Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires du cerveau ischémique souris

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules immunitaires du cerveau de souris ischémique pour leur quantification et leur caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multiparamétrique. L’analyse de l’inflammation post-ischémique dans le cerveau par cytométrie en flux multicolore permet une compréhension approfondie des processus immunologiques impliqués dans la progression des lésions, la réparation et l’issue globale de l’AVC. Le principal avantage de cette procédure est la centrifugation rapide à gradient de densité en une étape, qui permet d’isoler un grand nombre de cellules immunitaires viables du cerveau de souris ischémique.

L’application de cette technique vise l’identification et la validation de nouvelles stratégies de traitement immunomodulateur qui peuvent être appliquées dans une fenêtre temporelle plus large de l’AVC. Commencez par immerger une extrémité d’un tube de pompe de perfusion péristaltique dans un HBSS glacé sans calcium ni magnésium. Fixez une aiguille émoussée de calibre 23 à l’autre extrémité du tube.

Et allumez la pompe pour remplir complètement le tube avec HBSS. Ensuite, placez une souris euthanasiée dorsalement sur une planche de dissection encastrée dans un plateau en plastique, et épinglez les pattes avant et arrière, étirées aussi largement que possible, avec des aiguilles de calibre 20. À l’aide d’une paire de pinces à dents droites, une par deux, pour saisir la peau abdominale, faites une incision latérale à travers le tégument et la paroi abdominale avec des ciseaux à iris tranchants pour exposer le foie.

Ensuite, soulevez le sternum et utilisez la lame émoussée d’une paire de ciseaux à iris pointus et émoussés pour inciser le diaphragme. Continuez à couper la cage thoracique latérale des deux côtés dans le sens caudocrânien, en prenant soin de ne pas blesser les poumons, le cœur et les artères thoraciques, et utilisez des pinces émoussées pour ajuster le lambeau de peau. Épinglez le rabat à la planche de dissection et séparez soigneusement le cœur du tissu conjonctif.

Tenez le cœur avec une pince à bout émoussé, puis insérez la pointe de l’aiguille de calibre 23 à l’extrémité du tube de perfusion dans l’apex du ventricule gauche, en prenant soin de ne pas blesser le septum intraventriculaire. À l’aide de ciseaux à iris tranchants, incisez l’oreillette droite et démarrez immédiatement la pompe, en prenant soin d’éviter la formation de bulles dans le pompage. Lorsque le foie prend une couleur café clair, utilisez des ciseaux chirurgicaux droits pour décapiter la souris juste derrière le crâne.

Utilisez ensuite les ciseaux à iris pour faire une incision médiane dans le cuir chevelu. Lorsque le crâne est visible, placez une pointe de ciseaux à iris pointus dans le foramen magnum et faites une incision latérale dans l’os. Répétez l’incision de l’autre côté.

Ensuite, utilisez des ciseaux à iris tranchants pour couper soigneusement de la même cavité vers le haut de la ligne médiane, vers le nez. À l’aide d’une pince fine, décollez délicatement les os crâniens de chaque hémisphère cérébral. Ensuite, soulevez le cerveau avec une spatule et utilisez des ciseaux à iris tranchants pour disséquer soigneusement les fibres nerveuses crâniennes qui le fixent au crâne.

Placer le cerveau dans un tube de 15 millilitres, contenant 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium sur de la glace. Pour dissocier le tissu cérébral en une suspension unicellulaire, utilisez d’abord une lame de rasoir propre pour retirer soigneusement le tronc cérébral et le cébullum. Ensuite, utilisez une autre lame de rasoir propre pour hémi-sectionner le cerveau, en coupant chaque hémisphère le long du plan coronal en trois morceaux de taille à peu près égale.

À l’aide de l’extrémité du piston d’une seringue de cinq millilitres, écrasez les morceaux de tissu cérébral à travers une passoire cellulaire de 100 microns, en rinçant continuellement la passoire avec du HBSS glacé avec du calcium et du magnésium. Placez ensuite les tissus homogénéisés sur de la glace. Lorsque tous les échantillons ont été traités, faites tourner les suspensions cellulaires et jetez soigneusement les surnageants.

Remettez les granulés en suspension dans un millilitre de tampon de digestion. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube de deux millilitres et incubez les cellules sous une rotation lente et continue à 37 degrés Celsius. Au bout d’une heure, tamisez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 70 microns et rincez abondamment le filtre avec trois millilitres de tampon de lavage contenant de la DNase.

Ensuite, lavez la passoire avec 15 millilitres de tampon de lavage sans DNase, faites tourner les cellules et jetez le surnageant. Pour éliminer les débris cellulaires et la myéline, remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu à température ambiante, gradient de densité de 25 % et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Mélangez soigneusement les cellules en gradient avec un pipetage doux répété.

Ensuite, faites tourner la solution cellulaire. À la fin de la séparation, aspirez soigneusement l’enveloppe de myéline et le surnageant sans perturber la pastille et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de tampon de lavage sans DNase. Transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et faites-les tourner à nouveau, en remettant la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon de lavage à froid.

Comptez ensuite le nombre de cellules viables en excluant le bleu trypan et stockez-les à quatre degrés Celsius. Avant de commencer l’immunomarquage, incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avec un réactif bloquant le récepteur CD26/CD32 Fc murin pour éviter toute liaison non spécifique. Ajoutez ensuite les anticorps primaires d’intérêt conjugués au fluorophore à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes dans l’obscurité.

À la fin de l’incubation, lavez les cellules dans deux millilitres de tampon de cytométrie en flux. Tournez. Remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux et stocker les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux.

Pour quantifier le nombre absolu de cellules immunitaires infiltrantes par comptage de billes, il faut pipeter à l’inverse exactement 40 microlitres de cytométrie en flux et 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de comptage contenant un nombre connu de billes fluorescentes. Ensuite, incubez la suspension de cellules et de billes avec l’anticorps CD45 marqué FITC à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes dans l’obscurité, puis remplissez inversement, puis remplissez le tube de comptage avec 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux. Ensuite, analysez immédiatement l’échantillon sur le cytomètre en flux, en enregistrant la bille et les événements cellulaires CD45 positifs.

24 heures après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, les leucocytes infiltrant le cerveau peuvent être identifiés par leur expression élevée de CD45. Au sein de la population à CD45 élevé, les polynucléaires neutrophiles sont identifiés par leur expression LY-6G tandis que les lymphocytes T présentent un phénotype de surface cellulaire CD45 élevé et CD3 positif. Les cellules CD45 restantes peuvent être distinguées par leur expression CD19 et CD11b.

Alors que la fraction CD11b positive peut être sous-catégorisée en monocytes inflammatoires à Ly-6C élevé, et une population à faible Ly-6C qui englobe les populations de monocytes, de macrophages et de cellules dendritiques. Au stade aigu de l’AVC, les neutrophiles Ly-6G-positifs pénètrent rapidement dans le cerveau après l’occlusion des vaisseaux. En revanche, les fréquences des lymphocytes T CD3 positifs dans l’hémisphère ischémique diminuent par rapport aux cerveaux de chirurgie simulée et à l’hémisphère controlatéral.

Au sein de la population CD11b positive, l’ischémie cérébrale fait pencher la balance vers une forte prépondérance de monocytes inflammatoires à haute teneur en Ly-6C. De plus, le nombre total de leucocytes dans l’hémisphère infarctus est significativement plus élevé par rapport à l’hémisphère controlatéral et aux cerveaux de chirurgie simulée, 24 heures après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules immunitaires du cerveau ischémique par fragmentation mécanique, digestion enzymatique et centrifugation à gradient de densité, et comment caractériser ces cellules par cytométrie en flux.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le rendement cellulaire total dépend essentiellement de la dissociation complète du tissu cérébral. De plus, une perfusion transcardique suffisante est nécessaire pour prévenir la contamination des leucocytes infiltrant le cerveau par des cellules immunitaires circulantes non inflammatoires.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que des tests d’expression génique ou l’analyse du profil de cytokines peuvent être effectuées pour obtenir des informations supplémentaires sur la pertinence fonctionnelle d’un abcès immunitaire distinct dans le contexte d’un accident vasculaire cérébral ischémique.