Déficitaires et approche Gain de fonction d'enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

L'objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d'acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.

L’objectif global de ce protocole est d’utiliser des manipulations de perte et de gain de fonction pour identifier des molécules spécifiques au stade qui contrôlent la différenciation de la masse cellulaire interne des embryons de souris pendant la pré-implantation. Cette méthode peut aider à répondre à la question clé concernant la libération précoce du destin cellulaire dans la biologie du développement de base, ainsi que dans la biologie des cellules souches, les sciences animales et la biotechnologie de la reproduction, comme le clonage animal. L’objectif principal de cette technique est que le récepteur spécifique au stade, et il existe des ligands d’utilisation pour améliorer l’expression du seul facteur spécifique des cellules souches embryonnaires au cours du développement embryonnaire.

Ce protocole a été développé en collaboration avec plusieurs laboratoires. C’est pourquoi mon collaborateur, le professeur Sang Jin Lee, et son étudiant diplômé, Yong Il Cho, feront la démonstration du processus. 18 à 20 heures après la dernière injection, sacrifiez les femelles enceintes par intoxication au dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale.

Ensuite, ouvrez l’arrière et coupez la couche intérieure avec des ciseaux fins. Trouvez et ramassez les cornes utérines à l’aide de pinces fines et retirez-les doucement de la cavité corporelle, ainsi que de l’utérus, de l’oviducte, de l’ovaire et des coussinets adipeux. Ensuite, coupez la zone entre l’oviducte et l’ovaire à l’aide de ciseaux fins.

Ensuite, repositionnez la pince et coupez l’utérus près de l’oviducte, en laissant au moins un centimètre de la partie supérieure de l’utérus attaché. Maintenant, transférez l’ampoule oviductale dans la goutte de média M16 recouverte d’huile minérale sur une boîte de Pétri de 35 millimètres à température ambiante. Regrouper les oviductes de plusieurs souris dans le même plat.

Après avoir préparé l’aiguille de seringue CC, comme indiqué dans le protocole de texte, utilisez des pinces fines pour tenir et pénétrer dans l’extrémité de l’oviducte. Ensuite, percez doucement et essorez la masse du cumulus à la phase de chute du média. À l’aide d’un stéréomicroscope, récupérez les embryons de 2-PN ainsi que les masses de cumulus environnants, à l’aide d’une pipette en verre stérile, et transférez-les dans une nouvelle boîte de Pétri

Ensuite, dissociez les cellules du cumulus en baignant les tissus dans un millilitre de solution d’hyaluronidase. Maintenant, incubez le plat à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes. L’étape suivante consiste à dénuder les embryons.

À l’aide de la pipette en verre, faites couler doucement la solution du bain pour libérer les cellules du cumulus des embryons environnants. Ensuite, lavez les embryons dénudés avec 30 à 50 millilitres de PBS frais par embryon. Effectuez ce lavage trois fois.

Maintenant, transférez les embryons dans une boîte en plastique de 35 millimètres avec M16 plus BSA, et conservez-les dans un incubateur humidifié jusqu’à quatre heures avant la micro-injection. Avant la microinjection, lavez brièvement les embryons 2-PN dénudés avec un millilitre de M16 frais. Ensuite, transférez les embryons en solution dans un tube à centrifuger et faites-les tourner à 1 000 G pendant 10 minutes.

Maintenant, transférez chaque embryon dans une boîte de culture avec 20 à 30 microlitres de milieu M16. Cela rendra les pronoyaux visibles. Couvrez le milieu d’une fine couche d’huile minérale et incubez les embryons à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pendant une à deux heures.

Pendant ce temps, à l’aide d’un extracteur mécanique, préparez les pipettes d’injection et les pipettes de maintien à partir d’un tube capillaire en verre borosilice. Ensuite, à l’aide d’un microbroyeur et d’un microforgeur, fabriquez les pipettes d’injection avec des pointes émoussées et polissez-les en ouvertures de deux microns de large. La longueur de la pointe doit être inférieure à 500 microns.

De même, fabriquez des pipettes de maintien en fabriquant des pointes émoussées et en polissant leurs ouvertures jusqu’à ce qu’elles aient un diamètre intérieur de 20 microns et un diamètre extérieur de 100 microns. Maintenant, chargez les pipettes d’injection avec au moins 200 nanolitres de solution plasmidique à une concentration d’un microgramme d’ADN par microlitre. Ensuite, montez la pipette d’injection dans un micromanipulateur motorisé.

Ensuite, réglez l’injecteur sur des bul-ih-ses pulsés d’environ 10 picolitres. Pour la microinjection, fixez les embryons à l’aide de la pression négative de la pipette de maintien. Ensuite, avancez et placez l’extrémité de la pipette d’injection à côté de la membrane cellulaire juste au-dessus de l’un des pronoyaux.

Ensuite, piquez la membrane cellulaire, enfoncez plus profondément dans le pronucléus et faites l’injection de 10 picolitres. Après la microinjection, prélevez les embryons injectés et lavez-les trois fois avec un milieu M16 frais. Chaque lavage peut durer moins d’une minute.

Ensuite, procédez à la culture des embryons en recouvrant le milieu M16 d’une goutte d’huile minérale pour éviter qu’il ne s’évapore, et en plaçant chaque embryon sur une boîte de culture en plastique sur une goutte de milieu M16. Toutes les 24 heures, observez les embryons à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser avec une optique DIC de 488 nanomètres ou 555 nanomètres à un grossissement de 200x. La néogénine s’exprime de manière transitoire au cours des premiers stades de développement de la préimplantation.

Il apparaît dès le stade à 2 cellules et dure jusqu’au stade précoce de morula. Son expression est principalement limitée spatialement à l’extérieur des cellules. Les niveaux d’expression de la néogénine ont été manipulés par micro-injection de zygotes 2-PN avec des vecteurs d’ADNc de néogénine, ou des vecteurs hébergeant un ARN en épingle à cheveux court contre la néogénine.

La DP et la PFG ont été exprimées en tant qu’indicateurs. Le niveau d’expression de la néogénine qui en résulte a été confirmé à la fois par immunofluorescence et par immunoblottage. Il n’y avait pas de différences morphologiques grossières dans la perte de néogénine ou le gain de néogénine chez les embryons, et ils ne se sont pas développés différemment jusqu’au stade de blastocyste.

Cependant, le développement de l’ICM était moins prononcé chez les embryons perdant de la néogénine, comme l’indiquent les cellules ICM positives du 3 et 4 octobre. En outre, il y avait plus de cellules ICM positives par blastocyste dans les embryons de gain de néogénine. Cette observation a été confirmée par l’analyse rtPCR.

Dans les embryons à gain de néogénine, les expressions d’Oct 3 et 4, de SOX2 et de Nanog ont été considérablement augmentées, contrairement à un changement d’expression négligeable dans Cdx2 et Tead4. Une fois maîtrisée, cette partie micro-injection de ce protocole peut être complétée en une heure environ. Lors de la tentative de ce protocole, gardez à l’esprit que l’embryon 2-PN sont des congélateurs d’isolement optimisé micro-injection sont la culture de l’embryon pour minimiser les dommages.

En complément de cette méthode procédurale, comme des études de médicaments, peut être effectuée pour répondre à des questions séculaires sur la voie de signalisation et ainsi de suite.