Name: Lisolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Apprenez à isoler et analyser par cytométrie en flux les cellules mononucléaires du sang périphérique infiltrant les gliomes. Cette méthode fournit des données quantitatives temporelles sur le nombre et l'état d'activation des leucocytes dans le microenvironnement tumoral cérébral.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé / Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NIH / NINDS) accorde R01-NS074387, R01-R21 et NS057711-NS091555 à MGC; NIH / NINDS accorde R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21 et NS082311-NS084275 à PRL; subventions de Happy Hearts de Léa, Université du Michigan Comprehensive Cancer Center attribué à MGC et PRL; du département de neurochirurgie de l&#39;Université du Michigan School of Medicine; l&#39;Institut du Michigan pour clinique et de recherche en santé, soutenu par NIH subvention 2UL1-TR000433; la Subvention de formation de biologie Université du Michigan Cancer soutenu par NIH / NCI (National Cancer Institute) subvention T32-CA009676; l&#39;Université du Michigan de formation en neurosciences cliniques et fondamentales soutenu par NIH / NINDS accorder T32-NS007222; et l&#39;Université de Programme de formation scientifique médicale Michigan soutenu par NIH / NIGMS (Institut national de médecine générale Sciences) accorder T32-GM007863. Les auteurs d&#39;unre reconnaissants pour le leadership universitaire et le soutien reçu du Dr Karin Muraszko et le Département de neurochirurgie; M. Dahlgren, D. Tomford, et S. napolitaine pour le soutien administratif superbe; M. Dzaman pour l&#39;assistance technique exceptionnelle; et Phil F. Jenkins pour le soutien généreux envers l&#39;achat d&#39;un microscope électronique à balayage Zeiss 3D. Nous reconnaissons également le laboratoire Kuchroo à la Harvard Medical School à partir de laquelle une version modifiée de la stratégie de médiation de médias centrifugation de densité pour l&#39;isolement de cellules mononucléaires du cerveau a été prélevé.

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce protocole décrit un procédé robuste et reproductible pour l&#39;isolement et l&#39;analyse cytométrique en flux de cellules PBMC qui ont infiltré le micro-environnement de la tumeur du cerveau de la souris au début. Des suspensions de cellules de gliome sont générées à une concentration spécifiée par l&#39;expérimentateur qui sont greffées stéréotaxique dans le striatum du cerveau de la souris. Les souris sont ensuite euthanasiés à des points de temps prédéterminés spécifiés par le protocole expérimental et leurs cer...

Les gliomes sont une classe de cancers du cerveau résultant de la glie neuro-épithéliales transformées dans le système nerveux central (SNC). De tous les gliomes, Organisation mondiale de la Santé (OMS) de grade IV gliome, ou le glioblastome (GBM), est la plus fréquente et mortelle 1. GBM est hautement réfractaire au traitement standard-de-courant qui se compose de résection de la tumeur dans la mesure du possible, plus suivie d&#39;une radiothérapie chimiothérapie concomitante et adjuvante avec 2 témozolomide. Ces cancers mortels portent un pronostic sombre de seulement 15-18 mois de survie à partir du moment du diagnostic initial avec seulement 5% des patients survivent à la maladie après 5 ans 3. La présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE), le manque de cellules présentatrices d&#39;antigène professionnelles (APC), et l&#39;existence non identifiés auparavant des structures lymphatiques de bonne foi dans le cerveau 4 ont conduit à la notion de GBM comme immunitaire privilégié. Cependant, de nombreuses études sho maintenantw que ces cancers du cerveau engendrent en effet le recrutement de cellules immunitaires périphériques qui sont principalement à l&#39;origine myéloïde incluant les monocytes, les macrophages et les cellules myéloïdes suppressives (MDSC dérivés 5). GBM influe également sur ​​l&#39;activité de cerveau-résident microglie à devenir pro-tumorigènes 6,7. Les cellules lymphoïdes telles que les cellules T CD8 + 8 et cellules CD56 + tueuses naturelles 9 sont également présents dans le microenvironnement de la tumeur, mais en beaucoup moins grand nombre, un fait semble être due à la fonction immunosuppressive incité par des facteurs de gliome dérivés sur les macrophages associés aux tumeurs ( TAM) 10. Lymphocytes T CD4 + sont également présents dans GBM, mais une grande partie de cette population exprime également CD25 et FoxP3, les responsables de immunosuppresseur T régulatrices (T reg) cellules 11. L&#39;état immunosuppresseur globale de GBM culmine dans la promotion de l&#39;évasion immunologique et la progression de la tumeur 12. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; Une meilleure compréhension des mécanismes de la GBM immunosuppression est essentielle à l&#39;élaboration de stratégies immunothérapeutiques efficaces conçus pour stimuler le système immunitaire contre la tumeur. Au cours des 15 dernières années, notre laboratoire a travaillé à surmonter les mécanismes de immunosuppresson de tumeur au cerveau afin de développer de nouveaux produits immunothérapeutiques efficaces anti-GBM 13-19. Le point culminant de ce travail a conduit à un essai clinique visant à évaluer un cytotoxique combinée et thérapeutique immuno-stimulation pour les patients nouvellement diagnostiqués (identificateur ClinicalTrials.gov: NCT01811992) GBM. Notre travail le plus récent montre que GL26 de la souris et de rat SNC-1 des cellules de glioblastome bloquent anti-tumorale des cellules NK surveillance immunitaire en produisant de grandes quantités de la β-galactoside lectine liant la galectine-1 (gal-1) 20. Cela a été démontré par la suppression de l&#39;expression de gal-1 dans les cellules de gliome utilisant knockdown de gènes shRNA médiation. In vitro expérits ont montré que les cellules de gliome Gal-1 déficient prolifèrent normalement dans la culture, mais ont subi un rejet rapide, peu après la prise de greffe intracrânienne dans des souris C57BL / 6J ou RAG1 souris - / -, établissant ainsi l&#39;indépendance de T ou cellules B sur cette forme de rejet de la tumeur. NK immunodéplétion de la cellule avec un anticorps anti-asialo GM1 anti-sérum ou des anticorps NK1.1 monoclonaux dirigés à la restauration complète de l&#39;évolution de gliome gal-1-deficient intracrânienne, en établissant le rôle des cellules NK en gal-1-deficient rejet de gliome. Nous montrons maintenant que immunodéplétion des cellules myéloïdes Gr-1 + / CD11b + est suffisante pour prévenir le rejet d&#39;un gliome gal-1 déficiente en dépit de la présence de cellules NK, révélant ainsi un rôle d&#39;auxiliaire indispensable pour les cellules myéloïdes dans l&#39;aide apportée à l&#39;gal NK médiée lyse tumorale -1 déficiente (données non publiées). Ce résultat inattendu nous a conduit à développer un protocole détaillé pour l&#39;isolement et l&#39;analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) quiinfiltrer le microenvironnement d&#39;une tumeur cérébrale, peu après la prise de greffe intracrânienne afin que nous puissions mieux caractériser les événements d&#39;infiltration immunitaires qui prédicat rejet de gliome gal-1 déficient. La méthode est démontré ici en utilisant des cellules de gliome de GL26 de souris qui expriment constitutivement mCitrine protéine fluorescente, appelée GL26-Cit, qui autorisent la visualisation de la cellule tumorale directe par microscopie à fluorescence 21. Ces cellules sont greffées stéréotactique dans le cerveau de souris C57BL / 6J et syngéniques sont laissées se développer pendant 24, 48 ou 72 heures avant l&#39;euthanasie des souris. PBMC de gliome infiltrant sont ensuite isolés et immunomarquées utilisant des anticorps anti -CD45, -GR-1, et -CD11b -NK1.1 anticorps de surface cellulaire conjointement avec immunomarquage intracellulaire de granzyme B (GZMB). Cette combinaison permet d&#39;anticorps spécifique pour l&#39;identification des Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes infiltrant les tumeurs et NK1.1 +, les cellules NK, les types de cellules, nous avons been impliqué dans le rejet de la tumeur gal-1 déficient. Le profil d&#39;infiltration immunitaire de Gal-1-deficient GL26-Cit gliome, appelé ici GL26-Cit-gal1i, est ensuite comparée à celle des gliomes exprimant des taux normaux de Gal-1 appelé GL26-Cit-NT qui contiennent une non- ciblant le contrôle shRNA épingle à cheveux. Le protocole commence par une description sur la façon de la culture des cellules GL26-Cit gliome in vitro, qui est suivie d&#39;une explication sur la façon de greffer orthotopiquement ces cellules dans le striatum de souris C57BL / 6J syngéniques. Il procède ensuite à énumérer les étapes impliquées dans l&#39;isolement et l&#39;immunomarquage des PBMC de gliome infiltrant pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. Le protocole se termine par une explication de l&#39;analyse de données standard et de représentation graphique. La démonstration révèle que les deux Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK NK1.1 + accumuler de préférence dans le microenvironnement tumeur cérébrale gal-1 déficient dans les 48h d&#39;implantation de la tumeur, un résultat qui contribue à expliquer pourquoi ces tumeurs subissent rapidement lyse tumorale complète d&#39;environ 1 semaine de prise de greffe tumorale post-20. Le procédé est facilement adaptable à un certain nombre de différents modèles expérimentaux in vivo dans lequel des données temporelles sur infiltration immunitaire dans le cerveau est nécessaire. Un seul expérimentateur peut effectuer le protocole de récolte cerveau analyse cytométrique de flux de PBMC de gliome infiltrant en environ 4-6 heures en fonction du nombre d&#39;échantillons à analyser. Le procédé peut également être combiné avec des expériences visant à caractériser le profil de circulation des PBMC chez les souris porteuses de tumeur pour la comparaison avec ceux qui infiltrent le cerveau afin d&#39;identifier les phénotypes d&#39;immunosuppression spécifiquement induites par le micro-environnement de la tumeur. Application de la présente et des méthodes similaires devrait faciliter une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans le trafic de cellules immunitaires périphériques dans le microenvironnement de la tumeur du cerveau.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modification de Eagles Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td>avec 4,5 g/L de D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES et rouge de phénol.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp ;</td><td>sans chlorure de calcium ni chlorure de magnésium</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10 000 U/ml Pénicilline ; 10 000 &mu ; g/ml Streptomycine&nbsp ;</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 sulfate&nbsp ;</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de puromycine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>de Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase non-mammifère trypsine alternative&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30030.01</td><td>en DPBS avec EDTA&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hémocytomètre à contraste de phase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0,1 mm de profondeur</td></tr><tr><td>Coloration au bleu trypan</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Injection stérile de NaCl à 0,9 %, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC : 0409-4888</td><td>Flacons de 10 ml</td></tr><tr><td>Microtubes coniques en polypropylènes de 0,6 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>Injection de chlorhydrate d’atipamézole</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC : 52483-6298</td><td>Solution 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine injectable</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC : 0409-2051</td><td>Solution 100 mg/ml Chlorhydrate</td></tr> de <tr><td>dexmédétomidine injectable</td><td>Zoetis</td><td>NDC : 54771-2805</td><td>Solution 0,5 mg/ml Chlorhydrate</td></tr><tr><td>de xylazine injectable</td><td>Lloyd</td><td>NDC : 61311-481</td><td>Solution 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Injection de carprofène</td><td>Pfizer</td><td>NDC : 61106-8501</td><td>Solution 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de buprénorphine injectable</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC : 12496-0757</td><td>0,3 mg/ml ampoules</td></tr><tr><td>1 ml seringues de tuberculine&nbsp ;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12 ; aiguilles de seringue (0,45 mm x 13 mm)</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse chirurgicale</td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Solution de providone iodée</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC : 52380-1905</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique à base de vaseline stérile&nbsp ;</td><td>Dechra</td><td>NDC : 17033-211</td><td></td></tr><tr><td>Tampons de préparation à l’alcool isopropylique à 70 %</td><td>Kendall</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Gaze stérile</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>non tissée, 4 » x 4 », 4 plis&nbsp ;</td></tr><tr><td>Microtubes coniques en polypropylène de 1,7 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique de souris</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Lampe chirurgicale</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II Projecteur variable</td></tr><tr><td>Pince de dissection incurvée</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>Enrouleurs Colibri&nbsp ;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse électrique de précision sans fil</td><td>Dremel&nbsp ;</td><td>1100-01</td><td>Modèle de stylet ; 7,2 volts Lithium-Ion avec station d’accueil</td></tr><tr><td>Coupe-gravure</td><td>Dremel</td><td>105</td><td>1/32" ou 0,8 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Seringue Microliter</td><td>Hamilton</td><td>75</td><td>Hamilton Seringues Microliter série 700 ; 5 &mu ; l volume</td></tr><tr><td>Microliter seringue</td> aiguilles <td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33 G, petit moyeu RN NDL, 1,5 po, point style 3, 6/PK</td></tr><tr><td>Ethilon 3-0 noir monofilament nylon sutures&nbsp ;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>Barre d’agitation magnétique</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7,9 mm de diamètre x 50 mm de longueur (5/16 » de diamètre x 2 » de longueur)</td></tr><tr><td>1 L de bouteille de stockage en verre à bouchon à vis</td><td>Corning</td><td>1395</td><td>Type 1, verre borosilicaté de classe A</td></tr><tr><td>Héparine sodique&nbsp ;</td><td>Sagent</td><td>NDC : 25021-400</td><td>Solution 1 000 U/ml</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Cole Parmer Instruments Group</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II Console Drive</td></tr><tr><td>carbogen compressé (95 % O2 / 5 % CO2)</td><td>disponible auprès du fournisseur local</td><td>N/A</td><td>Type A, grande bouteille&nbsp ;</td></tr><tr><td>20 g x 1 & frac12 ; " Aiguilles émoussées à moyeu en aluminium</td><td>Kendall</td><td>8881202363</td><td>0,9 mm x 38,1 mm</td></tr><tr><td>Seau à glace en polyuréthane</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>Capacité : 0,152 oz (4,5 L)</td></tr><tr><td>Collagénase (Type I-S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td><td>de Clostridium histolyticum&nbsp ;</td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS002007</td><td>>2 000 unités Kunitz par mg poids sec</td></tr><tr><td>Boîtes de pesée hexagonales en polystyrène antistatique</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>20157-3</td><td>D.I. supérieur 115 mm, D.I. de la base 85 mm, volume de 203 ml&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lames de rasoir à simple tranchant en acier inoxydable&nbsp ;</td><td>Garvey</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs à os</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de grande dissection</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince à bout émoussé</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>7 ml verre Broyeur de tissus Dounce</td><td>Kontes</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Density Média de centrifugation&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques de 10 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td>à usage unique ; stériles</td></tr><tr><td>70 &mu ; Filtres à cellules en nylon stérile M&nbsp ;</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-conjugué anti-souris CD45 (clone : 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>souris conjuguée APC anti-souris NK1.1 (clone : PK136)</td><td>eBiosciences&nbsp ;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris de rat conjugué PE Gr-1 (clone :RB6-8C5)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5-anti-souris CD11b (clone : M1/70)&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-rat conjugué IgG2b, &kappa ; (clone : RTK4530) contrôle des isotypes&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>400628</td><td></td></tr><tr><td>souris IgG2a conjuguée à l’APC, &kappa ; (clone : eBM2a) contrôle des isotypes&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b de rat conjugué au PE, &kappa ; (clone : eB149/10H5) contrôle des isotypes&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b de rat conjugué PerCP/Cy5.5, &kappa ; (clone : RTK4530) contrôle d’isotype</td><td>Biolegend</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>souris conjuguée au bleu du Pacifique anti-granzyme B de souris (clone : GB11)&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>515403</td><td></td></tr><tr><td>souris conjuguée au bleu du Pacifique IgG1, &kappa ; (Clone : MOPC-21) contrôle des isotypes&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>tubes à centrifuger en polypropylène de 15 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>à fond conique.</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en polypropylène de 50 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td>à fond conique</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm tubes FACS en polypropylène à fond rond.</td><td>Fisherbrand</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Special Order Research Produit cytomètre/trieur de cellules en flux</td><td>BD&nbsp ;</td><td></td><td></td>650033</tr><tr><td>Armoire de sécurité biologique de classe II</td><td>The Baker Company</td><td>SG603</td><td>modèle : SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Notre laboratoire a démontré récemment que les cellules tueuses naturelles (NK) sont capables d&#39;éradiquer GL26 de souris orthotopique implanté et rat CNS-1 gliomes malins peu de temps après la prise de greffe intracrânienne si les cellules cancéreuses sont rendues déficientes dans l&#39;expression de la lectine galectine β-galactoside liaison -1 (gal-1). Des travaux plus récents montre maintenant que une population de GR-1 des cellules myéloïdes + / CD11b + est essentiel à cet effet. Pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels les NK et les cellules myéloïdes coopèrent pour conférer rejet de tumeur gal-1-deficient nous avons mis au point un protocole détaillé pour l&#39;isolement et l&#39;analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant (PBMC). La méthode est mise en évidence en comparant les PBMC ici infiltration dans le microenvironnement tumoral de Gal-1 exprimant GL26 gliomes avec ceux-gal rendu déficient par une shRNA-knockdown. Le protocole commence par une description de la façon dont la culture et de préparer GL26 CElls pour l&#39;inoculation dans le cerveau de souris C57BL / 6J syngénique. On explique ensuite les étapes impliquées dans l&#39;isolement et l&#39;analyse par cytométrie flux de PBMC de gliome infiltrant du micro-environnement de la tumeur cérébrale précoce. Le procédé est adaptable à un certain nombre de modèles expérimentaux in vivo dans lequel des données temporelles sur infiltration immunitaire dans le cerveau est nécessaire. La méthode est sensible et hautement reproductibles, comme des PBMC de gliome infiltrant peuvent être isolées à partir de tumeurs intracrâniennes dès que la prise de greffe de post-tumeur 24 h avec le nombre de cellules observées similaires de points appariés de temps tout au long de tumeurs expériences indépendantes. Un seul expérimentateur peut réaliser le procédé à partir de cerveau de récolte de circuler analyse cytométrique des PBMC de gliome infiltrant dans environ 4-6 heures selon le nombre d&#39;échantillons à analyser. Modèles de gliome alternatifs et / ou de détection des anticorps spécifiques de cellules peuvent également être utilisés à la discrétion des expérimentateurs pour évaluer l&#39;infiltration de plusieurs autres immune types cellulaires d&#39;intérêt sans la nécessité de modification de la procédure globale.

La stratégie de déclenchement suivant est utilisé pour une expérience typique: FSC-A vs SSC-A → SSC-H vs SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. comptage → Gr-1 contre CD11b → NK1.1 contre comptage. Gates a mis sur Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK NK1.1 + sont ensuite stratifié basé sur l&#39;expression GZMB (figure 5A). Backgating ces cellules identifiées comme des cellules NK et NK1.1 + Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïde...

Présenté ici est une méthode simple pour l&#39;isolement et le flux analyse cytométrique de cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant qui donne des données quantitatives en fonction du temps sur le nombre et le statut activation des cellules immunitaires qui entrent dans le microenvironnement de tumeur cérébrale tôt.

L&#39;isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

L’objectif global de cette procédure est de caractériser et de quantifier le nombre de cellules mononucléées du sang périphérique qui ont infiltré le microenvironnement précoce de la tumeur cérébrale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie des tumeurs cérébrales en identifiant les facteurs importants pour le trafic des cellules immunitaires périphériques dans le microenvironnement des tumeurs cérébrales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir des données quantitatives dépendantes du temps sur le nombre et l’état d’activation des leucocytes qui ont pénétré dans ce SNC.Après avoir placé une souris anesthésiée dans un cadre stéréotaxique, faites une incision médiane de deux centimètres sur le crâne, de l’os frontal à l’os occipital, à l’aide d’une lame de scalpel. Ensuite, rétractez la peau au niveau de l’incision à l’aide d’écarteurs Collima. Après cela, abaissez une seringue d’un microlitre équipée d’une aiguille de calibre 33 directement au-dessus du bma.Ajustez la position de l’aiguille pour atteindre le site cible pour l’implantation de la tumeur. Ensuite, utilisez une seringue à tuberculine d’un mi

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Le présent article décrit un protocole rapide pour isoler efficacement les cellules mononucléées du tissus de la moelle épinière du cerveau et qui peuvent être utilisés efficacement pour des analyses de cytométrie en flux.

Isolement du cerveau et les cellules mononucléées de la moelle épinière utilisant gradients de Percoll

Ce protocole vidéo montre l'application de la teinture fluorescente carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) pour l'identification et la séparation des différentes sous-populations de cellules de glioblastome humain basé sur la fréquence de la division cellulaire.

Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

La vidéo démontre l’isolement de cellules mononucléées du sang périphérique infiltrant la tumeur à partir d’un cerveau de souris en utilisant la dissociation mécanique et la digestion enzymatique. Ceci est suivi d’une centrifugation à gradient de densité pour collecter les cellules immunitaires pour une analyse plus approfondie.

Isolement de cellules immunitaires infiltrant la tumeur d’un cerveau murin

L’inflammation joue un rôle central dans la pathogenèse de l’AVC ischémique. De plus en plus de preuves suggèrent qu’il agit comme une arme à double tranchant qui exacerbe les lésions cérébrales précoces, mais contribue également à la réparation ultérieure. Ce protocole décrit l’isolement des cellules immunitaires du cerveau ischémique et leur phénotypage ultérieur par cytométrie en flux.

Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires du cerveau ischémique souris

Ce protocole fournit une analyse des sous-populations de macrophages dans le système nerveux central de souris par cytométrie de flux et est utile pour l'étude de marqueurs multiples exprimés par ces cellules.

Analyse de la microglie et des macrophages dérivés de monocytes du système nerveux central par cytométrie de flux

Ce protocole a été développé pour identifier quantitativement les composants de micro-environnement de la tumeur dans les résections du patient au glioblastome utilisant l'immunohistochimie chromogène et ImageJ.

Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

Ce manuscrit présente un protocole pour induire l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale active (EAE) chez les souris. Une méthode pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes infiltrés dans le système nerveux central (SNC) est également présentée pour montrer comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune de CNS.

Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale

Nous présentons une méthode de réplication du microenvironnement tumoral du gliome sur le front invasif qui intègre le flux de liquide interstitiel. Ce modèle est un hydrogel hyaluronane-collagène I dans un insert de culture tissulaire où une tête de pression de fluide peut être appliquée. L’invasion peut être quantifiée et les cellules peuvent être isolées ou lysées.

Un modèle photopolymérisable d’acide hyaluronique-collagène du microenvironnement invasif du gliome avec flux interstitiel

Il est difficile d’identifier les microglies (MG) et les macrophages infiltrants périphériques (Mø) dans les moelles épinières lésées. Dans ce protocole, la cytométrie en flux (FCM) a été utilisée pour identifier respectivement la MG de type M1, la MG de type M2, la Mø de type M1 et la Mø de type M2. Cette technologie peut également être appliquée à d’autres maladies du système nerveux central pour comprendre le rôle de la MG et de la Mø.

Identification de la microglie et des macrophages infiltrants périphériques dans la moelle épinière lésée à l’aide de la cytométrie en flux

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer la fonction des cellules immunitaires après un AVC ischémique à l’aide de l’analyse cytométrique en flux dans un modèle de mini-AVC. Cette méthode permet un examen détaillé des interactions neuro-immunes et peut être adaptée à l’étude d’autres maladies neurodégénératives, améliorant ainsi notre compréhension des réponses immunitaires dans la pathologie de l’AVC.

Isolement et évaluation par cytométrie en flux des interactions neuro-immunes dans un modèle murin de mini-AVC

Apprenez à isoler et analyser par cytométrie en flux les cellules mononucléaires du sang périphérique infiltrant les gliomes. Cette méthode fournit des données quantitatives temporelles sur le nombre et l'état d'activation des leucocytes dans le microenvironnement tumoral cérébral.

L'isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

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