Name: Isolement de CD 90+ fibroblastes / myofibroblastes de spécimens humains congelés gastro-intestinaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Découvrez l'isolement de fibroblastes et myofibroblastes CD90+ à partir de tissus gastro-intestinaux humains congelés. Cette méthode permet d'établir des cultures primaires viables pour l'étude de la réparation tissulaire et de la fibrose.

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Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) et l’Institute for Translational Sciences de la branche médicale de l’Université du Texas, ainsi qu’un prix de science clinique et translationnelle (8UL1TR000071).

Le protocole pour l&#39;obtention de tissus humains jetés de patients chirurgicaux et la mise en place de cultures primaires a été approuvé par l&#39;Université du Texas Medical Branch et de l&#39;Université du Nouveau-Mexique Institutional Review Board. Les exigences générales pour l&#39;obtention d&#39;échantillons de tissus humains est décrite ci-dessous. Notez que depuis MFS peut être isolé à partir de tissus congelés, les biobanques et de fournisseurs commerciaux sont également des options viables. 1. Obtenir tissus humains <ol><li> Proposez un protocole pour obtenir des tissus du côlon humain à la commission d&#39;examen institutionnel pour approbation. </li><li> Établir des collaborations avec des chirurgiens généraux et / ou des chirurgiens colorectaux afin d&#39;obtenir les tissus humains pour la recherche. La collaboration avec le département de pathologie est également obligatoire, car ils seront déterminer les tissus qui ne sont pas requis pour le diagnostic et peut être désigné pour la recherche. </li><li> Conseiller pathologiste de fournir des tissus de la tumeur, puis grosslmuqueuse normale y au moins 5 cm de la tumeur. Placer immédiatement les échantillons dans des milieux de lavage glacées et les placer sur la glace. Le pathologiste de déterminer la quantité de tissu qui peut être administré en toute sécurité pour la recherche. Le tissu minimale requise pour MF isolement est de 1,5 mm 2. </li><li> Utilisez le tissu obtenu soit immédiatement pour établir les cultures primaires ou de gel et lieu à -80 ° C pour l&#39;isolement avenir. <ol><li> Si le gel pour l&#39;isolement plus tard, couper le tissu en environ 1 - 2 mm 2 pièces, placer dans un tube cryogénique avec 1 ml de gel des médias (voir ci-dessous), et conserver à -80 ° C. Remarque: En utilisant ce protocole, isolement réussi de la MFS à partir de tissus congelés pendant plus de 4 ans a été observé. </li></ol></li></ol> 2. Préparer Réactifs <ol><li> Pour une solution de collagénase: Préparer 100 U / ml de collagénase I, II et IV dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec Ca2 + / Mg2 + (voir Tableau Matériaux </strong&gt;). ATTENTION: la collagénase concentration d&#39;unité active et la pureté peut varie d&#39;un fournisseur à ce qui peut entraver l&#39;efficacité de la digestion des tissus et / ou de conservation de l&#39;épitope sur la surface des cellules de la muqueuse. Pour éviter ces écueils potentiels, utilisez la collagénase avec plus haut degré de pureté (≥95%) et de préparer la solution d&#39;actions fondée sur la concentration des unités actives. </li><li> DNase solution d&#39;achat d&#39;actions à base d&#39;eau Préparer à 10 mg / ml (3,55 UA / mg). </li><li> Préparer Laver les médias: (MEM: 89 ml, antibiotiques antimycosique, 100x: 1 ml; FCS inactivé à la chaleur: 10 ml) </li><li> Préparer la croissance des fibroblastes médias: MEM: bouteille de 500 ml; L-glutamine (200 mM): 5 ml; MEM non-acides aminés essentiels, 100x solution: 5 ml; ciprofloxacine HCl (10 mg / ml): 570 ul; Antibiotique-antimycosique, solution 100x: 10 ml; pyruvate de sodium (100 mM): 5 ml; FCS inactivé à la chaleur: 50 ml </li><li> Préparer les médias Gel: les milieux de croissance des fibroblastes (réactif 2.4) avec l&#39;ajout de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), puis filtrez-sterilize avec un filtre de 0,22 pm. </li></ol> Tissue 3. Digest enzymatique humain <ol><li> Si le tissu a été gelé dans les médias gel, lieu cryovial dans (~ 37 ° C) jusqu&#39;à ce que l&#39;eau chaude des tissus et des médias doit être décongelée. </li><li> Pour 4 - 5 de 2 mm 2 morceaux de tissu, lavez le tissu deux fois avec 10 ml de HBSS sans Ca 2+ / Mg 2+. </li><li> Une fois que le tissu a réglé par gravité, prenez soin de le surnageant sans essorage échantillon. </li><li> Ajouter 10 ml de la solution de collagénase à l&#39;échantillon et transférer le mélange tissu-solution dans un tube stérile, DNase / RNase avec haut-rotors pour échantillon dissociation. Utilisation de la collagénase pour dissocier la matrice extracellulaire qui entoure l&#39;aspect basal des cellules épithéliales et constitue la fraction non-cellulaire de la muqueuse de la lamina propria. </li><li> Fermer hermétiquement le tube et l&#39;attacher à l&#39;envers sur la manche de la dissociateur (par exemple, gentleMACS). Si le laboratoire n&#39;a pas accès à la til susmentionnées équipements, augmenter le temps de chaque étape de digestion pour obtenir des résultats comparables. </li><li> Exécutez le h_tumor_01 du programme, un profil prédéfini fourni avec la machine (durée totale de 36 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 268 tours par course). </li><li> Après la fin du programme, retirez le tube de la dissociateur. </li><li> Incuber l&#39;échantillon pendant 45 min à 37 ° C sous rotation continue sur agitateur à 140 tours par minute. Remarque: Pour les quantités d&#39;échantillons de tissus divers, temps de digestion peut être proportionnellement réduite ou augmentée (par exemple, de plus grandes quantités de tissu peuvent être plus longues). </li><li> Attacher le tube à l&#39;envers sur le manchon du dissociateur. </li><li> Choisissez et exécutez le h_tumor_02 de programme (durée totale de 37 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 235 tours par course). </li><li> Après la fin du programme, retirez le tube de la dissociateur. </li><li> Ajouter 50 pi de DNase solution stock. Utilisez DNAse de dissocier / éliminer les cellules mortes et fraction d&#39;ADN des débris cellulaires qui mène à la cellule agglutination. </li><li> Incuber l&#39;échantillon pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue sur un agitateur à 60 tpm. </li><li> Attacher le tube à l&#39;envers sur le manchon du dissociateur nouveau. </li><li> Choisissez et exécutez le h_tumor_03 de programme (durée totale de 37 sec, avec des impulsions intermittentes allant de 1000 - 4000 rpm, avec 168 tours par course). Remarque: Si le tissu est complètement digéré pas, centrifuger à 250 g pendant 10 min à 20 ° C, éliminer le surnageant, remettre en suspension dans 2 ml de solution de dissociation cellulaire et incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Passez la suspension de cellules à travers stérile 70 um tamis cellulaire. </li><li> Centrifugeuse suspension de cellules à 250 g pendant 10 min à 20 ° C. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Laver culot cellulaire à deux reprises avec 25 ml de HBSS sans Ca 2+ / Mg 2+ et jeter le surnageant. </li><li> Avant la dernière étaith, compter le nombre de cellules en utilisant un système de comptage de cellules automatisé disponible dans le laboratoire ou manuellement en utilisant un hémocytomètre. Pour MF génération de culture primaire de procéder pour l&#39;étape 3.19.1, pour l&#39;analyse ou le tri de la MFS en utilisant la cytométrie de flux de procéder pour l&#39;étape 3.19.2. <ol><li> Pour l&#39;isolement et la croissance de la culture MF pur (figure 1), jeter le surnageant à partir de la dernière centrifugation, culot de cellules de remettre en suspension dans la quantité appropriée de support d&#39;isolation des fibroblastes nécessaire pour ensemencer jusqu&#39;à 4 x 10 6 cellules dans 3 ml du milieu par puits dans 6 assiettes bien, la culture de cellules traitées. Passez à l&#39;étape 3.20. </li><li> Pour l&#39;analyse ou le tri de la MFS en utilisant la cytométrie de flux, placer jusqu&#39;à 2 x 10 6 dans 2 ml de milieux d&#39;isolement des fibroblastes dans 24 puits, plaque bas-liaison et incuber O / N à 37 ° C avec 5% de CO 2. Ceci est de restaurer les épitopes de surface cellulaire qui peuvent être affectés par la procédure enzymatique. Ensuite collecter suspension cellulaire et compter les cellules récupérées et procéderpour l&#39;immunocoloration et cytométrie de flux analyse 8. </li></ol></li><li> Cultiver les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2. Changer de support tous les 2 - 3 jours jusqu&#39;à la formation de ~ 80% de confluence MF monocouche (figure 1D-E). </li><li> Cellules Passage dans des flacons T25 avec plaque de 6 puits à un rapport de 1: 1 et croître pendant ~ 10 - 14 jours dans les médias de croissance des fibroblastes pour atteindre 80 - 100% de confluence. </li><li> Développer culture par passage de cellules à partir de cellules T25 à T75 à un rapport 1: 2. Une fois que les cellules atteignent la confluence, utiliser un flacon pour l&#39;analyse de la pureté isolé MF utilisant par cytométrie de flux comme décrit précédemment 5. De geler ou de passage dans un autre ballon T75 de la culture MF au rapport 1: 3. Remarque: Lors de l&#39;analyse par cytométrie de flux, il est prévu que la muqueuse GI stromales mésenchymateuses MF d&#39;origine lors de la croissance dans la culture aura phénotype suivant: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentine +, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

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<li>Schiller, J. H., Bittner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Tumorigenic+Phenotype+with+in+Vitro%2C+but+not+in+Vivo%2C+Passaging+of+a+Novel+Series+of+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Lines%3A+Possible+Role+of+an+%CE%B15%2F%CE%B21-Integrin-Fibronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction.</a> Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).</li>
<li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li>
<li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li>
<li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que ce protocole a été développé pour l&#39;application de recherche uniquement, à la lumière de l&#39;importance croissante critique de cellules stromales comme un cancer potentiels biomarqueurs pronostiques et cible thérapeutique, la capacité de geler biospécimens «fonctionnelles» pour une utilisation ultérieure offre un avantage significatif. Cela représente un avantage unique pour la création de banques de tissus biologiques cliniques, qui peuvent servir d&#39;outils supplémentaires servant à faire progresser l...

Myofibroblastes / fibroblastes (PDE) représentent une population abondante de cellules dans gastro-intestinal (GI) muqueuse. Ces cellules stromales sont situés juste en dessous de l&#39;épithélium et forment un réseau interconnecté à l&#39;intérieur de la muqueuse de la lamina propria dans l&#39;intestin. MF ne sont pas seulement responsables pour le dépôt de la matrice extracellulaire, mais par la réglementation paracrine peut influencer le transport de l&#39;électrolyte, la restitution et la fonction de barrière de l&#39;épithélium adjacente 1, 2. En outre, la MFS ont été montré à jouer un rôle clé dans l&#39;inflammation et les tissus remodelage 3, 4. Myofibroblastes sont un élément important du microenvironnement de la tumeur, où ils sont également connus comme les fibroblastes associés au cancer, et de contribuer à la croissance des cellules tumorales et servent comme une niche pour les cellules souches du cancer 3. De nouvelles données suggèrent que MFS peut également servir de cellules présentatrices d&#39;antigènes que locales. En outre, la fonction de FM des régulateurs importants de réponses immunitaires innées et adaptatives, produCing une variété de cytokines et de facteurs de croissance 5. Chez les individus en bonne santé, des cellules MFs On pense que les différencier des cellules souches mésenchymateuses et d&#39;exprimer sur leur surface cellulaire, le marqueur mésenchymateux, CD90 3, 5. Ces cellules sont également positives pour la vimentine, mais négatif pour épithéliale et le marqueur de cellules hématopoïétiques, EpCAM et CD45 respectivement. Les myofibroblastes sont proposés pour être une forme activée de fibroblastes et peuvent être distingués des fibroblastes non activées par l&#39;expression d&#39;α-SMA 5. Au cours de la dernière décennie, plusieurs approches pour l&#39;isolement de myofibroblastes de la muqueuse du côlon humain ont été publiés sur la base de la plupart du temps, la méthode décrite à l&#39;origine par Mahida et al., 8.5. Bien que des études particulières signalent des modes opératoires d&#39;isolement de divers muqueuse intestinale, aucun protocole universel pour l&#39;isolement de MFs à partir de plusieurs régions du tractus gastro-intestinal (par exemple, de l&#39;estomac, les petites et lmuqueuse intestinale ARGE) a été publié. Le protocole présenté ici a été testée et utilisée avec succès pour tous les trois type de tissu mentionné ci-dessus. . En outre, les procédures pour isoler les CM de la muqueuse gastro-intestinaux congelés ont pas été signalés. Ici, nous présentons une méthode optimisée, qui est basé sur la digestion enzymatique, et permet en même temps pour l&#39;isolement de la muqueuse de l&#39;intestin humain MF pour la culture et la cytométrie en flux analyse fraîchement digérés, monocellulaires, préparations muqueuses. Cette technique donne de manière fiable des cultures primaires avec un phénotype MF. En outre, les mêmes méthodes peuvent être utilisées pour isoler les CM à partir de spécimens congelés de tissus intestinaux et gastriques petits ainsi. Isolement de myofibroblastes de tissu frais GI a été décrite précédemment; cependant, l&#39;utilisation des échantillons congelés présente de nombreux avantages. A savoir, les chercheurs seront en mesure de recueillir et de stocker des tissus de tout nombre de collaborateurs à travers le monde qui ont la capacilité à expédier des échantillons de tissus congelés. En outre, les chercheurs peuvent trouver la collection de tissus enlevés de la salle d&#39;opération et / ou salle d&#39;endoscopie et le traitement immédiat du tissu pour l&#39;isolement en conflit avec leur horaire de l&#39;expérimentation en cours. Aussi, en raison de la nature imprévisible de la chirurgie, l&#39;obtention de tissus peut se produire très tard dans la journée, ce qui limitera le temps restant pour le tissu de traitement. Geler les tissus pour un traitement ultérieur sera atténuer ces défis. Enfin, ces méthodes ont été utilisées avec succès dans l&#39;isolement des myofibroblastes intestinale du côlon, de l&#39;estomac et dans les petits états pathologiques tels que le cancer colorectal et les maladies inflammatoires de l&#39;intestin.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacine HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Acides aminés non essentiels</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de&nbsp ; Clostridium histolyticum, Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de&nbsp ; Clostridium histolyticum, Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum, Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Solution de dissociation cellulaire Accumax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleDissociateur MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Filtre de cellules (70 &micro ; m)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Souris Anti-Humain Vimentin</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>Clone RV202</td></tr><tr><td>FITC Monoclonal Anti-Actine, &alpha ;-Muscle Lisse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Clone 1A4</td></tr><tr><td>APC Souris Anti-Humain CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Clone 5E10</td></tr></tbody></table>

isolement de cd 90+ fibroblastes / myofibroblastes de spécimens humains congelés gastro-intestinaux

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblastes / myofibroblastes (PDE) ont gagné une attention croissante pour leur rôle dans la pathogenèse et leurs contributions à la fois la cicatrisation des plaies et la promotion du microenvironnement de la tumeur. Bien qu&#39;il existe actuellement de nombreuses techniques pour l&#39;isolement de la MFS de (GI) tissus gastro-intestinaux, ce protocole introduit un élément original de l&#39;isolement de ces cellules stromales de tissu congelé. La congélation des échantillons de tissus de GI non seulement permet au chercheur d&#39;acquérir des échantillons de collaborateurs à travers le monde, les biobanques et les fournisseurs commerciaux, il permet également le traitement retardé d&#39;échantillons frais. Le protocole décrit va toujours produire des cellules fusiformes avec le phénotype caractéristique MF qui expriment les marqueurs CD90, α-SMA et la vimentine. Comme ces cellules sont dérivées à partir d&#39;échantillons de patients, l&#39;utilisation de cellules primaires confère également le bénéfice de la MFS imitant de près depuis des états pathologiques, à savoir le cancer et les maladies inflammatoires de l&#39;intestin. Cette technique a l&#39;abeillen validée dans l&#39;estomac, l&#39;intestin grêle et du côlon MF génération de culture primaire. MF cultures primaires peuvent être utilisés dans une vaste gamme d&#39;expériences sur un certain nombre de passage et leur pureté évaluées à la fois par immunocytochimie et cytométrie de flux.

En utilisant ce protocole de digestion enzymatique, nous avons toujours été en mesure d&#39;isoler et de cultiver CD90 + cellules stromales de la muqueuse intestinale MF population de GI spécimens et des biopsies (Figure 1) chirurgicales. Visible colonie prolifération MF a pu être observée le jour 2 - 5 après le semis suspensions cellulaires mononucléaires dans des plaques de 6 puits (figure 1A-B). Les cultures primaires MF atteignent ~ 50 - 7...

Ici, un protocole permettant d’isoler et d’établir des cultures primaires de fibroblastes/myofibroblastes (MF) à partir de cellules congelées produisant du tissu gastrique, de l’intestin grêle et du côlon avec un phénotype MF est présenté. Ces cellules expriment CD90, α-SMA et vimentine. Les MF peuvent être utilisés pour une variété de tests fonctionnels, y compris l’activité enzymatique et la production de cytokines.

Isolement de CD 90+ fibroblastes / myofibroblastes de spécimens humains congelés gastro-intestinaux


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

L’objectif global de cette méthode est d’isoler des myofibroblastes et des fibroblastes muqueux viables à partir d’échantillons de tissus gastro-intestinaux congelés, obtenus à l’origine à partir de biopsies ou d’échantillons chirurgicaux. L’isolement des myofibroblastes et des fibroblastes dans des tissus gastro-intestinaux correctement congelés permet de retarder le traitement d’échantillons frais. Cela facilite l’utilisation d’échantillons provenant de différentes sources dans le monde entier.Si le tissu a été conservé dans un milieu de congélation, placez le cryoflacon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que le tissu et le milieu soient décongelés. Pour quatre à cinq fragments de tissu de deux millimètres carrés, ajoutez 10 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium, fermez bien le couvercle et lavez le tissu en inversant doucement le tube une fois. Une fois que le tissu s’est stabilisé par gravité, jetez soigneusement le surnageant et lavez à nouveau les tissus.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de solution de collagénase dans le tube et transférez la suspension tissulaire dans un tube stérile exempt de DNase/RNase avec rotors intégrés. Fermez hermétiquement le tube du rotor et fixez-le à l’envers sur le manchon d’un dissociateur. Ensuite, exécutez le programme prédéfini H-tumor zero one.À la fin du programme, incubez la boue de tissu pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius, sous une rotation continue de 140 tr/min sur un agitateur. Ensuite, retournez le tube dans le dissociateur et exécutez le programme H-tumor zero two. Après la deuxième dissociation, ajoutez 50 microlitres de solution mère d’ADN à la solution cellulaire pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, sous une rotation continue de 60 tr/min sur l’agitateur.À la fin de la deuxième incubation, exécutez le programme H-tumor zero three. Maintenant, filtrez la suspension à travers une crépine stérile de 70 microns, dans un tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation. Jetez le surnageant et lavez la pastille cellulaire dans 25 millilitres de HBSS sans calcium ni magnésium deux fois, en comptant les cellules après le premier lavage.Pour la génération de cultures primaires de myofibroblastes, remettez la pastille en suspension dans un maximum de 4 x 10 à la 6e cellule par trois millilitres de milieu, et ensemencez-les dans des plaques traitées à 6 puits de culture cellulaire. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone, en changeant de milieu tous les deux à trois jours jusqu’à la formation d’une monocouche de myofibroblastes confluents à 80 %. Les cellules sont ensuite prêtes à être passées dans des flacons de culture T25.Pour analyser ou trier les myofibroblastes isolés par cytométrie en flux, mettez en plaque jusqu’à 2 x 10 à la 6e cellule par deux millilitres de milieu d’isolement des fibroblastes, dans une plaque à faible liaison de 24 puits pour une incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone. En utilisant ce protocole de digestion enzymatique, les myofibroblastes et les fibroblastes ont obtenu des populations de cellules stromales muqueuses CD-90 positives, peuvent être isolés de manière cohérente et cultivés à partir d’échantillons chirurgicaux gastro-intestinaux et de biopsies. Bien qu’il y ait une légère diminution de la viabilité de la préparation de cellules uniques de la muqueuse après la congélation des échantillons chirurgicaux, il y a une augmentation de l’efficacité de la génération de myofibroblastes et de cultures de fibroblastes en raison d’une diminution concomitante de la concentration bactérienne et fongique.Après deux passages, les myofibroblastes et les fibroblastes sont positifs pour CD90, le marqueur de la lignée mésenchymateuse, la vimentine et l’actine musculaire lisse, un marqueur des cellules mésenchymateuses différenciées, tel que déterminé à la fois par la microscopie confocale et l’analyse cytométrique en flux. Une fois maîtrisée, si elle est exécutée correctement, cette technique peut être complétée en environ deux heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de laisser le temps nécessaire pour que le tissu soit complètement digéré par voie enzymatique.Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et divers tests fonctionnels, peuvent être effectuées. Ils peuvent être utilisés pour déterminer la contribution des myofibroblastes et des fibroblastes à l’homéostasie de la muqueuse intestinale ainsi qu’à la pathologie des maladies gastro-intestinales inflammatoires aiguës et chroniques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les myofibroblastes et les fibroblastes des tissus gastro-intestinaux congelés.N’oubliez pas que les tissus humains non fixés peuvent être contaminés par des micro-organismes pathogènes. Des précautions universelles doivent toujours être prises lors de l’utilisation d’échantillons biologiques humains lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

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Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

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Isolement de myofibroblastes de Mouse et œsophage humain

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Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

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Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

Ce manuscrit décrit un protocole basé sur le FACS pour l’isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine. Il contourne la culture in vitro qui était inévitable avec le protocole d’isolement couramment utilisé par les cultures explant. Les sous-ensembles de fibroblastes qui émanent sont fonctionnellement distincts et présentent une expression et une localisation différentielles dans le derme.

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Découvrez l'isolement de fibroblastes et myofibroblastes CD90+ à partir de tissus gastro-intestinaux humains congelés. Cette méthode permet d'établir des cultures primaires viables pour l'étude de la réparation tissulaire et de la fibrose.

Isolement de CD 90+ fibroblastes / myofibroblastes de spécimens humains congelés gastro-intestinaux

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