Name: Time-Lapse Video Microscopy pour lévaluation de EYFP-Parkin Agrégation comme un marqueur pour Cellular Mitophagy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Apprenez la microscopie vidéo time-lapse pour suivre l'agrégation EYFP-Parkin dans les fibroblastes embryonnaires de souris. Cette méthode permet d'étudier la dynamique de la mitophagie et la santé mitochondriale en temps réel.

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Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 à R.G.P.), le Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), une subvention de la Breast Cancer Research Foundation, des subventions généreuses du Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) et une subvention du Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). Ce travail a été en partie soutenu par une bourse postdoctorale de l’American Italian Cancer Foundation (G.D.) et la ressource partagée en bioimagerie du Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036). Le Ministère décline expressément toute responsabilité à l’égard d’une analyse, d’une interprétation ou d’une conclusion. Il n’y a aucun conflit d’intérêts associé à ce manuscrit.

1. L&#39;électroporation de fibroblaste avec deux vecteurs d&#39;expression EYFP-Parkin et pDsRed2-Mito <ol><li> Cultiver les cellules de fibroblastes embryonnaires de souris immortalisée sur 10 cm plaque de culture tissulaire en utilisant du DMEM (le milieu de Eagle modifié par Dulbecco) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 à 37 ° C. <ol><li> À 80% de confluence des cellules, éliminer le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml d&#39; une solution tampon de phosphate de 1x stérile (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 et 1 L distillation de H 2 O, pH: 7,4). </li><li> Jeter le PBS par aspiration stérile et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA 0,25%. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules sont décollées (2 - 3 minutes). Ajouter 4 ml de milieu complet DMEM, remettre les cellules et sortir 10 _6, l de la suspension cellulaire pour le comptage hémocytomètre. NOTE: Le hémocytomètre est conçu de telle sorte que le nombre de cellules dans une série de 16 cases d&#39;angle est égal au nombre de cellules x 10 4 / ml. </li></ol></li><li> Semences 1 x 10 6 cellules sur 10 cm boîtes de culture tissulaire de 24 heures avant le processus d&#39;électroporation. </li><li> Jeter le milieu DMEM complet par aspiration stérile et ajouter 10 ml de PBS stérile. Jeter le PBS par aspiration stérile et ajouter 1 ml de trypsine-EDTA 0,25%. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules sont décollées (2 - 3 minutes). Ajouter 4 ml de milieu DMEM complet et remise en suspension des cellules dans un tube de 15 ml. </li><li> Faites tourner les cellules vers le bas à 250 xg pendant 5 min en utilisant une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C). Jeter le surnageant par aspiration stérile et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile. Faites tourner les cellules vers le bas à 250 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant par aspiration stérile, et ajouter 100 pi of solution mélange pour l&#39;électroporation (82 pi de solution d&#39;électroporation V + 18 pi de solution supplémentaire 1) au culot cellulaire et resuspendre doucement le culot par pipetage (Pour plus de détails reportez-vous au guide de l&#39;utilisateur). Ajouter 2 pg de EYFP-Parkin (excitation / émission 514/527) et 1 ug Mito-pDsRed2 (excitation / émission 565/620) à la suspension cellulaire. </li><li> Transférer la solution dans la cuvette stérile à l&#39;aide d&#39;un pasteur jetable (les deux outils sont fournis avec le kit) et l&#39;électroporation en utilisant le programme de pré-série NIH / 3T3 U-030 (impulsion unique, tension 200 V, capacité 960 uF, temps d&#39;impulsion de 20 millisecondes , nombre d&#39;impulsions: 1). </li><li> Immédiatement après l&#39;électroporation, ajouter 500 pi de milieu préchauffé frais DMEM complet et ensemencer la cellule sur un 6 cm plaque de culture tissulaire live-imagerie de qualité et de les incuber dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24 heures. </li></ol> 2. Time-Lapse Video Microscopy <ol><li&gt; Régler la température de la chambre du microscope à 37 ° C avant utilisation. </li><li> À ce stade, préparer un support d&#39;imagerie en direct spécifique de procéder au protocole expérimental. Préparer le milieu de l&#39;imagerie en direct de la manière suivante; mélanger du DMEM exempt de phénol supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 2 mmol / l de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine. Préchauffer le moyen d&#39;imagerie en temps réel à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Jeter le milieu des cellules électroporées par aspiration stérile et ajouter 1 ml de milieu préchauffé imagerie en temps réel, en utilisant une pipette P1000 et incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 ° C. </li><li> Pendant la période d&#39;incubation de la plaque, l&#39; afflux 5% de CO 2 dans la chambre du microscope déjà à une température stable de 37 ° C. </li><li> Placer la plaque avec les cellules électroporées dans la chambre du microscope évitant les mouvements ou oscillations majeures. </li><li> Utilisation de l&#39;interface du logiciel, réglez le microscope afin de détecter à la fois fluoreles signaux de Scence des protéines de fusion codées par les vecteurs cotransfectées, EYFP-Parkin (plage d&#39;excitation 495-510 nm et la plage d&#39;émission de 520-550 nm, vert) et le pDsRed2-Mito (excitation maximum de 558 nm et une émission maximale de 583 nm, rouge). <ol><li> Ouvrez le logiciel de microscopie vidéo time-lapse. Dans le menu supérieur sélectionnez le FITC pour EYFP-Parkin et rhodamine pour pDsRed2-Mito. Dans le menu supérieur sélectionnez le grossissement (20X). </li></ol></li><li> Utilisation de l&#39;interface du logiciel, recherchez la cellule unique exprimant les deux vecteurs co-transfectées et enregistrer la position. Répétez cette étape jusqu&#39;à un minimum de 10 cellules est recueilli pour chaque condition expérimentale (groupe expérimental). <ol><li> Sélectionnez le menu &quot;Applications&quot; et cliquez sur multi dimensionnelle Acquisition. Dans les fenêtres multi dimensionnelles Acquisition sélectionner les paramètres nécessaires, tels que le nombre d&#39;acquisitions, l&#39;intervalle de temps entre chaque acquisition et la position de la cellule enregistrée. Cliquez sur &quot;Acquire&quot;Pour démarrer le processus d&#39;acquisition. </li></ol></li><li> Lancer l&#39;acquisition basale des deux EYFP-Parkin et DsRed2-Mito signal fluorescent collecte des images toutes les 5 minutes pour un intervalle total de 15 min. </li><li> Préparer moyen d&#39;imagerie en temps réel préchauffée à une concentration de FCCP deux fois supérieure à la concentration finale de travail (0,1 à 10 uM, dépendant du type cellulaire). </li><li> Interrompre le processus d&#39;acquisition et ajouter doucement 1 ml de pré-chauffé support d&#39;imagerie en temps réel avec FCCP dans la plaque à l&#39;intérieur de la chambre du microscope à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000. </li><li> Redémarrer le processus d&#39;acquisition, comme décrit précédemment, pendant une durée totale de 3 heures, à l&#39;aide de la position enregistrée. Enregistrer toutes les images acquises afin de les analyser et de créer une vidéo du processus mitophagic lorsque l&#39;acquisition est terminée. </li></ol> 3. Analyse <ol><li> Collecter toutes les images acquises en format &quot;.tiff&quot; sur un ordinateur personnel </li><li> Ouvrez les images avec un chiffon doux graphiqueWare et définir l&#39;intervalle de temps se sont produites à partir de la mitochondriale induite par dépolarisation au FCCP à la première image montrant le recrutement de Parkin dans la membrane mitochondriale (Les images sont acquises toutes les 5 minutes). Répéter cette analyse pour chaque cellule dans le groupe expérimental. </li><li> Étiquette de la première cellule de la colonne sur une feuille de calcul avec le nom du groupe expérimental. Pour chaque groupe expérimental, mesurer les intervalles temporels pour Parkin recrutement d&#39;un minimum de 10 cellules. Faire une moyenne des intervalles temporels calculés pour le recrutement Parkin et de définir l&#39;écart-type pour chaque groupe expérimental (moyenne ± SD, N = 10). <ol><li> Organiser en colonnes les intervalles temporels calculés simples. Chaque colonne contient n = 10 mesures du groupe expérimental. </li><li> Sélectionnez la fonction «moyenne» dans le menu Formula Builder. Sélectionner les données contenues dans la colonne. Sélectionnez la fonction &quot;Déviation standard&quot; dans le menu Formula Builder. Select les données contenues dans la colonne. </li></ol></li><li> En utilisant une approche statistique, comparer les groupes expérimentaux appliquant la statistique appropriée afin de définir une différence significative dans la dynamique de mitophagy entre les groupes expérimentaux. (Par exemple, deux groupes = test t de Student, trois ou plusieurs groupes = ANOVA plus un test post-hoc) </li></ol>

<ol><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).</li>
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<li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+mechanisms%2C+pathophysiological+roles%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biol Chem. 393, 547-564 (2012).</li>
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<li>Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitophagy%3A+the+yin+and+yang+of+cell+death+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control.</a> Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).</li>
<li>Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+mechanisms+and+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitophagy mechanisms and role in human diseases.</a> Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).</li>
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<li>Shiba-Fukushima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-mediated+phosphorylation+of+the+Parkin+ubiquitin-like+domain+primes+mitochondrial+translocation+of+Parkin+and+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy.</a> Sci Rep. 2, 1002(2012).</li>
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<li>Jin, S. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-mediated+mitophagy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance.</a> J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Vidéomicroscopie peut être définie comme la technique qui étend l&#39;imagerie des cellules vivantes à partir d&#39;une seule observation dans le temps pour l&#39;observation de la dynamique cellulaire sur de longues périodes de temps. Cette méthodologie se distingue d&#39;un confocal simple, ou la microscopie de cellules vivantes, car elle permet à l&#39;observateur d&#39;identifier en temps réel une seule protéine fluorescente étiquetée et suivre sa dynamique à l&#39;intérieur d&#39;une seule cellule vivante. En fait,...

La macro-autophagie est un processus intracellulaire qui implique la dégradation catabolique de composants cellulaires endommagés et dysfonctionnels, tels que les organites et les protéines, dans le but de recycler ou de produire de l’énergie. Pour initier ce processus métabolique, la cellule engloutit les composants cellulaires endommagés dans une structure à double membrane, connue sous le nom d’autophagosome, qui fusionne avec un lysosome et son contenu est dégradé et recyclé 1,2. Il existe deux grands types d’autophagie, la non sélective et la sélective. Le processus d’autophagie non sélective se produit lorsque la cellule est dans des conditions de privation de nutriments et a besoin de récupérer à la fois des nutriments essentiels et de l’énergie. Cependant, l’autophagie sélective se produit pour médier l’élimination des organites dysfonctionnels / endommagés et des protéines qui pourraient autrement être toxiques. L’un des processus d’autophagie sélective les plus étudiés est l’ablation des mitochondries, appelée mitophagie 1,3-5.
Les mitochondries sont les organites centraux du métabolisme cellulaire et la principale source d’adénosine triphosphate (ATP) via la phosphorylation oxydative à travers la chaîne de transport d’électrons, l’oxydation des acides gras et le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA). De plus, les mitochondries régulent la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et libèrent des protéines qui participent aux voies de mort cellulaire 6-8.
Classe kinase putative induite par PTEN (PINK1) et l’ubiquitine ligase Parkin RBR E3 (Parkin) sont les protéines clés impliquées dans le processus de mitophagie. La parkine peut protéger contre la mort cellulaire en maintenant la cellule saine grâce au contrôle de la qualité mitochondriale9. Lors de la perte du potentiel de la membrane mitochondriale, la parkine cytosolique est recrutée dans les mitochondries par PINK1. Ce recrutement déclenche les événements séquentiels de la mitophagie 10. Il existe un large éventail de preuves que la mitophagie est un processus fondamental de contrôle de la qualité des mitochondries et que les anomalies de ce processus entraînent la maladie 7. Par exemple, la maladie de Parkinson autosomique récessive a été associée à des mutations dans les gènes codant pour Parkin et PINK1 (PARK2 et PINK1, respectivement) 11. Le contrôle de la qualité de la santé mitochondriale est essentiel pour l’élimination des mitochondries qui contribuent à l’accumulation de ROS12. Une présence excessive de ROS intracellulaires peut entraîner des dommages à la fois à l’ADN nucléaire et à l’ADN mitochondrial (ADN et ADN mt, respectivement).
Dans ce document, nous montrons une approche de microscopie vidéo en accéléré pour suivre l’agrégation de Parkine après l’induction de la mitophagie médiée par la parkine dans des fibroblastes embryonnaires de souris immortalisés via l’administration in vitro de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)-phénylhydrazone (FCCP), un agent de découplage. FCCP perturbe la synthèse de l’ATP en court-circuitant les protons à travers la membrane mitochondriale externe et en découplant ainsi la phosphorylation oxydative de la chaîne de transport d’électrons 13. Le déclenchement de la dépolarisation de la membrane mitochondriale entraîne la perturbation des mitochondries et l’élimination sélective de la Parkine dépendante. Par conséquent, la transfection des cellules d’intérêt avec un vecteur d’expression codant pour la Parkine fusionnée à un marqueur fluorescent (protéine fluorescente jaune améliorée, EYFP) peut être utilisée comme une marque fluorescente pour suivre le recrutement de Parkine au cours du processus mitophagique. Afin de visualiser les mitochondries, nous avons co-transfecté pDsRed2-Mito, qui code pour la protéine fluorescente rouge (DsRed2) qui contient une séquence de ciblage mitochondrial de la sous-unité VIII de la cytochrome c oxydase (Mito). pDsRed2-Mito est conçu pour le marquage fluorescent des mitochondries14. Le temps nécessaire à la translocation de la parkine dans la membrane mitochondriale peut être mesuré et donne une mesure indirecte de la santé cellulaire. Par exemple, nous pouvons dire que si une lignée cellulaire désactivée pour un gène d’intérêt particulier montre un recrutement plus rapide ou plus lent de Parkine après l’induction de la mitophagie par FCCP, ce produit génique serait un acteur clé afin de maintenir les taux métaboliques de la cellule à l’état physiologique et de prévenir le développement de maladies. Par conséquent, la microscopie vidéo time-lapse fournit un outil très puissant pour les applications de recherche fondamentale et clinique pour suivre la dynamique des protéines marquées au cours de leurs processus moléculaires et comprendre comment ces processus sont affectés au cours d’un état pathologique.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>10-013-CV</td><td>Préchauffage à 37 &#176 ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>DMEM sans phénol</td><td>Corning Life Science</td><td>17-205-CV</td><td>Préchauffage à 37 &#176 ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Préchauffage à 37 &#176 ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Préchauffage à 37 &#176 ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Corning Life Science</td><td>30-002-CI</td><td>Préchauffage à 37 &#176 ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Vecteur d’expression EYFP-PARKIN</td><td>Addgene</td><td>23955</td><td></td></tr><tr><td>Vecteur d’expression pDsRed2-Mito</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2B dispositif</td><td>LONZA</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector pour kit R NIH/3T3</td><td>LONZA</td><td>VCA-1001</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS AXIOVERT 200M microscope inversé</td><td>CARL ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)-phénylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MetaMorph Molecular Devices</td><td>Constructeur expérimental ImageJ</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Institut national de la santé</td><td>Constructeur</td><td></td> expérimental</tr></tbody></table>

time-lapse video microscopy pour l&#39;évaluation de eyfp-parkin agrégation comme un marqueur pour cellular mitophagy

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

La microscopie vidéo en accéléré peut être définie comme l’imagerie en temps réel de cellules vivantes. Cette technique repose sur la collecte d’images à différents points temporels. Les intervalles de temps peuvent être réglés via une interface informatique qui contrôle la caméra intégrée au microscope. Ce type de microscopie nécessite à la fois la capacité d’acquérir des événements très rapides et le signal généré par la structure cellulaire observée lors de ces événements. Une fois les images collectées, un film de l’ensemble de l’expérience est assemblé pour montrer la dynamique des événements moléculaires d’intérêt. La microscopie vidéo time-lapse a un large éventail d’applications dans le domaine de la recherche biomédicale et constitue un outil puissant et unique pour suivre la dynamique des événements cellulaires en temps réel. Grâce à cette technique, nous pouvons évaluer les événements cellulaires tels que la migration, la division, la transduction du signal, la croissance et la mort. De plus, à l’aide de sondes moléculaires fluorescentes, nous sommes en mesure de marquer des molécules spécifiques, telles que l’ADN, l’ARN ou les protéines, et de les suivre à travers leurs voies moléculaires et leurs fonctions. La vidéomicroscopie time-lapse présente de multiples avantages, le principal étant la capacité de collecter des données au niveau de la cellule unique, ce qui en fait une technologie unique pour l’investigation dans le domaine de la biologie cellulaire. Cependant, la microscopie vidéo time-lapse présente des limites qui peuvent interférer avec l’acquisition d’images de haute qualité. Les images peuvent être compromises par les deux facteurs externes ; les fluctuations de température, les vibrations, l’humidité et les facteurs internes ; pH, motilité cellulaire. Ici, nous décrivons un protocole pour l’acquisition dynamique d’une protéine spécifique, la parkine, fusionnée avec la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) afin de suivre l’élimination sélective des mitochondries endommagées, en utilisant une approche de microscopie vidéo en accéléré.

Ici, nous montrons comment la microscopie time-lapse vidéo est une technique puissante qui peut être utilisé pour suivre les événements moléculaires des protéines par fluorescence marqués dans une seule cellule. Les résultats représentatifs montrent aussi comment cette technique permet l&#39;acquisition d&#39;images de haute qualité. Lorsque les images du processus moléculaire, sont obtenus, nous avons la possibilité de les analyser de différentes manières. Ici, nous analysons l&#39;inte...

Ici, nous décrivons en détail une approche de microscopie vidéo en accéléré pour mesurer le recrutement temporel d’EYFP-Parkin lors de l’élimination sélective des mitochondries endommagées. Ce processus dynamique d’élimination des mitochondries endommagées dépendante de l’EYFP-Parkin peut être utilisé comme indicateur de la santé cellulaire dans différentes conditions expérimentales.

Time-Lapse Video Microscopy pour l&#39;évaluation de EYFP-Parkin Agrégation comme un marqueur pour Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

L'objectif général de cette microscopie à vidéo en accéléré est de suivre l'élimination sélective des mitochondries endommagées par Parkine au cours du processus de mitophagie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme moléculaire, notamment comment la mitophagie influence des conditions pathologiques persistantes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue un outil très puissant pour observer la dynamique des protéines marquées durant leurs processus moléculaires.Cette méthode peut fournir des informations sur le cycle de vie mitochondrial. Elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les cultures primaires de cellules, les études en embryologie et la prédiction d'une priorité. Les fibroblastes embryonnaires de souris immortalisés utilisés dans cette étude sont cultivés dans un milieu DMEM complet sur une plaque de culture tissulaire de dix centimètres, à 37 degrés Celsius, dans une atmosphère humidifiée contenant cinq pour cent de dioxyde de carbone.Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 pour cent, éliminer le milieu par aspiration stérile et ajouter dix millilitres de PBS stérile. Retirer le PBS, puis ajouter un millilitre de trypsine-EDTA à 0,25 pour cent. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes, jusqu'au détachement des cellules.Ajoutez quatre millilitres de milieu DMEM complet et remettez les cellules en suspension. Prélevez dix microlitres de la suspension cellulaire pour effectuer un décompte à l’aide d’un hémocytomètre. Ensemencez un million de cellules dans une boîte de culture tissulaire de dix centimètres de diamètre et incubez pendant 24 heures.Le jour suivant, lavez les cellules une fois avec du PBS et détachez-les par trypsination, comme indiqué précédemment. Ajoutez quatre millilitres de milieu DMEM complet, resuspendez les cellules et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Faites centrifuger les cellules à 250 g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Jetez le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de PBS stérile. Faites à nouveau centrifuger les cellules. Jetez le surnageant après la deuxième centrifugation.Ajoutez 100 microlitres du mélange de solution pour électroporation au culot cellulaire et remettez délicatement le culot en suspension par pipetage. Ajoutez ensuite à la suspension cellulaire deux microgrammes de plasmide d'expression EYFP Parkin et un microgramme de plasmide d'expression DsRed2 Mito. Utilisez une pipette Pasteur jetable pour transférer la solution dans une cuvette stérile.Électroporer les cellules en utilisant un programme prédéfini. Immédiatement après l'électroporation, ajouter 500 microlitres de milieu DMEM complet frais, préalablement réchauffé, aux cellules et ensemencer les cellules dans une plaque de culture tissulaire de six centimètres, compatible avec l'imagerie en direct.Incuber les cellules dans une atmosphère humide contenant cinq pour cent de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Avant de commencer cette procédure, régler la température de la chambre du microscope à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparer un milieu spécifique pour l'imagerie vivante en mélangeant les composants suivants : du DMEM sans phénol supplémenté avec dix pour cent de FBS, deux millimolaire par litre de L-glutamine, 100 unités par millilitre de pénicilline et 100 milligrammes par millilitre de streptomycine.Préchauffez le milieu à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Éliminez le milieu des cellules électroporées par aspiration stérile et ajoutez un millilitre de milieu d’imagerie vitale préchauffé. Incubez la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Après avoir confirmé que la chambre du microscope est à une température stable de 37 degrés Celsius, introduisez un flux de cinq pour cent de dioxyde de carbone dans la chambre. Placez délicatement et sans mouvements brusques ou d'oscillations la plaque contenant les cellules électroporées dans la chambre du microscope.À l’aide de l’interface logicielle, régler le microscope pour détecter les signaux fluorescents provenant des protéines de fusion codées par les vecteurs d’expression EYFP Parkin et DsRed2 Mito. Ouvrir le logiciel de microscopie en enregistrement temporel. Dans le menu supérieur, sélectionner FITC pour EYFP Parkin et Rhodamine pour DsRed2 Mito.Sélectionnez un grossissement de 20X. À l’aide de l’interface logicielle, recherchez une cellule unique exprimant les deux vecteurs codélivrés et enregistrez la position. Effectuez cette opération pour un minimum de 10 cellules pour chaque condition expérimentale.Sélectionnez le menu Applications, puis cliquez sur Acquisition multidimensionnelle. Dans la fenêtre Acquisition multidimensionnelle, sélectionnez les paramètres nécessaires, tels que le nombre d'acquisitions, l'intervalle de temps entre chaque acquisition et la position de la cellule enregistrée. Cliquez sur Acquérir pour démarrer l'acquisition de base des deux signaux fluorescents.Recueillir des images toutes les cinq minutes pendant une durée totale de quinze minutes. Pendant l'acquisition des images, préparer du milieu d'imagerie vivante préalablement réchauffé contenant du carbonyl cyanure 4 trifluorométhoxy phénylhydrazone, ou FCCP, à une concentration deux fois supérieure à la concentration finale d'utilisation. Interrompre le processus d'acquisition et ajouter délicatement un millilitre du milieu d'imagerie vivante préalablement réchauffé contenant le FCCP dans la plaque située à l'intérieur de la chambre du microscope.Après l'ajout de FCCP, il est important de recentrer le microscope avant de redémarrer l'acquisition d'images. Redémarrez le processus d'acquisition comme décrit précédemment, et collectez des images pendant une durée totale de trois heures en utilisant la position enregistrée. Une fois l'acquisition d'images terminée, enregistrez toutes les images acquises pour une analyse ultérieure.Des images en lapse de temps des signaux fluorescents EYFP-Parkin et DsRED2-Mito dans des fibroblastes avant l'administration de FCCP sont montrées ici. Les boîtes blanches représentent les zones agrandies des panneaux respectifs situés à droite. Pendant les points temporels basaux, EYFP-Parkin, visualisé en vert, est homogènement diffusé dans toute la cellule.Le réseau mitochondrial, visualisé en rouge, semble bien interconnecté, comme indiqué par les flèches blanches. Après l'administration de FCCP, une fragmentation mitochondriale due à la dépolarisation de la membrane est observée au bout de cinq minutes. Toutefois, EYFP-Parkin reste homogènement diffusé dans le cytoplasme.À 55 minutes après l'administration de FCCP, EYFP-Parkin est recruté aux membranes mitochondriales endommagées afin de déclencher le processus de mitophagie. Le déplacement d'EYFP-Parkin vers la membrane mitochondriale après l'administration de FCCP est illustré dans ce film temporel représentatif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'autophagie pour étudier le recyclage mitochondrial. Elle permet aux cellules d'analyser le processus de mitophagie comme mécanisme de contrôle de qualité mitochondrial au sein des cellules.

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Ici, la cytométrie de flux d'imagerie multispectrale avec une caractéristique analytique qui compare les images détaillées lumineuses de 3 marqueurs d'autophagie et qui quantifie leur co-localisation, ainsi que le comptage de points LC3, a été utilisée pour mesurer l'autophagie d'une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.

Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l&#39;aide de la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale

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