L'isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

L’objectif global de cette procédure est de caractériser et de quantifier le nombre de cellules mononucléées du sang périphérique qui ont infiltré le microenvironnement précoce de la tumeur cérébrale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des tumeurs cérébrales en identifiant les facteurs importants pour le trafic des cellules immunitaires périphériques dans le microenvironnement des tumeurs cérébrales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir des données quantitatives dépendantes du temps sur le nombre et l’état d’activation des leucocytes qui ont pénétré dans ce SNC.

Après avoir placé une souris anesthésiée dans un cadre stéréotaxique, faites une incision médiane de deux centimètres sur le crâne, de l’os frontal à l’os occipital, à l’aide d’une lame de scalpel. Ensuite, rétractez la peau au niveau de l’incision à l’aide d’écarteurs Collima. Après cela, abaissez une seringue d’un microlitre équipée d’une aiguille de calibre 33 directement au-dessus du bma.

Ajustez la position de l’aiguille pour atteindre le site cible pour l’implantation de la tumeur. Ensuite, utilisez une seringue à tuberculine d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26 pour marquer cet endroit en excoriant doucement le périoste par la suite. Percez un trou dans le crâne à l’endroit cible avec le foret de 0,8 millimètre jusqu’à ce qu’il atteigne la dure-mère sous-jacente pendant le forage.

Appliquez une pression intermittente suivie d’un retrait rapide du foret de la surface du crâne pour éviter une chaleur et une force excessives. Ensuite, rincez la seringue d’un microlitre avec du chlorure de sodium à 0,9 % dans un microtube conique en polypropylène de 1,7 millilitre pour vous assurer que l’aiguille n’est pas bouchée. Agitez doucement le microtube conique en polypropylène de 0,6 millilitre contenant les cellules tumorales à plusieurs reprises pour bien suspendre les cellules.

Ensuite, aspirez deux microlitres de cellules dans la seringue d’un microlitre et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans la seringue. Versez un microlitre de cellules sur un tampon de préparation à base d’alcool isopropylique à 70 %, en laissant exactement un microlitre de cellules tumorales dans la seringue. Ensuite, abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche la dure-mère.

Abaissez ensuite l’aiguille de 3,5 millimètres dans le cerveau, puis rétractez l’aiguille de 0,5 millimètre lentement et en douceur. Libérez les cellules en appuyant sur le piston de la seringue pendant une à deux minutes. Pour effectuer une perfusion transcardique sur la souris profondément anesthésiée.

Insérez une aiguille émoussée dans le ventricule gauche du cœur. Utilisez une petite paire de ciseaux de dissection pour couper l’oreillette droite afin de permettre la perfusion d’exsanguination, le système circulatoire de la souris avec une solution tyro pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que le foie et les poumons aient complètement blanchi au point de manquer de sang. Assurez-vous qu’aucune quantité grossière de sang ne continue de s’échapper de l’oreillette droite.

Avant de retirer le moyeu en aluminium de calibre 20, émoussez l’aiguille du ventricule gauche. Après avoir retiré l’aiguille, détachez la souris du bloc de mousse de polystyrène extrudé et retournez la souris face ventrale vers le bas. À l’aide d’une grande paire de ciseaux de dissection, séparez la tête du reste du corps.

Ensuite, coupez le cuir chevelu sur la ligne médiane à l’aide d’une petite paire de ciseaux de dissection travaillant de l’os occipital au museau afin d’exposer le crâne. Ensuite, rétractez la peau des deux côtés du crâne et tenez le crâne en toute sécurité. Utilisez une paire d’URS osseuses pour percer soigneusement le crâne en commençant par l’os occipital et avancez pour exposer complètement les surfaces dorsale et latérale du cerveau.

La récolte du cerveau de la souris dans le crâne sans l’endommager peut s’avérer difficile au début. Ceux qui n’ont pas d’expérience avec la technique voudront peut-être essayer plusieurs fois avant de faire des expériences appropriées. Une fois les os crâniens retirés, tournez la tête de la souris côté ventral vers le haut.

Coupez les nerfs crâniens à la base du cerveau afin de le libérer du crâne. Dans cette procédure, à l’aide d’une lame de rasoir propre à un seul tranchant, isolez la zone du cerveau contenant la tumeur en faisant une coupe sagittale au centre du cerveau. Pour disséquer les deux hémisphères, retournez l’hémisphère ipsilatéral du côté médial vers le bas et faites une coupe coronale au niveau du cervelet et une autre coupe au niveau du bulbe olfactif pour isoler le tissu cible contenant l’implant tumoral.

Ensuite, placez le tissu cible dans le broyeur de papier en verre étiqueté contenant un millilitre de DPBS. Poussez le piston à fond vers le bas et tournez-le sept fois pour perturber les tissus. Après cela, soulevez le piston pour permettre au liquide de se déposer au fond du broyeur de tissus.

Répétez cette étape trois fois. Cependant, ne tournez le piston que quatre fois au cours des deux prochaines répétitions et trois fois lors de la dernière répétition. Pour éviter de surestimer le tissu cérébral.

Par la suite, appliquez trois volumes d’un millilitre de DPBS glacé sur les côtés du piston pour rincer la matière cérébrale résiduelle dans le broyeur de tissus. Ensuite, nous suspendons la matière cérébrale TRID en pipetant de haut en bas, et nous la plaçons dans un tube à centrifuger de 15 millilitres étiqueté sur de la glace. Rincez les côtés du broyeur de papier en duvet avec un millilitre supplémentaire de DPBS glacé et ajoutez-le au même tube de centrifugation de 15 millilitres.

Conservez tous les tubes contenant de la matière cérébrale TRID sur de la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités. Ensuite, faites tourner la matière cérébrale TRID dans les tubes à centrifuger de 15 millilitres à 740 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le surnageant et mettez en suspension la matière cérébrale granulée dans un millilitre d’un mélange préalablement préparé de collagénase et d’ADN 1 enzymes digestives.

Placez les tubes à centrifuger de 15 millilitres dans un support de tube à essai et placez le support dans un bain-marie CS à 37 degrés pendant 15 minutes. Ensuite, agitez doucement les échantillons deux fois tout au long de la période d’incubation en agitant les tubes pour faciliter la désagrégation des tissus. Par la suite, ajoutez six millilitres de DPBS pour vice froid dans chaque tube pour diluer les enzymes digestives.

Faites-le monter et descendre pour le remettre en suspension et filtrer le volume total à travers des filtres stériles en nylon de 70 microns dans de nouveaux tubes à centrifuger de 15 millilitres étiquetés sur de la glace. Ensuite, faites tourner la suspension des cellules cérébrales à 740 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius pour obtenir une pastille unicellulaire. Retirez les tubes de 15 millilitres de la centrifugeuse et placez-les sur de la glace.

Augmentez ensuite le réglage de la température sur la centrifugeuse à environ 21 degrés Celsius en préparation de l’étape suivante. Ensuite, retirez complètement la nacelle cellulaire et remettez d’abord les pastilles en suspension dans un millilitre de milieu de centrifugation à 70 % de densité à l’aide d’une micropipette P 1000. Ajoutez ensuite quatre millilitres supplémentaires de média de centrifugation à 70 % de densité dans chaque tube.

Mettez les bouchons en place solidement et homogénéisez la suspension cellulaire en inversant doucement le tube plusieurs fois, puis transférez les tubes à centrifuger de 15 millilitres contenant des cellules cérébrales remises en suspension à 70 % de densité. Milieu de centrifugation de la glace à un support de tube à essai à température ambiante, un par un. Superposez soigneusement deux millilitres de solution de média de centrifugation de 37 % sur les cinq millilitres de média de centrifugation de 70 % de densité pour former une interface propre entre les deux couches de média de centrifugation de densité.

Marquez ensuite la position de l’interface entre les deux couches à l’aide d’un marqueur à pointe fine afin qu’elle puisse être facilement identifiée après la centrifugation lorsque la distinction devient moins apparente. Faites tourner les tubes à centrifuger de 15 millilitres à 740 fois G pendant 20 minutes à température ambiante sans pause. Pour éviter de perturber l’interface entre les couches de milieu de centrifugation de densité par la suite, récupérez les pbmc qui se sont accumulés à l’interface entre les deux couches de milieu de centrifugation de densité en introduisant une micro-pipette P 200 dans le tube.

En contournant soigneusement la couche lipidique une fois au niveau de la bande PBMC, extrayez lentement 200 microlitres de la surface de la couche de média de centrifugation à 70 % de densité et transférez-les dans un tube de fax en polypropylène étiqueté respectivement sur de la glace. Répétez cette étape une fois pour atteindre un volume total de 400 microlitres par échantillon. La capacité de l’expérimentateur à former une interface propre entre les deux couches de milieux de centrifugation de densité est cruciale pour l’isolation reproductible des BMC p.

Il faut verser lentement le média de centrifugation à 37 % tout en inclinant le tube de 20 à 30 degrés au-dessus de la paillasse. Cette figure montre la stratégie de déclenchement d’une expérience typique : des portes placées sur des cellules myéloïdes CD, 11 B positives, une cellule myéloïde CD, 11 B positive, montrée à l’étape cinq, et NK 1.1. Les cellules tueuses naturelles positives montrées à l’étape six sont ensuite stratifiées en fonction de l’expression de GZMB aux étapes cinq premier et six premiers respectivement.

Dans cette figure, l’inversion de la GR d’une cellule myéloïde positive pour CD 11 B et de cellules tueuses naturelles positives pour NK 1.1 sur le FSCA par rapport au SSCA démontre la plus petite taille lymphoïde des cellules tueuses naturelles par rapport à la population myéloïde de taille relativement plus grande, fournissant ainsi une confirmation supplémentaire de l’identité de ces deux sous-populations de PBMC. Les données ici montrent que la greffe de cellules de gliome GL 26 sital one I dans le syngen. Un cerveau de souris XC 57 black six J induit rapidement le recrutement de nombres PBMC positifs CD 45 montrés en association avec chaque point de données le long de la courbe GL 26 sit GAL one I représente l’induction du pli de la pbmc infiltrant la tumeur au-dessus du contrôle.

Il a été démontré que les tumeurs GGL 26 sit NT à l’heure spécifiée après l’implantation de la tumeur ou HPI sur la base du cocktail d’anticorps spécifique utilisé dans la démonstration GR : il a été démontré que les cellules myéloïdes positives pour CD 11 B et les cellules tueuses naturelles positives NK 1.1 pénètrent spécifiquement dans le microenvironnement tumoral déficient de GAL one dans les 48 heures suivant la greffe tumorale. Cependant, le nombre total de cellules myéloïdes infiltrant le gliome dépassait de loin celui des cellules tueuses naturelles. Une fois maîtrisée, la méthodologie est décrite de la collecte du cerveau au flux.

L’analyse cytométrique peut être effectuée en environ six heures par un expérimentateur. Il est impératif que le volume total de chaque échantillon de PBMC soit analysé par le cytomètre en flux afin d’obtenir une comparaison juste du nombre total d’expériences complémentaires de PBMC infiltrant un gliome. Une telle analyse immunohistochimique peut être effectuée pour obtenir des données spatiales sur les infiltrats des cellules immunitaires et pour permettre de mesurer la taille globale de la tumeur et la microanatomie à des moments qui correspondent à ceux évalués à l’aide de cette procédure.

Cette technique peut être appliquée à l’étude de divers modèles de tumeurs cérébrales, y compris ceux générés de novo avec l’utilisation d’oncogène codant pour l’ADN plasmatique sans altérations significatives de la procédure globale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des suspensions de cellules de gliome pour la stéréotaxie et la greffe dans un cerveau de souris, comment transi une tumeur abondante, des souris porteuses de cerveau, et comment isoler et écouler cyto métriquement, analyser le gliome infiltrant les cellules mononucléées du sang périphérique.