Name: Administrer et détecter des marques de protéines sur les arthropodes pour la dispersion de la recherche (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Apprenez à marquer les insectes avec des protéines pour la recherche sur la dispersion et la migration. Cette méthode utilise des tests ELISA pour détecter les marques et étudier les schémas écologiques des arthropodes.

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Le financement a été fourni par l&#39;USDA CRIS 5347-22620-021-00D et, en partie, par l&#39;Agriculture and Food Research Initiative concurrentiel Subvention pas. 2011-67009-30141 de l&#39;Institut national de l&#39;alimentation et de l&#39;agriculture USDA. Nous sommes reconnaissants de l&#39;appui technique de Johanna Nassif. Nous remercions également Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, et Frances Sivakoff pour fournir certains des images utilisées dans la figure 3.

1. Mark interne, rétention, et de la procédure de détection <ol><li> Procédure de marquage interne <ol><li> Recueillir les insectes d&#39;intérêt (n ≈ 100 personnes) à partir d&#39;une colonie de laboratoire élevés sur une alimentation artificielle ou sur le terrain et la diviser en deux récipients d&#39;élevage propres. </li><li> Placez un paquet régulière de 20 ml de régime (traitement banalisée de contrôle négatif) dans l&#39;un des conteneurs. Compléter un deuxième paquet de 20 ml alimentation artificielle avec 1,0 ml d&#39;une / ml d&#39;IgG de poulet solution à 1,0 mg / IgY, bien mélanger, et le placer dans l&#39;autre conteneur. Remarque: Si l&#39;insecte d&#39;intérêt n&#39;a pas une alimentation artificielle, la marque peut être placée sur ou dans quelque régime qu&#39;ils sont normalement maintenus sur (par exemple, haricot vert, œufs de papillons nocturnes, de l&#39;eau, le sucre, le miel). </li><li> Laisser les insectes reprennent leur activité d&#39;alimentation pour 24 h. </li></ol></li><li> Marque interne rétention procédure <ol><li> Retirez les paquets de régime de chaque conteneur et de fournir les insectes with autre source de nourriture pour les soutenir pendant la durée de l&#39;expérience (par exemple, des haricots verts). </li><li> Recueillir une cohorte (n = 20) des insectes par jour (ou à tout intervalle de temps désiré) de chaque traitement et congeler immédiatement à -20 ° C. </li></ol></li><li> Sandwich procédure ELISA <ol><li> Ajouter 50 pi de lapin anti-poulet IgY anticorps primaire dilué 1: 500 dans du Tris solution saline tamponnée (TBS) à chaque puits d&#39;une microplaque ELISA propre et incuber pendant un minimum de 1 heure à température ambiante (note: les microplaques peut aussi être incubées O / N à 4 ° C). </li><li> Jeter l&#39;anticorps de la plaque et bloquer chaque puits avec 300 pi d&#39;une solution de lait en poudre 1,0% non gras pendant 30 min. </li><li> En attendant que les étapes d&#39;incubation précédentes, placer des insectes congelés individuellement dans 1,6 ml microtubes avec 1,0 ml de TBS. </li><li> Broyer chaque insecte avec un pilon propre jusqu&#39;à homogénéise et ajouter 100 pi de chaque échantillon à un puits individuel de l&#39;ELISAassiette. Laisser les échantillons incuber à température ambiante pendant 1 h. </li><li> Ajouter 100 pi de négatif (SCT seulement) et positifs (les blancs d&#39;œufs en TBS) des contrôles aux puits dans la première colonne de chaque plaque ELISA. En outre, ajouter 100 pi de contrôles négatifs d&#39;insectes (insectes non marqués) pour les 8 puits dans la dernière colonne de chaque plaque (Figure 1). Laisser les échantillons témoins à incuber à température ambiante pendant 1 heure. Notez que le modèle fourni à la figure 1 est le modèle que nous utilisons pour nos tests standardisés. Le placement des échantillons dans les puits est à la discrétion du chercheur. </li><li> Laver chaque puits trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS) et ensuite -tween ajouter 50 ul d&#39;IgG de lapin anti-poulet / IgY conjugué peroxydase de raifort dilué à 1: 10000 en solution à 1% de lait et incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver chaque puits trois fois avec du PBS-Tween et ajouter 50 pi de tétraméthylbenzidine (TMB) à chaque puits. </li><li> Après 10 minutes, lire les puitsavec un spectrophotomètre de microplaque réglé à une longueur d&#39;onde de 650 nm. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Figure 1. Un schéma montrant les désignations ainsi standardisés utilisés pour un type 96 puits ELISA microplaques. Chaque plaque contient 7 puits réservés aux salins tamponnée au Tris contrôles négatifs (SCT), un puits dédiés à un contrôle de la protéine positive (Pos Ctrl), 80 puits individuels réservés aux insectes recapturés (exemples 1 ... 80), et 8 puits réservés aux non marquées (négatifs) des contrôles d&#39;insectes (Neg Ctrl 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 2. Mark externe, de rétention, et de la procédure de détection <ol><li> Procédure de marquage externe <ol><li> Recueillir les insectes d&#39;intérêt (n ≈ 100individus) à partir d&#39;une colonie de laboratoire ou sur le terrain et le lieu dans deux récipients en matière plastique de 1,0 L avec un trou de 2,5 cm de diamètre percé de chaque côté du récipient. </li><li> Vaporiser les insectes dans le premier récipient avec 1,0 ml de dH 2 O (traitement témoin négatif) en utilisant un nébuliseur médical. Vaporiser les insectes dans le second récipient avec 1,0 ml d&#39;une solution à 5,0% de blancs d&#39;oeuf de poule en utilisant un nébuliseur médical. </li><li> Fixer le tuyau du nébuliseur à une prise d&#39;air de laboratoire standard et insérez ensuite la bouche du nébuliseur dans le trou de 2,5 cm du conteneur. Ensuite, tournez sur la sortie d&#39;air progressivement jusqu&#39;à ce que le nébuliseur produit une vapeur. </li><li> Continuer la pulvérisation (marquage) jusqu&#39;à ce que la solution de blancs d&#39;oeufs a été distribuée (env. 2-5 min). </li><li> Retirer le nébuliseur et placer un bouchon dans l&#39;orifice du récipient en plastique. Permettre aux insectes de se tenir à la température ambiante jusqu&#39;à ce que la solution ait complètement séché. </li></ol></li><li> Marque extérieure rétention procédure<ol><li> Placez chaque traitement des insectes sec dans un récipient d&#39;élevage propre et séparée pour éviter toute exposition à la marque. </li><li> Ajouter nourriture et d&#39;eau pour les récipients propres pour soutenir les insectes sur la durée de l&#39;étude. </li><li> Recueillir une cohorte (n = 20) des insectes de chaque traitement quotidien et congeler immédiatement à -20 ° C. </li></ol></li><li> Procédure ELISA indirect <ol><li> Placez les insectes congelés individuellement dans 1,6 ml microtubes et ajouter 1,0 ml de TBS. </li><li> Faire tremper les échantillons pendant 1 heure sur un ensemble de agitation à 120 rpm. </li><li> Ajouter témoins négatifs et positifs comme décrit dans l&#39;étape 1.3.5. </li><li> Après le trempage, la pipette une partie aliquote de 100 pi de chaque échantillon dans l&#39;un des 80 puits d&#39;échantillons désignés sur un nouveau puits plaque de 96 ELISA comme le montre la figure 1 Laisser les échantillons incuber pendant 1 heure à température ambiante (note:. Les microplaques peut aussi être O incubé / N à 4 ° C). </li><li> Laver les puits trois fois avecPBS-Tween, puis ajouter 300 ul de solution saline tamponnée au phosphate contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin (PBS-BSA) dans chaque puits. </li><li> Après 30 min à température ambiante laver deux fois avec du PBS-Tween. </li><li> Ajouter 50 ul d&#39;anticorps de lapin anti-albumine d&#39;oeuf anticorps primaire dilué 1: 8000 dans du PBS-BSA-Silwet (0,05%) dans chaque puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver chaque puits trois fois avec du PBS-Tween, puis ajouter 50 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à la peroxydase de raifort dilué à 1: 2000 dans du PBS-BSA-Silwet (0,05%) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Laver chaque puits trois fois avec du PBS-Tween et ajouter 50 ul de substrat TMB à chaque puits. </li><li> Après 10 minutes, lire les puits avec un spectrophotomètre de microplaque réglé à une longueur d&#39;onde de 650 nm. </li></ol></li></ol> Analyse des données 3. <ol><li> Calculer la valeur moyenne de l&#39;absorbance des 8 insectes de contrôle négatif sur chaque plaque ELISA puis calculer l&#39;écart type sur la base des contrôles négatifs communs from toutes les plaques ELISA d&#39;une étude donnée 12. </li><li> Ajouter six fois l&#39;écart-type commun à la moyenne obtenue pour chaque plaque ELISA pour obtenir une valeur de seuil positif ELISA. Tout échantillon insectes produisant une valeur d&#39;absorbance égale ou supérieure à cette valeur est considérée comme positive pour la présence de la marque en protéines. </li></ol>

La mention de marques de commerce ou de produits commerciaux dans la présente publication est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et ne signifie pas qu&#39;ils sont approuvés par le ministère américain de l&#39;Agriculture. L&#39;USDA est un fournisseur de l&#39;égalité des chances et de l&#39;employeur.

La procédure d&#39;immuno-marquage des protéines arthropode a été décrite pour la première près d&#39;un quart de siècle 9. Depuis lors, la procédure a été adaptée pour étudier les modes de dispersion d&#39;une grande variété d&#39;arthropodes en utilisant IgG / IgY fois interne et externe administrés. Ces protéines se sont avérées marqueurs fermes pour la grande variété d&#39;espèces d&#39;insectes testées jusqu&#39;à présent. Cependant, comme mentionné ci-dessus, la principale limitation à l&#39;utilisation...

Suivi des mouvements des arthropodes parasites, ennemis naturels (parasitoïdes et des prédateurs), et les pollinisateurs dans la nature est essentielle pour mieux comprendre comment améliorer les services écosystémiques. L&#39;élément clé pour la plupart des types de recherche de dispersion est d&#39;avoir une méthode fiable pour marquer l&#39;arthropode (s) d&#39;intérêt. Une variété de matériaux (par exemple, les peintures, les teintures, les poussières de couleur, des étiquettes, des éléments rares, protéines) ont été utilisées pour marquer les arthropodes pour évaluer la dynamique de leur population, les capacités de dispersion, les comportements alimentaires, et d&#39;autres interactions écologiques 1,2. La pertinence d&#39;un marqueur utilisé pour toute recherche de dispersion donné sera fonction du type d&#39;étude en cours. Il existe trois grandes catégorisations pour les arthropodes marquage: (1) marque à libération-recapture (MRR), (2) marque-capture, et (3) l&#39;auto-marquage-capture. Pour la recherche marque à libération-recapture, l&#39;enquêteur marque généralement les arthropodes collectivement dans le laborary et libère eux à un point central dans le domaine. Les arthropodes sont ensuite repris à divers intervalles spatiales et temporelles en utilisant différents dispositifs de collecte (par exemple, nets de balayage, sous vide, piège collant) 3,4,5. Les échantillons récupérés sont ensuite examinés pour la marque spécifique de distinguer libéré de personnes indigènes. Pour la recherche marque-capture, l&#39;enquêteur applique généralement la marque directement dans l&#39;équipement de pulvérisation sur le terrain à l&#39;aide (par exemple, un pulvérisateur à dos, la rampe et buse pulvérisateur). Les meilleurs marqueurs pour la recherche marque de capture sont peu coûteux et facilement appliquée à l&#39;habitat de l&#39;arthropode. Pour la recherche d&#39;auto-marquage-capture, l&#39;enquêteur applique généralement aux marques une entrée arthropodes appât 6,7 ou 8 nid. À son tour, l&#39;arthropode se marque en interne par dévorer l&#39;appât ou à l&#39;extérieur marqué par &quot;brosser&quot; contre la marque telle qu&#39;elle quitte le nid. Comme mentionné ci-dessus, de nombreux types de marqueurs ont été noused pour marquer une variété d&#39;espèces d&#39;arthropodes. Cependant, très peu sont utiles pour ces trois catégories de recherche dispersion. Le développement de la procédure protéine immuno-marquage était une percée majeure pour les insectes de marquage. Immunomarquage met une étiquette de protéine sur les arthropodes interne ou externe qui, à son tour, est détectée par un dosage immuno spécifique lié à une enzyme anti-protéine (ELISA). Les premiers marqueurs protéiques tels utilisées étaient immunoglobuline de lapin (IgG) et le poulet IgG / 9,10 IgY. Ils se sont révélés être des marques très efficaces pour MRR et de la recherche de soi-marquage-capture (voir la discussion). Malheureusement, les protéines IgG / IgY sont coûteux et ne sont donc pas pratique pour la recherche marque-capture et la plupart des types de recherche auto-marquage-capture. Par la suite, les tests ELISA de détection de la protéine de deuxième génération ont été développés pour des protéines contenues dans les blancs d&#39;oeufs de poulet (albumine), le lait de vache (la caséine) et du lait de soja (protéine inhibitrice de la trypsine). Chaque essai est très sensible, spécifique et, plusSurtout, utilise des protéines qui sont beaucoup moins chers que les protéines IgG / 11 IgY. Ces protéines se sont avérés efficaces pour MRR, marque-capture, et la recherche de soi-marquage-capture (voir la discussion). Dans cet article, nous décrivons et montrons comment réaliser des études de rétention de laboratoire protéines de marque. Ces études sont la première phase de la recherche nécessaire pour tout type d&#39;étude champ de dispersion. Plus précisément, il est essentiel que les enquêteurs savent combien de temps la marque sera conservée sur les espèces d&#39;arthropodes ciblés avant d&#39;entreprendre des études champ de dispersion. Ici, nous décrire et démontrer comment marquer interne et externe des insectes pour MRR, marque de capture, et des études de terrain de type auto-marquage-capture. Nous démontrons comment pour détecter la présence des marques avec ELISA indirects et sandwichs.

<table><tbody><tr><td>Conteneur de stockage de nourriture (pour l’élevage d’insectes)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Différentes tailles</td><td>Divers fabricants et fournisseurs. Le tissu en maille est collé dans une fenêtre</td></tr><tr><td>Nébuliseur de petit volume (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Disponible en ligne et dans les magasins de fournitures médicales. D’autres marques fonctionneront également.</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, 1,6 ml avec capuchon</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>N’importe quel type similaire fera l’affaire. Nous préférons les marques qui ont des couvercles faciles à ouvrir.</td></tr><tr><td>Boîte de rangement en polystyrène pour tubes de microcentrifugation (grille 5x20)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>Ce design est agréable car il n’encombre pas les tubes.</td></tr><tr><td>Distributeur, répétiteur</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Tout ce qui est similaire aidera à accélérer la distribution.</td></tr><tr><td>Pilons, broyeurs de mouchoirs jetables en plastique, 1,5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Disponible auprès de divers fournisseurs. Les pilons peuvent être nettoyés et autoclavés pour être réutilisés.</td></tr><tr><td>Plaques ELISA BD Falcon, 96 puits (fond plat)</td><td>Pipette BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation, manuelle (20-200 & micro ; l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 ou 1070-0200</td><td>Tout type similaire fonctionnera. Ce modèle est ergonomique.</td></tr><tr><td>Réservoirs, réactif stérile</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Tout ce qui est similaire fonctionnera.</td></tr><tr><td>Pipette électronique, 8 canaux (50-1 200 & micro ; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>Si vous deviez choisir un modèle électronique, cette taille est la plus utile.</td></tr><tr><td>Pipette électronique, 8 canaux (10-300 & micro ; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Tout ce qui est similaire fonctionnera.</td></tr><tr><td>Collecteur, laveuse de plaques multipuits (8 positions, droite)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp ;</td><td>Tout ce qui est similaire fonctionnera pour le lavage manuel des plaques.</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques avec détection d’absorbance</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Tout ce qui est similaire fonctionnera.</td></tr><tr><td>Poulet IgG/IgY</td><td>États-Unis Biologique</td><td>I1903-15R</td><td>Également disponible d’autres sources</td></tr><tr><td>Blancs d’œufs</td><td>Épicerie</td><td>" Tous les Blancs », » Batteurs à œufs", etc.</td><td>Mix 5 ml avec 95 ml dH2O pour solution à 5 %</td></tr><tr><td>Tris (base Trizma)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2,42 g/L pour faire TBS</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29,22 g/L pour faire TBS et 8,0&nbsp ; g&#8288 ;/&#8288 ; L pour PBS</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1,14 g/L pour PBS</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0,2 g/L pour PBS</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0,2 g/L pour PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td> de qualité EIA <td>Ajouter 0,5 ml par L au PBS après dissolution des sels.</td></tr><tr><td>PBS avec 1 % BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 sachet dans 1 L dH2O</td></tr><tr><td>Anticorps anti-IgY (molécule entière) de poulet produit chez le lapin (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &micro ; l dans 50 ml de</td></tr><tr><td>lait en poudre, en poudre ou frais TBS (1 %)</td><td>Epicerie</td><td></td><td>Mix 10 g avec 1 L dH2O pour solution à 1 %</td></tr><tr><td>Anticorps anti-IgY de poulet (IgG) (molécule entière)-Peroxydase produit chez le lapin (1:10 000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &micro ; l dans 1 L de lait 1 %</td></tr><tr><td>Anticorps anti-albumine d’œuf de poule produit chez le lapin (1:8 000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilué 125 &micro ; l dans 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Conjugué IgG Peroxydase Chèvre Anti-Lapin (1:2 000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Diluer 0,5 ml dans 1 L PBS-BSA, puis ajouter 1,3&nbsp ; ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolymère silicium-polyéther</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Ajouter comme dernier ingrédient</td></tr><tr><td>TMB Microwell Substrat de peroxydase à un composant</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administrer et détecter des marques de protéines sur les arthropodes pour la dispersion de la recherche

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Le contrôle des mouvements des arthropodes est souvent nécessaire pour mieux comprendre la dynamique de la population, associés aux modèles de dispersion, les préférences de la plante hôte, et d&#39;autres interactions écologiques. Arthropodes sont généralement suivis dans la nature en les étiquetant avec une marque unique et puis re-collecte eux au fil du temps et de l&#39;espace pour déterminer leurs capacités de dispersion. En plus de balises physiques réelles, comme la poussière ou de la peinture de couleur, divers types de protéines sont avérées très efficaces pour les arthropodes pour la recherche écologique de marquage. Les protéines peuvent être administrées à l&#39;intérieur et / ou extérieur. Les protéines peuvent ensuite être détectés sur les arthropodes recapturés avec un dosage immuno-enzymatique spécifique de la protéine (ELISA). Nous décrivons ici les protocoles pour extérieurement et intérieurement marquage arthropodes avec des protéines. Deux exemples expérimentaux simples sont démontrés: (1) une marque de protéine interne présenter à un insecte en fournissant une alimentation enrichie en protéines et (2) une marque de protéine externe topique d&#39;unepplied à un insecte en utilisant un nébuliseur médical. Nous relions ensuite un guide étape par étape du sandwich et méthodes ELISA indirectes utilisées pour détecter les traces de protéines sur les insectes. Dans cette démonstration, les divers aspects de l&#39;acquisition et la détection des marqueurs de protéines sur les arthropodes de marque à libération-recapture, marque-capture, et les types de recherche auto-marquage-capture sont discutés, ainsi que les diverses façons que la procédure d&#39;immuno-marquage a été adapté pour convenir à une grande variété d&#39;objectifs de recherche.

Marquage interne: Les résultats de l&#39;essai marque de rétention interne sont présentés dans la figure 2A. La valeur de seuil critique calculée ELISA était de 0,054. Dans l&#39;ensemble (tous les quatre dates d&#39;échantillons combinés), les insectes traités sans protéines ont donné des valeurs uniformément faibles ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Inversement, tous les insectes n...

Les protéines sont souvent utilisées pour marquer les arthropodes pour la recherche sur la dispersion. Des méthodes d’administration de marques protéiques internes et externes sur des arthropodes sont démontrées. Des techniques de détection de marques protéiques, soit par des tests immuno-enzymatiques indirects ou sandwich (ELISA), sont également illustrées.

Administrer et détecter des marques de protéines sur les arthropodes pour la dispersion de la recherche

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

L’objectif général de cette démonstration est de décrire comment marquer les insectes avec des protéines pour la recherche sur la dispersion ou la migration. Cette démonstration comprend des méthodes sur la façon de détecter les marques par un test immuno-enzymatique sandwich ou indirect. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la dispersion des insectes.Il peut être utilisé pour étudier les schémas de migration des insectes, les préférences des plantes hôtes des insectes et la propagation des espèces envahissantes. Les avantages de cette technique sont que la méthode de détection est simple et peu coûteuse. Convient pour un débit élevé, et les animaux peuvent être facilement marqués directement dans leur habitat naturel.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, parce qu’elle semble plus difficile qu’elle ne l’est, parce que la plupart des chercheurs sur le terrain n’ont pas l’expérience de cette technique simple. J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois en 1989. Nous élevions des prédateurs d’insectes aux grands yeux avec un régime artificiel.Nous craignions que ces insectes ne soient pas des prédateurs efficaces d’un insecte Lygus après avoir été élevés en captivité pendant une longue période avec un régime non naturel. En d’autres termes, ils seraient domestiqués. Nous avions besoin d’une méthode sûre, efficace et peu coûteuse pour les distinguer de leurs homologues indigènes après leur libération sur le terrain.Aucune des méthodes de marquage actuelles ne répond à ces critères. Une expérience antérieure que j’ai eue en utilisant la procédure ELISA pour effectuer des analyses du contenu intestinal des prédateurs pour les restes de protéines spécifiques à Lygus m’a donné l’idée d’appliquer une marque protéique étrangère sur le prédateur élevé en laboratoire. À notre tour, nous avons pu analyser les punaises aux grands yeux collectées sur le terrain pour les restes de Lygus et les restes de protéines étrangères.Pour commencer, collectez environ 100 insectes d’intérêt dans une colonie de laboratoire ou sur le terrain, et divisez-les dans deux conteneurs d’élevage propres. Chargez un récipient avec un sachet diététique régulier de 20 millilitres, pour servir de contrôle négatif. Pour l’autre, lacez un sachet diététique avec un milligramme de poulet IgG-IgY.Ajouter un millilitre de solution et bien mélanger. Si nécessaire, utilisez ce que les insectes sont normalement nourris à la place du paquet. Après 24 heures d’élevage avec ces sachets de régime, fournissez aux deux groupes d’insectes de la nourriture normale non marquée.Aux intervalles de temps souhaités, prélever 20 insectes individuels dans chaque cohorte. Congelez-les à moins 20 degrés Celsius, jusqu’à ce que toutes les cohortes requises soient rassemblées pour l’expérience. Pour préparer une plaque de 96 puits pour l’ELISA, ajoutez à chaque puits 50 microlitres d’anticorps primaires IgY anti-poulet de lapin dilués un sur 500 dans une solution saline tamponnée Tris, ou TBS.Laissez la plaque chargée incuber pendant au moins une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Plus tard, videz les puits et ajoutez 300 microlitres de solution en bloc dans chaque puits. Il s’agit d’une solution de lait en poudre écrémé à un pour cent.Laissez incuber la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation en bloc, transférez les insectes congelés dans des microtubes à centrifuger remplis d’un millilitre de TBS. Ensuite, homogénéisez soigneusement chaque insecte avec un pilon propre.Lorsque la plaque est prête, chargez chaque puits avec 100 microlitres d’un échantillon d’insecte homogénéisé. Chaque plaque de 96 puits peut accueillir 80 spécimens. Laissez la première et la dernière colonne de la plaque vides pour les commandes.Dans la première colonne, chargez sept aliquotes de 100 microlitres de TBS seul, et chargez un puits de 100 microlitres de TBS avec contrôle positif du blanc d’œuf. Dans la dernière colonne, chargez 100 microlitres de huit préparations individuelles d’insectes non marqués. Laissez les échantillons incuber à température ambiante pendant au moins une heure.Après l’incubation, lavez soigneusement les puits trois fois avec du PBS-Tween salin tamponné au phosphate. Grâce à notre expérience, nous avons appris que la plupart des erreurs se produisent pendant les étapes de lavage. Les éclaboussures peuvent entraîner une forte occurrence de réactions faussement positives, alors soyez prudent.Après les lavages, ajoutez 50 microlitres d’IgG-IgY anti-poulet de lapin conjugués à de la peroxydase de raifort, et dilués de un à 10 000 dans une solution de lait à un pour cent. Laissez la solution incuber dans les puits pendant au moins une heure à température ambiante. Plus tard, lavez la plaque trois fois avec PBS-Tween comme précédemment.Ensuite, chargez les puits avec 50 microlitres de substrat TMB. Vous pouvez commencer à voir un changement de couleur tout de suite. Laissez incuber la plaque pendant 10 minutes avant de la lire à l’aide d’un spectrophotomètre de microplaques.Lire la plaque à 650 nanomètres et enregistrer les valeurs. Pour marquer les insectes à l’extérieur, préparez des bouteilles en plastique d’un litre avec des trous d’accès et divisez 100 insectes en deux bouteilles. Ensuite, vaporisez les insectes dans un récipient avec un millilitre d’eau distillée, qui sert de contrôle négatif.Ensuite, fixez un nébuliseur médical à une sortie d’air et ajustez le débit d’air pour que le nébuliseur produise de la vapeur. Vaporisez les autres insectes avec un millilitre de solution de blanc d’œuf de poule à cinq pour cent. Le processus de pulvérisation devrait prendre entre deux et cinq minutes.Ensuite, bouchez les trous et laissez la solution sécher complètement à température ambiante. Une fois séchés, transférez les insectes dans leurs récipients d’élevage normaux, avec leur régime alimentaire standard et maintenez-les comme d’habitude. Plus tard, collectez les insectes à des intervalles de temps prédéterminés pour les tests.Pour vérifier la rétention des marques externes, utilisez une procédure identique au test ELISA pour tester la rétention des marques internes, avec des modifications mineures. Une fois que les insectes sont transférés dans des microtubes à centrifuger avec TBS, laissez-les tremper sur un agitateur orbital à 120 tr/min pendant une heure, au lieu de les homogénéiser. Après avoir trempé les insectes, pipetez 100 microlitres de la solution dans les puits de la plaque et laissez la plaque incuber pendant au moins une heure.Après avoir lavé les échantillons d’insectes, ajoutez 300 microlitres de PBS avec un pour cent de BSA dans chaque puits. Après 30 minutes à température ambiante, lavez les puits deux fois avec PBS-Tween. Ensuite, à chaque puits, ajoutez 50 microlitres d’anticorps primaire anti-albumine d’œuf de lapin, dilué un sur huit mille dans la silhouette PBS-BSA.Incuber la plaque pendant au moins une heure et laver les puits comme avant. Puis, dans chaque puits, ajouter 50 microlitres d’IgG anti-lapin de chèvre conjuguées à de la peroxydase de raifort, et diluées une sur deux mille, en silhouette PBS-BSA. Laissez la plaque incuber pendant au moins une heure, à température ambiante, puis procédez selon le protocole décrit précédemment.La conservation de la marque interne a été testée à quatre moments. Dans l’ensemble, les insectes traités sans protéines ont donné des valeurs ELISA constamment faibles. Alors que tous les insectes nourris avec le régime enrichi en protéines ont donné des valeurs ELISA constamment élevées.Les marques externes ont également été testées à quatre points temporels. Les insectes qui ont été marqués localement avec des blancs d’œufs ont donné des valeurs élevées et constantes. Comme on pouvait s’y attendre, les témoins négatifs aspergés d’eau ont enregistré des valeurs ELISA très faibles.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les insectes et de les analyser pour détecter la présence de la marque. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures et 30 minutes si elle est correctement exécutée. Au cours d’une journée, 16 plaques d’essai contenant plus de 1000 échantillons peuvent être traitées.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que le test est extrêmement sensible. En tant que tel, il est impératif que toutes les surfaces, récipients et équipements soient exempts de contamination par les protéines. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer les modèles de dispersion des insectes à l’échelle locale et régionale dans les habitats agricoles, urbains, forestiers et autres habitats naturels.Nous avons démontré ici un exemple à petite échelle, mais la technique a été utilisée à une échelle beaucoup plus grande pour marquer les insectes directement dans leur habitat naturel à l’aide d’équipements de pulvérisation commerciaux. Nous avons été émerveillés par les applications créatives de nos collaborateurs.

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