Différences entre les sexes dans la souris hippocampiques astrocytes après

L'objectif général de cette technique est de préparer des cultures enrichies d'astrocytes hippocampiques spécifiques au sexe à partir de souriceaux nouveau-nés, afin d'étudier les rôles spécifiques au sexe des astrocytes après une privation d'oxygène et de glucose suivie d'une réoxygénation, dans le but de reproduire in vitro une ischémie hypoxique dans un environnement de culture cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les mécanismes et la traduction, en lien avec le rôle spécifique au sexe des astrocytes hippocampiques après une ischémie hypoxique dans les cerveaux en développement des mâles et des femelles. Désosser le cerveau de la tête d'un souriceau nouveau-né en utilisant de petites ciseaux pour réaliser une incision médiane postéro-antérieure à travers la peau afin d'exposer le crâne.

Couper soigneusement la ligne médiane du crâne du cou jusqu'au nez. Utiliser une pince plate stérile pour détacher le crâne. Retirer le tronc cérébral à l'aide d'une pince courbe et placer le cerveau restant dans une boîte de dissection.

À l’aide de pinces courbes, retournez le cerveau afin que la surface ventrale soit orientée vers le haut, puis séparez les hémisphères à l’aide d’un scalpel chirurgical stérile et tranchant. À l’aide de pinces courbes plates, écartez les hémisphères cérébraux et retirez délicatement le tissu du mésencéphale et du thalamus qui fait saillie, afin de mettre à nu l’hippocampe, une petite structure en forme de hippocampe située dans le lobe temporal médial. Retirez les deux lobes hippocampiques et nettoyez soigneusement les méninges et les fibroblastes présents à la surface des lobes en tirant à l’aide de pinces fines.

Transférez les deux hémisphères hippocampiques d'une souris unique dans un deuxième plat contenant environ 5 millilitres de HBSS et placez sur de la glace. Hachez finement les hémisphères environ 4 fois à l’aide d’un scalpel stérile et aiguisé. Utilisez une pipette stérile de 1 millilitre pour transférer le HBSS et le tissu dans un tube conique stérile de 50 millilitres, puis centrifugez à 300 ×g pendant 5 minutes.

Après centrifugation, aspirez le surnageant. Ajoutez 3 millilitres de trypsine à 0,25 pour cent, mélangez et incubez le tissu à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes avec un agitation douce. À l'issue de l'incubation, centrifugez le tube à 300 fois G pendant 5 minutes.

Après la centrifugation, utilisez une pipette en verre stérile pour aspirer soigneusement le surnageant, puis ajoutez 10 millilitres de milieu de mise en culture préalablement réchauffé pour les astrocytes. Effectuez 20 à 30 aspirations et redistributions à l’aide d’une pipette en verre polie à la flamme. Après une nouvelle centrifugation de 5 minutes à 300 ×g, aspirez le surnageant et ajoutez 2 millilitres de milieu de mise en culture pour les astrocytes.

Faire passer la suspension cellulaire à travers un filtre maille 70 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ajouter l'ensemble de la suspension cellulaire dans un flacon de culture stérile T-25 revêtu contenant 3 millilitres de milieu de culture pour astrocytes. Incuber le flacon à 37 degrés Celsius dans une étuve à 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain, observer la progression de la confluence astrocytaire au microscope optique, aspirer le milieu et le remplacer par 2 millilitres de milieu de plaquage pour astrocytes frais. Environ 11 jours in vitro, récolter les astrocytes confluentes en aspirant le milieu, puis ajouter 2 millilitres de trypsine à 0,25 %. Faire tourner doucement le flacon plusieurs fois, puis aspirer la trypsine à l’aide d’une pipette en verre stérile.

Ajouter encore 2 millilitres de trypsine 0,25 % et laisser le flacon à température ambiante pendant 4 à 5 minutes. Après avoir retiré la trypsine, placer le flacon à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec 5 % de CO2 pendant 10 minutes. À l'issue de l'incubation, ajouter 5 millilitres de milieu de culture pour les astrocytes et détacher la couche astrocytaire en tapotant le flacon 3 à 4 fois.

Triturez doucement la suspension cellulaire sur le fond du flacon afin d'obtenir un détachement complet, puis récupérez les astrocytes dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube à 300 ×g pendant 5 minutes. Aspirez le surnageant, puis ajoutez 1 millilitre de milieu frais pour le semis des astrocytes.

Ajoutez 10 microlitres de la suspension cellulaire à un hématimètre et utilisez un microscope inversé à contraste de phase avec un objectif 10x pour compter les cellules dans la grande zone quadrillée centrale. Diluez les cellules à environ 1 × 10⁵ cellules par 2 millilitres de milieu de mise en culture des astrocytes. Pipetez 2 millilitres de la suspension cellulaire sur un couvre-objet en verre revêtu de poly-D-lysine dans la cavité d'une plaque de culture de 24 puits.

Incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Pour commencer la privation en oxygène et en glucose, aspirez le milieu du lamelle contenant les astrocytes adhérents et rincez une fois avec 1 millilitre de solution OGD isotonique. Ajoutez 0,2 millilitre de solution OGD dans la cavité et placez-la dans un incubateur hypoxique.

Mélanger délicatement à l’aide d’un agitateur orbital réglé à 50 tr/min pendant les 30 premières minutes d’hypoxie. Pour la réoxygénation, remplacer la solution OGD par 2 millilitres de milieu de mise en culture des astrocytes et incuber à 5 % de dioxyde de carbone et en air atmosphérique à 37 degrés Celsius pendant 5 heures. Cette image d’immunofluorescence montre la pureté de la culture primaire d’astrocytes hippocampiques de souris.

La culture d'astrocytes a été immunomarquée pour révéler le marqueur des dendrites neuronales, MAP2, en rouge, et le marqueur des microglies, IBA1, en vert. Les noyaux sont colorés avec le DAPI qui apparaît en bleu. La flèche indique une contamination par des microglies.

Cette image immunofluorescente représentative d'astrocytes hippocampiques en culture dans des conditions normoxiques montre la réactivité immunohistochimique anti-GFAP en rouge et le marquage de HIF1-alpha en vert. Là encore, les noyaux sont colorés avec le DAPI qui apparaît en bleu. La flèche indique une faible expression de HIF1-alpha.

Après 2 heures de privation en oxygène et en glucose et 5 heures de réoxygénation, l'expression de HIF1-alpha était augmentée dans les astrocytes hippocampiques en culture, comme l'indique la flèche indiquant une expression nucléaire accrue de HIF1-alpha. L'expression de GFAP et celle de S100b étaient régulées à la hausse dans les cultures d'astrocytes hippocampiques provenant de souris mâles suite à la privation en oxygène et en glucose et à la réoxygénation. Une surexpression de S100b et de GFAP a également été observée dans les astrocytes provenant de souris femelles.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la PCR quantitative, le western blotting, le ARNi et les colorations immunohistochimiques peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les modifications spécifiques au sexe dans l'expression de certains gènes et protéines suite à une ischémie in vitro. Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les effets et conséquences de l'accident vasculaire cérébral dans l'hippocampe en étudiant les astrocytes en culture.