Name: Lancement de différenciation dans immortalisées cellules multipotentes progénitrices otique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Découvrez la différenciation des cellules progénitrices otiques immortalisées (iMOP) en types cellulaires de l'oreille interne. Cette méthode permet d'étudier la régénération auditive et le développement des cellules ciliées cochléaires.

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Les travaux ont été soutenus en partie par le Fonds de dotation de la chaire de développement du corps professoral Duncan et Nancy MacMillan (K.Y.K.), la subvention de recherche biomédicale Busch (K.Y.K.) et la subvention de développement du corps professoral Rutgers (K.Y.K.).

1. Maintenir autorenouvellement dans les cellules de IMOP <ol><li> Préparer IMOP milieux de culture: DMEM / F12, supplément 1X B27, 25 pg / ml carbénécilline et 20 ng / ml de bFGF. Faire 50 ml de IMOP milieux de culture en utilisant des réactifs stériles. Réchauffez 49 ml de DMEM / F12 dans un 50 ml conique dans un bain d&#39;eau à 37 °. <ol><li> Thaw 50X B27 supplément et 100 mg / ml carbénécilline aliquotes stérilisées par filtration, pendant 5 min dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Dégeler 100 pg / ml de bFGF aliquote à TA. Ajouter 1 ml 50X B27, 10 pl de 100 pg / ml de bFGF et 12,5 pi de 100 mg / ml carbénécilline dans DMEM / F12. </li></ol></li><li> Utilisez 3 ml de médias dans une boîte de culture de tissu de 60 mm pour la culture de cellules IMOP. Ajouter un milieu frais à des cultures tous les deux jours en doublant le volume des médias. Assurez-vous que la concentration de bFGF ne chute pas en dessous de 5 ng / ml. <ol><li> Cellules IMOP de culture à 37 ° C avec 5% de CO 2. Les cellules Passage après 5 - 7 jours en culture comme indiqué dans les étapes ci-dessous. La culture de transfert à un 15ml conique aide d&#39;une pipette de 10 ml. </li></ol></li><li> Ajouter 1 mM d&#39;EDTA dans du HBSS en diluant 0,1 ml de pH 8,0 EDTA 0,5 M dans 50 ml de HBSS. Préchauffer EDTA 1 mM fait dans HBSS dans un bain d&#39;eau à 37 C °. </li><li> Récolte des cellules par sédimentation par gravité ou par centrifugation à 200 g pendant 5 min. à la température ambiante. Pour sédimentation par gravité, placez le conique de 15 ml contenant les cultures dans le 37 ° C incubateur pour 5 - 10 min. Après ce temps, observer les otospheres recueillir au bas de la 15 ml conique. REMARQUE: la force centrifuge excessive peut causer des dommages aux cellules. </li><li> Soigneusement aspiration passé multimédia à l&#39;aide de 2 ml d&#39;aspiration pipette sans perturber le culot cellulaire. Ajouter 0,5 ml de solution 1 mM EDTA HBSS préchauffée à culot cellulaire. Avec une pipette P1000, pipeter doucement monter et descendre 2 - 3 fois. Placer conique à 37 ° C et incuber pendant &lt;5 min pour faciliter la dissociation dans des cellules individuelles. </li><li> Mélanger doucement la solution cellulaire pour déterminer si otospheres sont dissociés. Si aucun otosphères sédimentent au fond du cône, les cellules sont dissociées. Le temps d&#39;incubation peut varier. REMARQUE: prolongée incubation avec EDTA entraînera la mort cellulaire excessive. </li><li> Éliminer les cellules de 37 ° C, ajouter 2 ml de médias pour neutraliser et diluer le EDTA. Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer dilué EDTA en utilisant une pipette de 2 ml aspiration et ajouter 5 ml de PBS 1X pour laver les cellules. </li><li> Spin cellules vers le bas à 200 g pendant 5 min à température ambiante et aspirer à 1X PBS en utilisant une pipette de 2 ml d&#39;aspiration. Reprendre les cellules à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000 dans 0,5 ml de IMOP milieux de culture par pipetage doucement monter et descendre 2 - 3 fois. </li><li> Compter les cellules en utilisant un compteur de particules microfluidique avec les cassettes appropriées 28. Une plaque de cellules confluentes IMOP contiendra ~ 6 X10 6 cellules. Diluer cellules 1: 100 dans les médias et ajouter 75 ul de solution de cellules dans la cassette pour le comptage. Plate 1 x 10 6 cellules dans une boîte de 6 cm dans IMOP culture médias (~ 1: 10 dilution). IMOPs Passage toutes les 5 - 7 jours. REMARQUE: Les cellules qui forment de grandes otospheres ou joindre au fond de la boîte de culture de tissus permettra de différencier. Les cellules seront également meurent si les cultures sont plus confluentes. </li></ol> 2. congélation et la décongélation de cellules IMOP <ol><li> Préparer milieu de congélation et décongélation synthétique par la solution d&#39;équilibrage à 4 ° C avant la congélation des cellules. </li><li> Recueillir des cellules à partir d&#39;un cm plat de cellules confluentes IMOP 6. Utiliser une pipette de 10 ml et les cellules de transfert (~ 6 - 8 x 10 6 cellules) dans un 15 ml conique. </li><li> Récolte des cellules par sédimentation par gravité ou par centrifugation à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Si les otospheres sont petites, les cellules ne déposent par gravité sédimentation. Facultatif: Compter les cellules à l&#39;aide de l&#39;étape 1.9 pour déterminer le nombre total de cellules. </li><li> Aspirer passé médias en utilisant une pipette 2 ml d&#39;aspiration tout en laissant le culot cellulaire lâche derrière. </li><li> Ajouter 0,25 ml de milieu de congélation synthétiques pour resuspendre CElls à une densité de 5 x 10 ~ 5 à 3 x 10 6 cellules / ml. Pipette en douceur les cellules avec une pipette P1000. Transférer la suspension cellulaire dans des flacons cryogéniques aide d&#39;une pipette P1000 avec 1 ml pointe filtrés. </li><li> Placer les flacons dans un récipient de congélation sans alcool et placer le récipient de congélation à -80 ° C pour réduire la température de 1 ° C par minute jusqu&#39;à ce que la température atteint -80 ° C. </li><li> Pour le stockage à long terme de cellules, transférer les flacons à la phase vapeur d&#39;un liquide réservoir de stockage d&#39;azote. Pour dégeler les cellules de la culture, équilibrer flacon cryogénique contenant les cellules congelées à -80 ° C. </li><li> Milieux de culture IMOP Pré-au chaud dans un bain-marie à 37 °. </li><li> Décongeler rapidement le flacon congelé en le faisant tourner le fond du flacon dans un bain d&#39;eau à 37 C °. Ajouter 1 ml de milieux de culture préchauffé IMOP à cellules décongelées une fois que le cristal de glace dernière disparaît. Cellules dans un ml conique 15 de transfert et d&#39;en ajouter 4 ml de IMOP milieux de culture </li><li> Faites tourner la 15 ml conique pendant 5 min. à 200 xg et aspirer les milieux épuisés. Remettre en suspension les cellules dans 2 ml de IMOP milieux de culture et les cellules de la plaque dans une boîte de 6 cm. Incuber les cultures à 37 ° C avec 5% de CO 2 pour l&#39;expansion. </li></ol> 3. différenciation des cellules IMOP dans sensorielle épithéliums <ol><li> Préparer 50 ml de IMOP médias de différenciation de l&#39;épithélium sensoriel: DMEM / F12, supplément 1X B27, 25 pg / ml carbénécilline. Faire 50 ml de IMOP sensorielle médias de différenciation de l&#39;épithélium. Réchauffez 49 ml de DMEM / F12 dans un 50 ml conique dans un bain d&#39;eau à 37 °. Thaw 50X supplément de B27 et 100 mg / ml carbénécilline aliquotes pour 5 min. C dans un bain d&#39;eau à 37 °. Ajouter 1 ml 50X B27 et 12,5 pi de 100 mg / ml carbénécilline dans DMEM / F12. </li><li> Pour la récolte, dissocier, remettre en suspension et de compter les cellules Répétez les étapes 1.4 à 1.9 </li><li> Planche 1 x 10 6 cellules dans une boîte de 6 cm au Jour -3 utilisant IMOP milieux de culture. Le jour 0, les cultures de transfert en utilisant une pipette de 10 ml dans un 15 ml conique. Recueillir l&#39;otosphères par sédimentation par gravité comme indiqué dans l&#39;étape 1.6. Aspirer passé support à l&#39;aide de 2 ml d&#39;une pipette d&#39;aspiration et de laisser les otospheres sur le fond de la forme conique. </li><li> Ajouter délicatement dans 2 ml de sensorielle médias de différenciation de l&#39;épithélium. Transfert otospheres à un plat de 6 cm en utilisant un grand alésage 10 ml pipette. NOTE: cisaillement mécanique de pipetage dure peut dissocier les cellules des otospheres. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu frais de différenciation de l&#39;épithélium sensoriel aux cultures tous les autres jours. Si nécessaire, les cellules peuvent être recueillies par sédimentation par gravité et remplacé médias. </li><li> Recueillir otospheres au jour 10 par le transfert à une conique 15 ml et en permettant aux otospheres dans les sédiments comme indiqué dans l&#39;étape 1.6.Aspirate les médias passé à utiliser un 2 ml d&#39;aspiration pipette et laissent les otospheres intact. </li><li> Fixer otospheres par incubation à 4% de formaldehyde dans du PBS 1X pendant 15 minutes à température ambiante. Enlever la solution de formaldéhyde, laver otospheres avec un tampon de lavage (PBS 1X contenant 0,1% de Triton X-100) avant l&#39;incubation dans un tampon de blocage (PBS 1X contenant 10% de sérum de chèvre normal et 0,1% de Triton X-100) pendant 1 heure. <ol><li> Remplacer tampon et incuber des échantillons dans un tampon bloquant avec l&#39;anticorps dilué. Incuber à 4 ° C. Laver les échantillons avec 1X PBS contenant 0,1% de Triton X-100 sous réserve de la otosphere à immunocoloration 27. Otospheres de transfert dans PBS 1X et place otospheres dans les médias sur une lame de verre à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000. Mettez une lamelle sur l&#39;échantillon et permettent milieux de montage à sec à 4 ° C. </li></ol></li><li> Acquérir des images à épifluorescence en utilisant une configuration de microscope inversé équipé d&#39;une caméra CCD de 16 bits et d&#39;un air 20X 0,75 NA ou un objectif 40X 1,3 à immersion d&#39;huile. Recueillir la fluorescence de différents canaux de couleur en utilisant les longueurs d&#39;onde cotée (excitation et d&#39;émission): bleu (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), le vert (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rouge (562 ± 20 nm / et 625 ± 20 nm) et infrarouge (628 ± 20 nm / 20 et 692 ±nm). </li></ol> 4. Dosage EdU Incorporation <ol><li> Le jour -3, plaque 1 x 10 6 cellules IMOP dans un plat de 6 cm. Trois jours plus tard, le jour 0, récolte, dissocier, remettre en suspension et de compter les cellules en répétant les étapes 1,4-1,9. </li><li> Plate 2,5 x 10 5 cellules dans des milieux de culture de IMOP et 5 x10 5 cellules sensorielles médias de différenciation de l&#39;épithélium dans différents puits d&#39;une plaque à 6 puits. </li><li> Déterminer le pourcentage de cellules en phase S par Edu incorporation au jour 3 en utilisant un dosage d&#39;incorporation EdU <ol><li> Ajouter EdU actions directement aux cultures IMOP pour obtenir une concentration finale de 1 uM EdU dans le milieu de culture. </li><li> Incuber EdU dans des cultures de IMOP pendant 2 heures et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2. Harvest, dissocier et de recueillir des cellules répétez les étapes 1,4-1,9. Ajouter à 4% de formaldehyde dans du PBS 1X pendant 15 minutes. à la température ambiante pour fixer les cellules. Récolte des cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à température ambiante. Enlever la solution de formaldéhyde et properly disposer. </li><li> Étiquette de noyaux de cellules avec Hoechst et incorporés EdU fluorescence verte avec de l&#39;azoture de colorant selon le protocole du fabricant. REMARQUE: Tous les lavages sont effectués avec du PBS 1X, 3% de BSA et 0,1% de cellules Tween 20. Laver avec 1X PBS deux fois. </li><li> Cellules de montage sur une diapositive à l&#39;aide antifade réactif et placer un verre de 1,5 couvercle sur l&#39;échantillon. Acquérir les images fluorescentes de cellules marquées à l&#39;aide d&#39;un microscope à épifluorescence. </li></ol></li></ol> 5. Différencier Neurones IMOP-Derived <ol><li> Faire 50 ml de milieu de différenciation neuronale: médias Neurobasal, 1X supplément B27, 2 mM de L-glutamine. Thaw bouteille de 50X B27 et 200 mM de L-glutamine en 37 ° C bain d&#39;eau pendant 5 min. Ajouter 1 ml 50X B27 et 0,5 ml de 200 mM de L-glutamine à 48,5 ml de milieu Neurobasal. </li><li> Manteau lamelle en plaçant 12 mm rondes 1,5 lamelles de verre dans un 10 cm plaque stérile et ajouter 70% de EtOH à la plaque pour stériliser et nettoyer les lamelles. </li><li> Agiter doucement l&#39;anserslips pour vous assurer qu&#39;ils sont couverts dans l&#39;éthanol. Laissez la plaque pendant 10 min à température ambiante. Rincer les lamelles 3 fois avec stérile PBS 1X pour laver l&#39;éthanol restant. Rincer la lamelle une fois avec H 2 0 stérile pour laver restant PBS 1X. </li><li> Aspirer le H 2 0 2 ml en utilisant une pipette d&#39;aspiration et de laisser les lamelles sec. Exposer les lamelles à la lumière UV dans la culture de tissus hotte pendant 15 min. Magasin lamelles de dans un environnement stérile, si elle est utilisée immédiatement. </li><li> Placez une lamelle 12 mm rond dans chaque puits d&#39;une plaque de 24 puits. Agiter doucement la plaque pour garantir que les lamelles reposent à plat sur le fond du puits. </li><li> Thaw 2 mg / ml de poly-D-lysine solution stock à RT et diluer à 10 pg / ml concentration poly-D-lysine dans PBS 1X. Ajouter 0,25 ml de 10 pg / ml de poly-D-lysine dans les puits. Laissez la plaque dans l&#39;incubateur à 37 ° pendant 1 heure. </li><li> Laver les puits 3 fois avec stérile PBS 1X. Thaw 10 mg ml de solution / boursier laminine à la température ambiante et diluer à 10 ug / ml dans du PBS 1X. Ajouter 0,25 ml de 10 pg / ml de laminine solution de travail dans un seul puits d&#39;une plaque 24 multipuits. Incuber la plaque à 37 ° C incubateur. Aspirer la solution de laminine à l&#39;aide d&#39;une pipette 2 ml d&#39;aspiration. </li><li> Laver la lamelle 3 fois avec du PBS 1X en ajoutant dans 1 ml de PBS 1X avec une pipette P1000 et l&#39;élimination du PBS 1X par aspiration avec une pipette de 2 ml d&#39;aspiration. Laissez 1X PBS à partir du dernier lavage dans le puits jusqu&#39;à ce que les cellules sont prêtes à être plaqué. Initier la différenciation neuronale par la récolte, la dissociation et le comptage des cellules dans les étapes 1.4-1.9.Plate cellules 1 x 10 6 dans un plat de 6 cm à Jour -3. </li><li> Au jour 0, la récolte, de dissocier et de compter les cellules en répétant 1,4-1,9. Graine 1 x 10 5 à 1,5 x 10 5 cellules dans 0,5 ml IMOP multimédias différenciation neuronale préchauffé par puits dans une boîte de 24 puits multiples. Aspirer et ajouter des médias de la différenciation neuronale préchauffé à des cultures tous les autres jours. </li><li> Fixer neurones IMOP dérivés de formaldéhyde 4% pendant 15 min. unt RT sur la Journée solution de formaldéhyde 7. Retirer, laver neurones IMOP dérivés avec un tampon de lavage (PBS 1X contenant 0,1% de Triton X-100) avant incubation dans un tampon de blocage (PBS 1X contenant 10% de sérum de chèvre normal et 0,1% de Triton X-100) pendant 1 heure. <ol><li> Remplacer tampon et incuber des échantillons dans un tampon bloquant avec l&#39;anticorps dilué. Incuber à 4 ° C. Laver les échantillons avec 1X PBS contenant 0,1% de Triton X-100 cellules soumises à immunocoloration 27. Laver la lamelle avec du PBS 1X avant de placer sur des supports de montage. Permettre aux médias de montage à sec à 4 ° C avant d&#39;acquérir des images à épifluorescence comme indiqué dans l&#39;étape 3.8. </li></ol></li></ol>

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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Suivi Cultures IMOP Un protocole pour le maintien de l&#39;auto-renouvellement et la promotion de la différenciation d&#39;une lignée cellulaire de IMOP roman est décrit et formats de placage supplémentaires sont inclus (tableau 1). Plusieurs étapes critiques qui aident à la dilatation de routine et la différenciation des cellules IMOP sont notés. Semblable à des cultures de cellules souches pluripotentes, cellules IMOP ont théoriquement une durée de vie ind...

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Jadali Azadeh
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Azadeh Jadali

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Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Les organes de l’oreille interne, la cochlée, l’utricule, le saccule et trois canaux semi-circulaires, interviennent dans la capacité d’entendre et d’équilibrer. À l’intérieur de la cochlée, les cellules ciliées convertissent les sons en signaux électriques qui sont relayés aux neurones du ganglion spiralé (SGN). Les SGN déclenchent des potentiels d’action pour propager les signaux neuronaux à travers le circuit auditif. Les mutations génétiques, les médicaments ototoxiques et l’exposition à des sons forts contribuent à la mort des cellules ciliées et du SGN qui entraînent une perte auditive1 à 4. Une fois perdues, ces cellules ne sont pas remplacées. L’utilisation d’iPSC et d’ESC pour générer des cellules ciliées naissantes ou SGN est très prometteuse pour les thérapies de remplacement des cellules de l’oreille interne5-8. Une série de progrès a montré que les cellules souches pluripotentes et les progéniteurs dérivés de l’oreille interne peuvent se différencier en cellules ciliées et en SGN à différents stades de maturité. Les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) de mammifères peuvent être utilisées pour générer des cellules ciliées fonctionnelles et des SGN9-11. Il a également été démontré que les cellules souches et les cellules progénitrices dérivées de l’oreille interne des mammifères forment des cellules ciliées et des neurones avec les propriétés de leurs homologues cellulaires in vivo 12-16. 
L’utilisation de progéniteurs otiques iPSC ou dérivés d’ESC pour remplacer les cellules ciliées et les SGN perdus nécessite une différenciation efficace. Une différenciation inappropriée ou une prolifération continue de progéniteurs dérivés de tiges greffées dans l’oreille interne peut exacerber la fonction de l’oreille interne et présenter un risque tumorigène tel que la formation de tératomes dans l’oreille interne17. Il est clairement nécessaire de développer des conditions de culture et de comprendre la différenciation des progéniteurs otiques. L’une des stratégies de développement de ces méthodes consiste à récapituler les décisions relatives au destin cellulaire prises par les progéniteurs neurosensoriels au cours du développement de l’oreille interne. Les protocoles qui empêchent la prolifération et dirigent les progéniteurs otiques dans les cellules ciliées ou les SGN contribueront à améliorer l’innocuité ainsi que l’efficacité des thérapies de remplacement. 
Au cours du développement, l’oreille interne commence par l’épaississement de l’ectoderme de surface dans une région restreinte entre les rhombomères 5 et 6 pour devenir la placode otique. Lorsque la plaque otique s’invagine pour former une cupule otique, un ensemble de cellules dans la région antérieure de la cupule otique donne naissance au domaine neuro-sensori-compétent (NSD), qui contient des précurseurs des cellules ciliées et des neurones de l’oreille interne18. Des études de cartographie du destin de souris, de poulets et de poissons-zèbres en développement dans l’oreille interne suggèrent de multiples populations de progéniteurs neurosensoriels qui donnent naissance aux cellules ciliées sensorielles, entourant les cellules de soutien et les neurones otiques19-22. Le facteur de transcription du groupe à haute mobilité, Sox2, a été impliqué dans la spécification des cellules sensorielles et utilisé comme marqueur pour les progéniteurs de l’oreille interne23,24. Les mutations hypomorphes qui diminuent les niveaux d’expression de Sox2 dans l’oreille interne entraînent la perte des cellules ciliées, des cellules de soutien et des SGN dans la cochlée25,26. 
Pour étudier les cellules progénitrices otiques subissant des décisions relatives au destin cellulaire, une lignée cellulaire de progéniteur otique multipotent immortalisé (iMOP) restreinte au destin à partir de progéniteurs cochléaires exprimant Sox2 a été précédemment établie. Les cellules iMOP étaient à l’origine dérivées de la cochlée embryonnaire E12.5-13.5 et infectées par un rétrovirus c-Myc27. Les cellules iMOP peuvent proliférer continuellement en tant que cellules formant des colonies appelées otosphères et ont la capacité de se différencier en cellules ciliées, cellules de soutien et SGN27. La compréhension de la capacité des cellules iMOP à se différencier en lignées otiques distinctes permet d’appliquer ces résultats pour générer efficacement des cellules ciliées et des SGN dérivés d’iPSC ou d’ESC. Des protocoles de différenciation efficaces ouvriront de nouvelles voies pour les thérapies de remplacement cellulaire des maladies de l’oreille interne qui sont récalcitrantes aux traitements conventionnels. Un problème crucial dans la génération de cellules otiques par culture cellulaire in vitro est de disposer de marqueurs de différenciation qui aident à déterminer si les cellules sont en cours de différenciation. Cdkn1b (p27KIP) a été largement utilisé comme marqueur précoce de la différenciation dans l’oreille interne en développement, cependant, l’expression de Cdkn1b dans les cellules iMOP et sa corrélation avec la différenciation n’ont pas été abordées. Dans cette étude, les conditions de culture actuelles et la corrélation entre l’expression de Cdkn1b et d’autres marqueurs de la différenciation d’iMOP sont décrites.

<table><tbody><tr><td>CoolCell LX Contenants de congélation cellulaire sans alcool</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques (2 ml)&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>430654</td><td></td></tr><tr><td>1,5 Epaisseur (ronde 12 mm)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium Life</td><td>Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de B27 (50X) Serum Free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Stocké sous forme de 1 ml d’aliquotes de</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Stocké sous forme d’aliquotes de 5 ml</td></tr><tr><td>Laminine de souris naturelle Life</td><td>Technologies</td><td>23017-015</td><td>Stocké sous forme d’aliquotes de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Synth-A-Freeze Milieu de cryoconservation</td><td>Life Technologies</td><td>A12542-01</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>47743-736</td><td>Stocké sous forme de 10 mg/ml 100 &micro ; l aliquotes</td></tr><tr><td>Moxi Z Mini Compteur de Cellules Automatisé</td><td>Orflo&nbsp ;</td><td>MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z Cassette Type S</td><td>Orflo&nbsp ;</td><td>MXC002</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes murins recombinants, basique (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>remis en suspension dans 0,1 % de BSA dans H20 et stocké sous forme d’aliquotes de 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td>Remis en suspension dans 1X PBS et stocké sous forme de 10 mg/ml 100 &micro ; l aliquotes</td></tr><tr><td>Carbenicilline, sel disodique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2648-1</td><td>Remise en suspension dans 10 mM Hepes pH 7,4 et stockée sous forme d’aliquotes de 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Pipette de 5 ml emballée individuellement (200/caisse)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de 10 ml emballée individuellement (200/caisse)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 24 puits traitée Biolite</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits traitée Biolite Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>130184&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Plat de 6 cm traité pour culture tissulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130181&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Millex Seringue stérile PVDF Taille des pores : 0,22 &mu ; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pointes de pipette filtrantes 0,1 - 10 &mu ; l embout de filtre allongé</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pointes de pipette de filtre 1 - 20 &mu ; l embout de filtre</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne embouts de pipette de filtre 1 - 200 &mu ; l&nbsp ; pointe de filtre</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne pointes de pipette de filtre 101 - 1000 &mu ; l embout filtrant</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes coniques stériles 20 sacs de 25 tubes (500 tubes)</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes coniques stériles 20 sacs de 25 tubes (500 tubes)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr></tbody></table>

lancement de différenciation dans immortalisées cellules multipotentes progénitrices otique

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

L’utilisation de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) ou de cellules souches embryonnaires (ESC) pour les thérapies de remplacement cellulaire est très prometteuse. Plusieurs limites, notamment de faibles rendements et des populations hétérogènes de cellules différenciées, entravent la progression des thérapies par cellules souches. Une lignée cellulaire de progéniteur otique multipotent immortalisé (iMOP) a été générée pour faciliter la différenciation efficace d’un grand nombre de cellules ciliées fonctionnelles et de neurones ganglionnaires spiralés (SGN) pour les thérapies de remplacement des cellules de l’oreille interne. À partir de cultures dissociées de cellules iMOP uniques, des protocoles favorisant la sortie du cycle cellulaire et la différenciation par retrait du facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF) ont été décrits. Une diminution significative des cellules proliférantes après le retrait du bFGF a été confirmée à l’aide d’un test de prolifération cellulaire EdU. Parallèlement à une diminution de la prolifération, la différenciation réussie a entraîné l’expression de marqueurs moléculaires et des changements morphologiques. L’immunocoloration de Cdkn1b (p27KIP) et de Cdh1 (E-cadhérine) dans les otosphères dérivées d’iMOP a été utilisée comme indicateur de différenciation en épithélium sensoriel de l’oreille interne, tandis que l’immunocoloration de Cdkn1b et Tubb3 (β-tubuline neuronale) a été utilisée pour identifier les neurones dérivés d’iMOP. L’utilisation des cellules iMOP fournit un outil important pour comprendre les décisions relatives au destin cellulaire prises par les progéniteurs neurosensoriels de l’oreille interne et aidera à développer des protocoles pour générer un grand nombre de cellules ciliées et de SGN dérivés d’iPSC ou d’ESC. Ces méthodes accéléreront les efforts de génération de cellules otiques pour les thérapies de remplacement.

bFGF Retrait Diminutions prolifération dans des cellules IMOP Pour diminuer la capacité de prolifération des cellules IMOP et initier la différenciation des cellules IMOP, le bFGF a été retiré à partir de la culture. Pour confirmer que le retrait du facteur de croissance diminue la prolifération, EdU incorporation a été utilisé comme un test de prolifération. Le pourcentage de cellules qui a incorporé de otosp...

Les protocoles actuels pour maintenir les cellules progénitrices otiques multipotentes immortalisées (iMOP) et la différenciation otique sont décrits. Les conditions de culture et les marqueurs moléculaires qui indiquent la différenciation en épithélium sensoriel et neurones du ganglion spiralé (SGN) sont mis en évidence.

Lancement de différenciation dans immortalisées cellules multipotentes progénitrices otique

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

L’objectif global de cette procédure est de différencier les cellules progénitrices otiques multipotentes immortalisées en types de cellules de l’oreille interne. Cette méthode peut donc nous aider à répondre à des questions clés dans la régénération auditive, telles que la façon dont les progéniteurs otiques peuvent devenir des cellules ciliées cochléaires ou des neurones auditifs. Il est important de noter que cette technique fournit un système cellulaire in vitro qui peut être utilisé en parallèle avec des systèmes modèles animaux de mammifères in vivo.Azadeh Jadali, boursière postdoctorale dans mon laboratoire, ainsi que Zhichao Song et Alejandra Laureano, deux étudiantes diplômées du laboratoire, feront la démonstration de la procédure aujourd’hui. Après avoir préparé le milieu de culture comme décrit dans le protocole textuel, utilisez trois millilitres de ce liquide pour plaquer un fois dix au sixième progéniteur multipotent immortalisé, ou cellules IMOP, dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres. Incuber les cellules pendant cinq à sept jours à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone.Tous les deux jours, doublez le volume de liquide dans la culture en ajoutant un milieu frais. Pour faire passer les cellules, transférez-les d’abord de la boîte de culture dans un tube conique de 15 millilitres. Et puis placez le tube, à 37 degrés Celsius, pendant cinq à dix minutes.Pendant ce temps, attendez-vous à ce que les otosphères formant des colonies s’accumulent au fond de la sédimentation conique par gravité. Ensuite, aspirez le surnageant en faisant attention de ne pas perturber la palette. Remettez les otosphères en suspension en ajoutant 0,5 millilitre de solution saline équilibrée améliorée par EDTA préalablement préparée et améliorée par l’EDTA (HBSS), puis en pipetant de haut en bas deux à trois fois.Pour faciliter la dissociation des otosphères en cellules uniques, placez la conique dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Faites tourner périodiquement la solution et, lorsqu’aucune otosphère n’est observée sous forme de sédiment au fond du tube, déplacez-la à température ambiante. Procédez à l’ajout de deux millilitres de milieu de culture dans les cellules pour neutraliser l’EDTA.Et centrifugez-les à température ambiante pendant cinq minutes à 200 g. Ensuite, aspirez la solution EDTA diluée et lavez les cellules dans cinq millilitres de 1x PBS. Après avoir fait tourner les cellules en utilisant les mêmes paramètres, aspirez le 1x PBS.Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de milieu de culture au conique. Et suspendez à nouveau la palette de cellules. Pour le comptage, diluez les cellules IMOP d’une à cent dans un milieu de culture.Ajoutez ensuite 75 microlitres de cette solution dans une cassette positionnée dans un compteur de particules microfluidique et déterminez le nombre de cellules. Ensuite, plaquez une fois dix à six cellules IMOP dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres comme décrit précédemment et répétez cette procédure de passage tous les cinq à sept jours. Trois jours après le placage, utilisez la sédimentation par gravité pour recueillir les otosphères comme indiqué précédemment.Procédez à l’aspiration du surnageant. Et remettez doucement les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu de différenciation épithéliale sensorielle. Ensuite, utilisez une pipette à pores larges de dix millilitres pour transférer les otosphères dans une nouvelle boîte de 60 millimètres.Différencier les otosphères pendant une dizaine de jours. Ajouter deux millilitres de milieu de différenciation frais à la culture tous les deux jours. Ensuite, récoltez à nouveau les otosphères par sédimentation gravitaire.Et aspirez le médium usé. Ensuite, fixez les otosphères dans quatre pour cent de paraformaldéhyde dans 1x PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Retirez ensuite la solution de formaldéhyde et lavez les cellules dans 1x PBS contenant 0,1 % de Triton x100.Procédez en bloquant les otosphères dans 1x PBS complété par dix pour cent de sérum de chèvre et 0,1 pour cent de Triton x100. Au bout d’une heure, remplacez le tampon bloquant par celui contenant la dilution appropriée de l’anticorps Cdkn1b ou CDH1. Ensuite, incubez les cellules dans l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Et le lendemain, continuez l’immunocoloration à l’aide d’anticorps secondaires marqués par fluorescence, la phalloïdine et le Hoechst, comme décrit ailleurs. Pour préparer l’imagerie, placez le support de montage sur une lame de verre. Et puis introduisez les otosphères colorées dans le support.Ensuite, posez une lamelle sur l’échantillon. Après avoir laissé sécher le support de montage pendant la nuit à quatre degrés Celsius, placez la lame sur la platine d’un microscope inversé équipé d’une caméra CCD 16 bits. À l’aide de l’objectif d’air 20x 0,75, acquérez des images d’épifluorescence en collectant des données à partir des canaux bleu, vert, rouge et infrarouge.Tout d’abord, nettoyez les lamelles de verre rondes en les plaçant dans une plaque stérile de 100 millimètres et en les immergeant dans de l’éthanol à 70 %. Agitez doucement les lamelles pour vous assurer qu’elles sont couvertes et laissez le plat à température ambiante pendant dix minutes. Ensuite, rincez les lamelles trois fois dans du PBS stérile 1x, puis une fois avec de l’eau stérile.Laissez ensuite sécher la housse en les exposant à la lumière UV dans une hotte de culture tissulaire pendant 15 minutes. Pour une utilisation immédiate, placez une lamelle stérile dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Et secouez doucement la plaque pour vous assurer que tous les lamelles reposent à plat.Ensuite, enduisez les lamelles en ajoutant 0,25 millilitre de 1x PBS contenant 10 microgames par millilitre de poly D lysine dans chaque puits. Après que la plaque ait incubé pendant une heure à 37 degrés Celsius, retirez la solution de lysine poly D et lavez les puits trois fois avec du PBS stérile 1x. Une fois que le liquide du dernier lavage a été aspiré, introduisez 0,25 millilitre de 1x PBS contenant 10 microgrammes par millilitre de laminine, dans chacun des 24 puits.Après avoir incubé la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius, aspirez la solution de laminin, puis lavez chaque puits avec un millilitre de 1x PBS trois fois, mais laissez le PBS du dernier lavage dans les puits jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être plaquées. Pour commencer la différenciation neuronale, comptez les cellules des otosphères dissociées comme décrit précédemment. Et puis les remettre en suspension dans un milieu de différenciation neuronale préchauffé.Procédez en enchaînant entre un et un point cinq fois dix jusqu’à la cinquième cellule IMOP dans chaque puits de la plaque contenant les lamelles de recouvrement enrobées. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Remplacement du milieu de différenciation neuronale tous les deux jours.Après sept jours, aspirez le milieu et fixez les cellules, qui doivent être attachées aux lamelles, en ajoutant quatre pour cent de formaldéhyde dans chaque puits. Et de les laisser 15 minutes à température ambiante. Ensuite, retirez le formaldéhyde et lavez les cellules une fois dans 1x PBS contenant 0,1 % de Triton x100.Retirez ensuite le tampon de lavage. Et ajoutez un tampon de blocage composé de 1x PBS contenant dix pour cent de sérum de chèvre normal, et 0,1 pour cent de Triton x100 à chaque puits. Laissez les cellules pendant une heure à température ambiante.Ensuite, retirez le liquide et remplacez-le par un tampon de blocage contenant la dilution appropriée de l’anticorps Cdkn1b ou Tubb3. Après une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius, lavez une fois les cellules avec 1x PBS contenant un pour cent de Triton x100. Et puis procédez à l’immunocoloration comme décrit précédemment.Une fois la coloration terminée, effectuez un dernier lavage en ajoutant 1x PBS dans les puits. Pour les préparer à l’analyse, retirez les lamelles de protection auxquelles sont fixées les cellules colorées de la plaque à 24 puits. Et placez-les sur un support de montage sur une lame de verre.Après avoir laissé le support de montage sécher pendant la nuit à quatre degrés Celsius, acquérir des images d’épifluorescence comme décrit précédemment. Les otosphères cultivées pendant dix jours dans un milieu de différenciation épithéliale présentent une expression accrue de Cdkn1b, un inhibiteur de kinase dépendant du cycle, et un marqueur de la différenciation de l’oreille interne, par rapport aux cellules indifférenciées. Ici, la coloration de Hoechst a noté les noyaux cellulaires.Ces cellules présentent également des changements morphologiques dans les filaments d’actine et les régions d’adhésion cellule-cellule caractéristiques des épithéliums. Indiqué par l’apparition de la phalloïdine et le marquage de Cdh1 à la périphérie des cellules. Les otosphères peuvent également être dirigées pour former des neurones.Cette image en champ clair montre qu’après sept jours dans un milieu de différenciation neuronale, les cellules IMOP présentent des neurites. L’immunomarquage de ces cellules avec un marqueur neuronal Tubb3 confirme leur différenciation. Et ils expriment également de manière robuste Cdkn1b.Cela suggère que le double signal Tubb3, Cdkn1b peut être utilisé comme indicateur de la différenciation neuronale dans les cellules IMOP. Les cellules différenciées et indifférenciées en fluorescence Cdkn1b ont également été normalisées en déterminant leur rapport avec le signal de Hoechst, fournissant des résultats quantitatifs. Les histogrammes de ces données sont présentés ici.Les pourcentages de cellules IMOP indifférenciées et différenciées au-dessus d’un seuil prédéterminé de Cdkn1b normalisé sont présentés dans ces graphiques. Les deux populations différenciées présentent une augmentation significative du pourcentage de cellules exprimant Cdkn1b par rapport aux témoins indifférenciés, confirmant la différenciation suggérée par l’immunofluorescence. Une fois maîtrisées, la culture et la différenciation de routine des cellules IMOP peuvent être effectuées en 30 minutes, si elles sont effectuées correctement.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’initier la différenciation des cellules IMOP. Merci d’avoir regardé cette vidéo. Et bonne chance dans vos expériences.

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