Time-Lapse Video Microscopy pour l'évaluation de EYFP-Parkin Agrégation comme un marqueur pour Cellular Mitophagy

L'objectif général de cette microscopie à vidéo en accéléré est de suivre l'élimination sélective des mitochondries endommagées par Parkine au cours du processus de mitophagie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme moléculaire, notamment comment la mitophagie influence des conditions pathologiques persistantes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue un outil très puissant pour observer la dynamique des protéines marquées durant leurs processus moléculaires.

Cette méthode peut fournir des informations sur le cycle de vie mitochondrial. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les cultures primaires de cellules, les études en embryologie et la prédiction d'une priorité. Les fibroblastes embryonnaires de souris immortalisés utilisés dans cette étude sont cultivés dans un milieu DMEM complet sur une plaque de culture tissulaire de dix centimètres, à 37 degrés Celsius, dans une atmosphère humidifiée contenant cinq pour cent de dioxyde de carbone.

Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 pour cent, éliminer le milieu par aspiration stérile et ajouter dix millilitres de PBS stérile. Retirer le PBS, puis ajouter un millilitre de trypsine-EDTA à 0,25 pour cent. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes, jusqu'au détachement des cellules.

Ajoutez quatre millilitres de milieu DMEM complet et remettez les cellules en suspension. Prélevez dix microlitres de la suspension cellulaire pour effectuer un décompte à l’aide d’un hémocytomètre. Ensemencez un million de cellules dans une boîte de culture tissulaire de dix centimètres de diamètre et incubez pendant 24 heures.

Le jour suivant, lavez les cellules une fois avec du PBS et détachez-les par trypsination, comme indiqué précédemment. Ajoutez quatre millilitres de milieu DMEM complet, resuspendez les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Faites centrifuger les cellules à 250 g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Jetez le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de PBS stérile. Faites à nouveau centrifuger les cellules. Jetez le surnageant après la deuxième centrifugation.

Ajoutez 100 microlitres du mélange de solution pour électroporation au culot cellulaire et remettez délicatement le culot en suspension par pipetage. Ajoutez ensuite à la suspension cellulaire deux microgrammes de plasmide d'expression EYFP Parkin et un microgramme de plasmide d'expression DsRed2 Mito. Utilisez une pipette Pasteur jetable pour transférer la solution dans une cuvette stérile.

Électroporer les cellules en utilisant un programme prédéfini. Immédiatement après l'électroporation, ajouter 500 microlitres de milieu DMEM complet frais, préalablement réchauffé, aux cellules et ensemencer les cellules dans une plaque de culture tissulaire de six centimètres, compatible avec l'imagerie en direct.

Incuber les cellules dans une atmosphère humide contenant cinq pour cent de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Avant de commencer cette procédure, régler la température de la chambre du microscope à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparer un milieu spécifique pour l'imagerie vivante en mélangeant les composants suivants : du DMEM sans phénol supplémenté avec dix pour cent de FBS, deux millimolaire par litre de L-glutamine, 100 unités par millilitre de pénicilline et 100 milligrammes par millilitre de streptomycine.

Préchauffez le milieu à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Éliminez le milieu des cellules électroporées par aspiration stérile et ajoutez un millilitre de milieu d’imagerie vitale préchauffé. Incubez la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Après avoir confirmé que la chambre du microscope est à une température stable de 37 degrés Celsius, introduisez un flux de cinq pour cent de dioxyde de carbone dans la chambre. Placez délicatement et sans mouvements brusques ou d'oscillations la plaque contenant les cellules électroporées dans la chambre du microscope.

À l’aide de l’interface logicielle, régler le microscope pour détecter les signaux fluorescents provenant des protéines de fusion codées par les vecteurs d’expression EYFP Parkin et DsRed2 Mito. Ouvrir le logiciel de microscopie en enregistrement temporel. Dans le menu supérieur, sélectionner FITC pour EYFP Parkin et Rhodamine pour DsRed2 Mito.

Sélectionnez un grossissement de 20X. À l’aide de l’interface logicielle, recherchez une cellule unique exprimant les deux vecteurs codélivrés et enregistrez la position. Effectuez cette opération pour un minimum de 10 cellules pour chaque condition expérimentale.

Sélectionnez le menu Applications, puis cliquez sur Acquisition multidimensionnelle. Dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle, sélectionnez les paramètres nécessaires, tels que le nombre d'acquisitions, l'intervalle de temps entre chaque acquisition et la position de la cellule enregistrée. Cliquez sur Acquérir pour démarrer l'acquisition de base des deux signaux fluorescents.

Recueillir des images toutes les cinq minutes pendant une durée totale de quinze minutes. Pendant l'acquisition des images, préparer du milieu d'imagerie vivante préalablement réchauffé contenant du carbonyl cyanure 4 trifluorométhoxy phénylhydrazone, ou FCCP, à une concentration deux fois supérieure à la concentration finale d'utilisation. Interrompre le processus d'acquisition et ajouter délicatement un millilitre du milieu d'imagerie vivante préalablement réchauffé contenant le FCCP dans la plaque située à l'intérieur de la chambre du microscope.

Après l'ajout de FCCP, il est important de recentrer le microscope avant de redémarrer l'acquisition d'images. Redémarrez le processus d'acquisition comme décrit précédemment, et collectez des images pendant une durée totale de trois heures en utilisant la position enregistrée. Une fois l'acquisition d'images terminée, enregistrez toutes les images acquises pour une analyse ultérieure.

Des images en lapse de temps des signaux fluorescents EYFP-Parkin et DsRED2-Mito dans des fibroblastes avant l'administration de FCCP sont montrées ici. Les boîtes blanches représentent les zones agrandies des panneaux respectifs situés à droite. Pendant les points temporels basaux, EYFP-Parkin, visualisé en vert, est homogènement diffusé dans toute la cellule.

Le réseau mitochondrial, visualisé en rouge, semble bien interconnecté, comme indiqué par les flèches blanches. Après l'administration de FCCP, une fragmentation mitochondriale due à la dépolarisation de la membrane est observée au bout de cinq minutes. Toutefois, EYFP-Parkin reste homogènement diffusé dans le cytoplasme.

À 55 minutes après l'administration de FCCP, EYFP-Parkin est recruté aux membranes mitochondriales endommagées afin de déclencher le processus de mitophagie. Le déplacement d'EYFP-Parkin vers la membrane mitochondriale après l'administration de FCCP est illustré dans ce film temporel représentatif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'autophagie pour étudier le recyclage mitochondrial. Elle permet aux cellules d'analyser le processus de mitophagie comme mécanisme de contrôle de qualité mitochondrial au sein des cellules.