Lancement de différenciation dans immortalisées cellules multipotentes progénitrices otique

L’objectif global de cette procédure est de différencier les cellules progénitrices otiques multipotentes immortalisées en types de cellules de l’oreille interne. Cette méthode peut donc nous aider à répondre à des questions clés dans la régénération auditive, telles que la façon dont les progéniteurs otiques peuvent devenir des cellules ciliées cochléaires ou des neurones auditifs. Il est important de noter que cette technique fournit un système cellulaire in vitro qui peut être utilisé en parallèle avec des systèmes modèles animaux de mammifères in vivo.

Azadeh Jadali, boursière postdoctorale dans mon laboratoire, ainsi que Zhichao Song et Alejandra Laureano, deux étudiantes diplômées du laboratoire, feront la démonstration de la procédure aujourd’hui. Après avoir préparé le milieu de culture comme décrit dans le protocole textuel, utilisez trois millilitres de ce liquide pour plaquer un fois dix au sixième progéniteur multipotent immortalisé, ou cellules IMOP, dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres. Incuber les cellules pendant cinq à sept jours à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone.

Tous les deux jours, doublez le volume de liquide dans la culture en ajoutant un milieu frais. Pour faire passer les cellules, transférez-les d’abord de la boîte de culture dans un tube conique de 15 millilitres. Et puis placez le tube, à 37 degrés Celsius, pendant cinq à dix minutes.

Pendant ce temps, attendez-vous à ce que les otosphères formant des colonies s’accumulent au fond de la sédimentation conique par gravité. Ensuite, aspirez le surnageant en faisant attention de ne pas perturber la palette. Remettez les otosphères en suspension en ajoutant 0,5 millilitre de solution saline équilibrée améliorée par EDTA préalablement préparée et améliorée par l’EDTA (HBSS), puis en pipetant de haut en bas deux à trois fois.

Pour faciliter la dissociation des otosphères en cellules uniques, placez la conique dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Faites tourner périodiquement la solution et, lorsqu’aucune otosphère n’est observée sous forme de sédiment au fond du tube, déplacez-la à température ambiante. Procédez à l’ajout de deux millilitres de milieu de culture dans les cellules pour neutraliser l’EDTA.

Et centrifugez-les à température ambiante pendant cinq minutes à 200 g. Ensuite, aspirez la solution EDTA diluée et lavez les cellules dans cinq millilitres de 1x PBS. Après avoir fait tourner les cellules en utilisant les mêmes paramètres, aspirez le 1x PBS.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de milieu de culture au conique. Et suspendez à nouveau la palette de cellules. Pour le comptage, diluez les cellules IMOP d’une à cent dans un milieu de culture.

Ajoutez ensuite 75 microlitres de cette solution dans une cassette positionnée dans un compteur de particules microfluidique et déterminez le nombre de cellules. Ensuite, plaquez une fois dix à six cellules IMOP dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres comme décrit précédemment et répétez cette procédure de passage tous les cinq à sept jours. Trois jours après le placage, utilisez la sédimentation par gravité pour recueillir les otosphères comme indiqué précédemment.

Procédez à l’aspiration du surnageant. Et remettez doucement les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu de différenciation épithéliale sensorielle. Ensuite, utilisez une pipette à pores larges de dix millilitres pour transférer les otosphères dans une nouvelle boîte de 60 millimètres.

Différencier les otosphères pendant une dizaine de jours. Ajouter deux millilitres de milieu de différenciation frais à la culture tous les deux jours. Ensuite, récoltez à nouveau les otosphères par sédimentation gravitaire.

Et aspirez le médium usé. Ensuite, fixez les otosphères dans quatre pour cent de paraformaldéhyde dans 1x PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Retirez ensuite la solution de formaldéhyde et lavez les cellules dans 1x PBS contenant 0,1 % de Triton x100.

Procédez en bloquant les otosphères dans 1x PBS complété par dix pour cent de sérum de chèvre et 0,1 pour cent de Triton x100. Au bout d’une heure, remplacez le tampon bloquant par celui contenant la dilution appropriée de l’anticorps Cdkn1b ou CDH1. Ensuite, incubez les cellules dans l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Et le lendemain, continuez l’immunocoloration à l’aide d’anticorps secondaires marqués par fluorescence, la phalloïdine et le Hoechst, comme décrit ailleurs. Pour préparer l’imagerie, placez le support de montage sur une lame de verre. Et puis introduisez les otosphères colorées dans le support.

Ensuite, posez une lamelle sur l’échantillon. Après avoir laissé sécher le support de montage pendant la nuit à quatre degrés Celsius, placez la lame sur la platine d’un microscope inversé équipé d’une caméra CCD 16 bits. À l’aide de l’objectif d’air 20x 0,75, acquérez des images d’épifluorescence en collectant des données à partir des canaux bleu, vert, rouge et infrarouge.

Tout d’abord, nettoyez les lamelles de verre rondes en les plaçant dans une plaque stérile de 100 millimètres et en les immergeant dans de l’éthanol à 70 %. Agitez doucement les lamelles pour vous assurer qu’elles sont couvertes et laissez le plat à température ambiante pendant dix minutes. Ensuite, rincez les lamelles trois fois dans du PBS stérile 1x, puis une fois avec de l’eau stérile.

Laissez ensuite sécher la housse en les exposant à la lumière UV dans une hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes. Pour une utilisation immédiate, placez une lamelle stérile dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Et secouez doucement la plaque pour vous assurer que tous les lamelles reposent à plat.

Ensuite, enduisez les lamelles en ajoutant 0,25 millilitre de 1x PBS contenant 10 microgames par millilitre de poly D lysine dans chaque puits. Après que la plaque ait incubé pendant une heure à 37 degrés Celsius, retirez la solution de lysine poly D et lavez les puits trois fois avec du PBS stérile 1x. Une fois que le liquide du dernier lavage a été aspiré, introduisez 0,25 millilitre de 1x PBS contenant 10 microgrammes par millilitre de laminine, dans chacun des 24 puits.

Après avoir incubé la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius, aspirez la solution de laminin, puis lavez chaque puits avec un millilitre de 1x PBS trois fois, mais laissez le PBS du dernier lavage dans les puits jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être plaquées. Pour commencer la différenciation neuronale, comptez les cellules des otosphères dissociées comme décrit précédemment. Et puis les remettre en suspension dans un milieu de différenciation neuronale préchauffé.

Procédez en enchaînant entre un et un point cinq fois dix jusqu’à la cinquième cellule IMOP dans chaque puits de la plaque contenant les lamelles de recouvrement enrobées. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Remplacement du milieu de différenciation neuronale tous les deux jours.

Après sept jours, aspirez le milieu et fixez les cellules, qui doivent être attachées aux lamelles, en ajoutant quatre pour cent de formaldéhyde dans chaque puits. Et de les laisser 15 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez le formaldéhyde et lavez les cellules une fois dans 1x PBS contenant 0,1 % de Triton x100.

Retirez ensuite le tampon de lavage. Et ajoutez un tampon de blocage composé de 1x PBS contenant dix pour cent de sérum de chèvre normal, et 0,1 pour cent de Triton x100 à chaque puits. Laissez les cellules pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, retirez le liquide et remplacez-le par un tampon de blocage contenant la dilution appropriée de l’anticorps Cdkn1b ou Tubb3. Après une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius, lavez une fois les cellules avec 1x PBS contenant un pour cent de Triton x100. Et puis procédez à l’immunocoloration comme décrit précédemment.

Une fois la coloration terminée, effectuez un dernier lavage en ajoutant 1x PBS dans les puits. Pour les préparer à l’analyse, retirez les lamelles de protection auxquelles sont fixées les cellules colorées de la plaque à 24 puits. Et placez-les sur un support de montage sur une lame de verre.

Après avoir laissé le support de montage sécher pendant la nuit à quatre degrés Celsius, acquérir des images d’épifluorescence comme décrit précédemment. Les otosphères cultivées pendant dix jours dans un milieu de différenciation épithéliale présentent une expression accrue de Cdkn1b, un inhibiteur de kinase dépendant du cycle, et un marqueur de la différenciation de l’oreille interne, par rapport aux cellules indifférenciées. Ici, la coloration de Hoechst a noté les noyaux cellulaires.

Ces cellules présentent également des changements morphologiques dans les filaments d’actine et les régions d’adhésion cellule-cellule caractéristiques des épithéliums. Indiqué par l’apparition de la phalloïdine et le marquage de Cdh1 à la périphérie des cellules. Les otosphères peuvent également être dirigées pour former des neurones.

Cette image en champ clair montre qu’après sept jours dans un milieu de différenciation neuronale, les cellules IMOP présentent des neurites. L’immunomarquage de ces cellules avec un marqueur neuronal Tubb3 confirme leur différenciation. Et ils expriment également de manière robuste Cdkn1b.

Cela suggère que le double signal Tubb3, Cdkn1b peut être utilisé comme indicateur de la différenciation neuronale dans les cellules IMOP. Les cellules différenciées et indifférenciées en fluorescence Cdkn1b ont également été normalisées en déterminant leur rapport avec le signal de Hoechst, fournissant des résultats quantitatifs. Les histogrammes de ces données sont présentés ici.

Les pourcentages de cellules IMOP indifférenciées et différenciées au-dessus d’un seuil prédéterminé de Cdkn1b normalisé sont présentés dans ces graphiques. Les deux populations différenciées présentent une augmentation significative du pourcentage de cellules exprimant Cdkn1b par rapport aux témoins indifférenciés, confirmant la différenciation suggérée par l’immunofluorescence. Une fois maîtrisées, la culture et la différenciation de routine des cellules IMOP peuvent être effectuées en 30 minutes, si elles sont effectuées correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’initier la différenciation des cellules IMOP. Merci d’avoir regardé cette vidéo. Et bonne chance dans vos expériences.