jour permet la génération de ces données en profondeur sur l&#39;expression des protéines et la localisation cellulaire dans des embryons de pré-implantation de la souris. Toutes les tentatives jusqu&#39;à présent à quantifier ces types de données ont été limitées à la détermination manuelle et la quantification du nombre de cellules pour différentes populations dans l&#39;embryon (soit entièrement manuellement, ou un logiciel assistée) 9-19. Cette approche (intégrant le logiciel MN) a été adapté et testé sur les embryons et les CES préimplantatoires souris; néanmoins ses performances sur d&#39;autres systèmes à forte densité nucléaire, mais encore non testé, devrait être équivalent.

<table><tbody><tr><td>Embryo collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonde émoussée pour le contrôle des bouchons</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’aspirateur pré-assemblé & embout buccal</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Tube en caoutchouc plus long</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Acide Solution de Tyrode</td><td>Millipore</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Plaques 4 puits</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td><forte>Immunofluorescence</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond en U à 96 puits</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaires</fort></td><td></td><td></td><td><fort>Concentration</fort></td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R& D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9053</td><td>1:100, 10 min fixation</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1237</td><td>1:100, fixation O/N</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:100, 10 min à fixation O/N</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires</td><td>Life Technologies</td><td>Divers</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antennes paraboliques à fond en verre de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur exécutant le système d’exploitation</td><td></td> 64 bits <td>n/a</td><td>Vérifier la configuration minimale requise chez http://katlab-tools.org et dans Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td></tr><tr><td>MATLAB (logiciel)</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS (logiciel)</td><td>Gratuit</td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

analyse quantitative de l&#39;expression des protéines pour l&#39;étude de lineage spécification dans souris préimplantatoire d&#39;embryons

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Ce protocole présente un procédé pour effectuer quantitative, unicellulaire analyse in situ de l&#39;expression de la protéine à l&#39;étude de la spécification lignée dans les embryons préimplantatoires de souris. Les procédures nécessaires à la collecte des embryons, immunofluorescence, l&#39;imagerie sur un microscope confocal, et la segmentation d&#39;images et l&#39;analyse sont décrits. Cette méthode permet la quantification de l&#39;expression de marqueurs nucléaires multiples et le spatial (XYZ) les coordonnées de toutes les cellules de l&#39;embryon. Il tire profit de MN, un outil logiciel de segmentation d&#39;image spécifiquement développé pour l&#39;analyse des images confocales d&#39;embryons préimplantatoires et les cellules souches embryonnaires (ESC) colonies. MN effectue une segmentation nucléaire non supervisé pour les directions X, Y et Z dimensions, et produit des informations de position de cellule dans l&#39;espace à trois dimensions, ainsi que les niveaux de fluorescence nucléaire pour tous les canaux d&#39;entrée minimale de l&#39;utilisateur. Bien que ce protocole a été optimisée pour l&#39;analyse des imagesde pré-implantatoire des embryons de souris de stade, il peut facilement être adapté à l&#39;analyse de tous les autres échantillons présentant un bon rapport signal sur bruit et où la densité nucléaire à haute constitue un obstacle à la segmentation d&#39;images (par exemple., analyse de l&#39;expression des cellules souches embryonnaires (ESC ) colonies, la différenciation des cellules en culture, les embryons d&#39;autres espèces ou de stades, etc.).

Pour faciliter l&#39;interprétation des données et de la présentation, il faut prendre soin de ne pas endommager les embryons lors de la collecte et de la manipulation, de sorte que toutes les cellules et leur position relative peuvent être analysés Figure 2A -. D montre des exemples de blastocystes intacts à différents stades avec une cavité élargie. En cas de dommage, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l&#39;analyse et l&#39;interprétation des ...

Ce protocole présente un procédé pour effectuer, une seule cellule dans l&#39;analyse quantitative in situ de l&#39;expression des protéines à l&#39;étude de la spécification lignée dans des embryons de pré-implantation de la souris. Les procédures nécessaires pour la collecte des blastocystes, entiers montage détection par immunofluorescence de protéines, l&#39;imagerie d&#39;échantillons sur un microscope confocal, et la segmentation nucléaire et l&#39;analyse d&#39;images sont décrites.

Analyse quantitative de l&#39;expression des protéines pour l&#39;étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d&#39;embryons

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

L’objectif global de ce protocole est de quantifier les niveaux de protéines in situ dans des embryons préimplantatoires de souris. Cette méthode nous permet donc d’effectuer une analyse à haut débit d’images de microscopie confocale avec une résolution de cellule unique de manière semi-automatisée. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les concentrations en protéines sur des images confocales où il y a une forte densité nucléaire et lorsque l’on veut étudier les hétérogénéités au sein de populations cellulaires.Pour commencer, utilisez une flamme nue sur une pipette pasteur en verre pour dessiner une extrémité capillaire à l’extrémité. Frottez doucement l’extrémité la plus éloignée de la pipette contre le capillaire, pour la casser tout en créant une extrémité émoussée. Après avoir sacrifié une souris femelle enceinte le jour souhaité du développement embryonnaire, exposez les viscères abdominaux selon le protocole textuel et localisez l’utérus.Tenez l’extrémité cervicale, coupez à travers le col de l’utérus et tirez doucement vers le haut pour étirer les deux cornes utérines. Coupez-en la graisse en prenant soin de ne pas percer la paroi utérine. Coupez au-dessus des o

quantitative-analysis-protein-expression-to-study-lineage

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous démontrons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) méthode pour identifier les interactions de facteurs au tissu-spécifique des gènes pendant ou après l'apparition de tissu-spécifique l'expression des gènes dans les tissus embryonnaires de souris. Ce protocole devrait être largement applicable pour l'étude de l'activation de gènes spécifiques de tissus comme il se produit pendant le développement embryonnaire normal.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

L’analyse de l’expression des protéines dans les jeunes valves embryonnaires de souris a été entravée par le tissu limité disponible. Ce manuscrit fournit un protocole pour la préparation de protéines à partir de régions valvulaires embryonnaires de souris en développement pour l’analyse par transfert Western.

Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve

L'objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d'acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.

Déficitaires et approche Gain de fonction d&#39;enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

L’horloge de segmentation pilote l’expression des gènes oscillatoires à travers le mésoderme pré-somitique (PSM). L’activité Dynamic Notch est la clé de ce processus. Nous utilisons l’imagerie et les analyses computationnelles pour extraire la dynamique temporelle des données d’expression spatiale afin de démontrer que l’expression du ligand Delta et du récepteur Notch oscille chez le PSM des vertébrés.

Commande temporelle des données d&#39;expression dynamique d&#39;expression spatiale détaillée Plans

Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l'imagerie simultanée en time-lapse 3D de l'embryogenèse dans 80-100 embryons d'élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d'image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l'analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l'embryogenèse.

Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d'ARNm de cellules simples pour profiler l'expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l'ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

Nous décrivons une technique de profilage des microARN chez les premiers embryons de souris. Ce protocole surmonte le défi de l’entrée de cellules faibles et de l’enrichissement de l’ARN. Ce test peut être utilisé pour analyser les changements dans l’expression miRNA au fil du temps dans différentes lignées cellulaires de l’embryon de souris précoce.

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

Nous décrivons ici une caractérisation protéomique basée sur la spectrométrie de masse de lignées cellulaires avec des destins tissulaires connus chez l’embryon vertébré Xenopus laevis .

Protéomique de spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement

Cet article établit un pipeline pour des suspensions de cellules uniques et de noyaux de haute qualité d’embryons de souris gaztrulants pour le séquençage de cellules uniques et de noyaux.

Séquençage de l’ARN unicellulaire d’embryons entiers de souris mutantes : de l’épiblaste à la fin de la gastrulation

Ce protocole fournit un pipeline de calcul rationalisé pour quantifier les transcrits d’amplificateurs naissants. En intégrant l’accessibilité de la chromatine, les caractéristiques de la chromatine et les données transcriptionnelles, il permet une détection précise et une analyse spécifique du brin de l’activité des amplificateurs dans des régions intragéniques complexes, tout en restant accessible aux chercheurs sans formation approfondie en bioinformatique.

Un pipeline informatique pour la quantification de l’ARN amplificateur intergénique/intragénique dans les cellules souches embryonnaires de souris

Découvrez l'analyse quantitative de l'expression protéique in situ dans les embryons de souris préimplantatoires. Cette méthode à haut débit utilise la microscopie confocale avec une résolution cellulaire unique pour étudier la spécification des lignées.

Analyse quantitative de l'expression des protéines pour l'étude de Lineage Spécification dans Souris préimplantatoire d'embryons

Explorer plus de vidéos