Name: Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Apprenez à quantifier les punctas de F-actine dans les neurones corticaux de rat par immunocytochimie et microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'évaluer l'intégrité synaptique et la plasticité dendritique.

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Ce travail a été financé par les subventions des NIH DA013137, DA031604 et HD043680. Un soutien partiel a été fourni par une subvention de formation NIH T32 en sciences biomédicales-comportementales.

Tous les protocoles d&#39;animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l&#39;utilisation Comité animale de l&#39;Université de la Caroline du Sud (numéro d&#39;assurance: A3049-01). 1. basse densité neuronale embryonnaire Culture <ol><li> Préparation pour la culture de neurones corticaux primaires <ol><li> Solutions: <ol><li> Préparer Poly-L-lysine solution mère en dissolvant 5 mg de poly-L-lysine dans 10 ml de tampon borate. </li><li> Préparer la solution de travail en diluant 1 ml Poly-L-lysine Stock dans 49 ml Tampon borate. </li><li> Préparer un tampon de borate, pH 8,4 en commençant par 395 DH 2 O, puis en ajoutant tous les ingrédients (1,24 g d&#39;acide borique + 1,9 g de borax). Ajuster le pH à 8,4 par 1 M NaOH. Ajuster à 400 ml et on filtre avec 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot. </li><li> Préparer la solution HBSS, pH 7,2 en commençant par 445 DH 2 O et en ajoutant tous les autres ingrédients (50 ml 10X HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Ajuster le pH à 7,2 par du HCl 1 N, bring à 500 ml et d&#39;un filtre de 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot. </li><li> Préparer le milieu de placage: DMEM / F12 avec du sérum de veau fœtal à 10%. Filtre à 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot. </li><li> Préparer un milieu de croissance complet: A 50 ml de milieu Neurobasal, ajouter les suppléments (500 ul Glutamax (100X) + 500 ul de glucose + 1 ml de B-27 (50X) + 500 pi de solution antibiotique-antimycotique (100X) + 100 ul de 7,5% bicarbonate de sodium. filtre à 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot. </li></ol></li><li> Deux jours avant la culture: <ol><li> Manteau de douze 35 mm plats à fond de verre avec 2 ml de solution de travail Poly-L-lysine, et garder sous le capot O / N. </li></ol></li><li> Un jour avant la culture: <ol><li> Agent d&#39;enrobage vide de la vaisselle et rincer à l&#39;ddH 2 O. Autoriser les plats à sécher pendant une heure sous une hotte. </li><li> Préparer le milieu placage (DMEM / F12 avec 10% de sérum de veau fœtal (10% de la solution totale). La pipette 2 ml de milieu danschaque plat, et incuber O / N à 37 ° C, 5% de CO 2. Note: Il est important d&#39;éviter les boîtes de culture en plastique lors de la culture. L&#39;utilisation de plats à fond de verre (pour microscopes inversés) ou des lamelles de verre (pour microscopes droits) donne des images nettes et claires. Par rapport à un plat en plastique à fond, le plat à fond de verre évite teintes indésirables ou l&#39;éblouissement pendant la microscopie à fluorescence. </li></ol></li></ol></li><li> Protocole de culture cellulaire: <ol><li> Mettez au réfrigérateur tampon HBSS (100-150 ml), 100 mm boîtes de Petri, des pinces, des ciseaux, tubes de 50 ml et 15 ml tubes sous lumière UV dans la hotte. </li><li> Euthanasier rat enceinte de l&#39;inhalation létale de 5% sévoflurane sous le capot extérieur de la salle de culture. </li><li> Stériliser avec EtOH à 70%, tente la peau de l&#39;abdomen inférieur à l&#39;aide des pinces pendant la coupe de la queue au milieu de l&#39;abdomen cavity.Open l&#39;utérus en utilisant des ciseaux pour exposer le placenta. </li><li> Retirer 8-10 fœtus E18. PlaCE 8-10 fœtus dans des boîtes de Pétri contenant une solution HBSS. </li><li> Maintenez l&#39;arrière de la tête du fœtus avec une pince, puis utilisez des ciseaux pour couper la tête du corps. Placez-le dans une autre boîte de Pétri remplie de 5-7 ml de HBSS. Transfert plat à capuche. </li><li> Remplir deux boîte de Pétri de 100 mm supplémentaire avec HBSS froid. </li><li> Peel crâne de côté, et Scoop cerveau dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de HBSS. </li><li> Utilisez une pince tranchants courbes, le cervelet et séparée du tronc cérébral du cerveau, puis transférer cerveau à une nouvelle boîte de Pétri avec HBSS froid en elle. </li><li> Utilisez des pinces pour fixer, séparer les hémisphères avec une pince courbes. Retirer méninges; isoler cortex frontal et des morceaux de transfert dans des tubes de 15 ml à centrifuger marqués. </li><li> Remplir le tube de 15 ml avec des produits frais 2 ml de HBSS et ajouter 20 ul de trypsine EDTA (10x mélange concentré avec 0,5% de trypsine et mM EDTA 5.3.) À chaque tube de 15 ml. </li><li> Incuber 10-15 min à température ambiante. Agitez doucement le tube toutes les quelques minutes, ne permettent pas de régler. </li><li> Un Fter 10-15 min, l&#39;utilisation pipette en verre pour enlever la vieille HBSS et rincer deux fois avec HBSS nouvelle. </li><li> Plongez dans l&#39;inhibiteur de trypsine (ml, inhibiteur de la trypsine 1 mg / 2 mg dans 2 ml de HBSS), bien mélanger et laisser reposer 5 min. Laver deux fois avec HBSS frais. </li><li> En utilisant une pipette en verre avec poire en caoutchouc, des morceaux de cerveau Broyez 10-15 fois très lentement afin d&#39;éviter bubbles.Triturate nouveau à l&#39;aide d&#39;une pipette calibrée et une pointe stérile avec un diamètre de pointe réduite très lentement jusqu&#39;à homogénéité. </li><li> Transfert dissocié les cellules à une densité désirée pour boîtes recouvertes culture (50 cellules / mm2) préparé au préalable. Incuber O / N à 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Après 24 heures, remplacer le milieu DMEM / F12 avec fraîchement préparé milieu Neurobasal de croissance complet sans sérum. </li><li> Maintenir les cellules à tout moment dans un CO 2/95% d&#39;air ambiante incubateur humidifié à 5% pendant au moins 12-14 jours avant l&#39;expérimentation. Compléter les cellules tous les 5-6 jours avec un milieu Neurobasal frais remplacer environ 50% de l&#39;ancien milieu. </li></ol></li></ol> 2. Marquage fluorescent et Immunocytochimie Remarque: Le marquage par immunofluorescence des cultures de cellules corticales primaires a été effectuée en 35 mm du fond des boîtes de culture cellulaire de verre avec un volume utile de 1 ml. <ol><li> Laver le plat à fond de verre à deux reprises avec un tampon phosphate salin pH 7,4 (PBS). </li><li> Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS et perméabiliser avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min. </li><li> Traiter les cellules pendant 20 min à température ambiante avec un colorant spécifique F-actine, AlexaFluor 488 phalloïdine (1h40, à 25 pi de phalloïdine dans 1 ml de PBS). </li><li> Rincer les cellules deux fois avec du PBS et bloquer avec 10% de sérum de chèvre normal à température ambiante pendant 1-2 heures. </li><li> Diluer l&#39;anticorps polyclonal de poulet anti-MAP2 (1: 2500) dans du PBS avec 2% de sérum de chèvre normal et incuber O / N à 4 ° C </li><li> Après l&#39;incubation, rincer deux fois dans PBS. </li><li> Diluer l&#39;anticorps secondaire (Alexa Red 594 chèvre conjugué IgG anti-poulet (1: 500) avec 2% de sérum de chèvre normal et incuber pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Rincer avec du PBS et ajouter 10 ul / plat du colorant Hoescht. </li><li> Incuber 3 min à température ambiante et laver avec du PBS deux fois. Remarque: Les cellules marquées maintenant prêt pour l&#39;étape 3 (de comptage de points lacrymaux F-actine). </li><li> Préserver échantillon de cellules avec 100 ul de antifade réactif comme agent de lamelles et de garder à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant le stockage à long terme. Remarque: phalloïdine est relativement stable dans du PBS à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant 1 semaine et la fluorescence peut être conservé avec Antifade réactifs de lamelles. Cependant, les images optimaux sont obtenus à partir de 1-3 jours après coloration depuis phalloïdine peut commencer à diffuser à l&#39;extérieur avec un stockage prolongé. </li></ol> 3. F-actine punctas comptage <ol><li> Allumez microscope à fluorescence et de passer à 20 × objectif. logiciel de microscope ouverte, et mis en place le programme de 1280 × 960 pixels taille de l&#39;image, et de 0,17 um / pixel de résolution d&#39;image à 1 × zoom. </li><li> Acquérir des images de co-marqué F-actine / neurones MAP2 sous le drapeau vert (495 nm) / rouge (613 nm) canaux fluorescents. </li><li> Choisissez 5 Green (F-actine) / Rouge (MAP2) immuno / Bleu (Hoescht) images fluorescentes de neurone individuel avec arbres dendritiques clairement définis. </li><li> Identifier les structures riches F-actine dans second ordre segments dendritiques (plage de longueur 25-75 um) avec immunofluorescence MAP2 continue. </li><li> Tournez la région sélectionnée d&#39;images à un niveau horizontal. Copier et coller comme une nouvelle image. </li><li> Soustraire l&#39;arrière-plan des images, en utilisant une cohérentes ajustements pour chaque plat. </li><li> Comptez le vert F-actine puncta lumineux et tracer la longueur du segment dendritique sélectionné manuellement par des observateurs indépendants formés. Exporter les données vers un fichier tableur. </li><li> Calculer la masse volumique en divisant F-actine marqué puncta totale (N) par la longueur (L) de la MAP2 marqué dendrites. Data Express que le nombre de F-acétain puncta par 10 um de Dendrite Remarque: punctas (taille ≤1.5 um) de la fluorescence F-actine avec une intensité de pic d&#39;au moins 50% au-dessus de l&#39;intensité moyenne de la coloration de l&#39;arbre dendritique ont été inclus dans chaque segment sélectionné dendritique. </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Dans ce protocole, nous décrivons la culture de neurones corticaux de rat à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, qui nous permet d&#39;identifier les dendrites des neurones individuels. Ensuite, nous utilisons phalloïdine et MAP2 coloration pour détecter les changements dendritiques. Ensuite, nous avons utilisé un logiciel spécialisé pour quantifier les changements dans puncta F-actine. Pour déterminer les changements dans puncta F-actine l&#39;ensemble du réseau neuronal ...

L&#39;objectif principal de cette étude est de développer une méthode fiable de mesure (estimation) de l&#39;intégrité synaptique du réseau dendritique neuronale. Nous décrivons ici la quantification des points lacrymaux F-actine dans rat primaire des neurones en culture en utilisant une combinaison de phalloïdine coloration et immunocytochimique (ICC) détection des dendrites avec une analyse ultérieure en utilisant (NIS-Elements) spécialisée logiciel. Phallotoxins marquées ont une affinité similaire pour les grands et petits filaments (F-actine), mais ne se lient pas à monomère actine globulaire (G-actine), contrairement à certains anticorps d&#39;actine 1. La liaison non spécifique de phalloïdine est négligeable, offrant ainsi fond minimal lors de l&#39;imagerie cellulaire. Phalloïdine est beaucoup plus faible que les anticorps qui sont généralement utilisées pour marquer les protéines cellulaires par microscopie à fluorescence, ce qui permet beaucoup plus intense marquage de l&#39;actine F par la phalloïdine. Ainsi, des images détaillées de localisation F-actine dans les neurones peuvent êtreobtenue grâce à l&#39;utilisation de phalloïdine marquée. Phalloïdine (F-actine) coloration des dendrites neuronales génère discrets &quot;points chauds&quot; ou brillant &quot;puncta», qui représentent une variété de structures dendritiques, y compris les épines matures, synapses non épineuses 2 et épines immatures. Épines immatures comprennent filopodes minces et certaines formes de correctif morphologie, et peuvent représenter l&#39;ouverture d&#39;spinogenèse 3. Épines immatures et des correctifs non-épineux manquent PSD95 4. Evolution de la production de plomb F-actine des variations ultérieures non seulement épines mais aussi des structures dendritiques supplémentaires, faisant ainsi phalloïdine un outil important pour étudier l&#39;intégrité synaptodendritic 5-7. En général, le nombre de phalloïdine-positive (F-actine) puncta reflètent un équilibre entre les synapses actives (excitateurs et inhibiteurs), dynamique de l&#39;actine et de la stabilité de la synapse 8. Bien qu&#39;il soit important d&#39;étudier spécifique types de synapses (c.-à épines excitateurs), lorsque la cible d&#39;un traitement est inconnue, il faut d&#39;abord évaluer l&#39;intégrité générale d&#39;une variété de structures dendritiques. Depuis F-actine est une composante majeure des épines dendritiques et d&#39;autres structures, y compris les synapses inhibitrices, un nombre altéré de puncta F-actine peut indiquer un synaptopathy. Cette synaptopathy peut alors être étudiée plus pour des modifications plus spécifiques. Notre méthode de quantification pour détecter plusieurs types synaptiques / structures donne une estimation globale des modifications synaptiques dendritiques (augmentations et diminutions) suivantes divers traitements expérimentaux.

<table><tbody><tr><td>Plats à fond en verre de 35 mm n° 1.5 coverglass</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique solution</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Instruments de précision</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval normal</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Poulet polyclonal anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594 Chèvre conjuguée anti-poulet IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Coloration à cellules vivantes ReadyProbes Réactif Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements progiciel</td><td>Nikon Instruments</td> Nikon Eclipse <td></td><td></td></tr><tr><td>TE2000-E microscope fluorescent inversé contrôlé par ordinateur&nbsp ;</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu ; m Filtre à membrane en nylon Nalgene</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification des filamenteuses actine (f-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamenteux protéine d&#39;actine (actine F) joue un rôle majeur dans spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. L&#39;évolution des structures riches dendritiques F-actine suggèrent des modifications dans l&#39;intégrité synaptique et la connectivité. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la culture de rat primaires neurones corticaux, phalloïdine coloration pour puncta F-actine, et les techniques de quantification ultérieures. Tout d&#39;abord, le cortex frontal des embryons de rat E18 sont dissociées dans une culture de cellules de faible densité, alors les neurones cultivés in vitro pendant au moins 12-14 jours. Après un traitement expérimental, les neurones corticaux sont colorées avec AlexaFluor 488 phalloïdine (pour marquer les points lacrymaux F-actine dendritique) et associée aux microtubules protein 2 (MAP2; pour valider les cellules neuronales et l&#39;intégrité dendritique). Enfin, un logiciel spécialisé est utilisé pour analyser et quantifier les dendrites neuronales choisis au hasard. F-actine structures riches sont identifiés sur le deuxième ordre branches dendritiques (gamme 25-75 et de la longueur# 181; m) avec immunofluorescence MAP2 continue. Le protocole présenté ici sera une méthode utile pour étudier l&#39;évolution des structures des synapses dendritiques subséquentes à des traitements expérimentaux.

Dans les présentes méthodes, nous avons d&#39;abord rat de culture de neurones corticaux à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, ce qui nous permet d&#39;identifier les dendrites des neurones individuels. Sur la figure 1, le contraste interférentiel différentiel (DIC) images montrent les changements morphologiques dans le développement foetal neurones corticaux de rat aux jours 4, 6, 10, 14, 21 et 27 in vitro. A noter que la longueur et le nomb...

L’actine filamenteuse (F-actine) joue un rôle important dans la spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. La quantification de l’actine F est donc un outil utile pour étudier l’intégrité des structures synaptiques. Ce protocole décrit les procédures de quantification des points d’actine F marqués à la phalloïdine dans des cultures neuronales corticales primaires de faible densité.

Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

L'objectif général de cette quantification des points de F-actine dans des neurones en culture est d'introduire une méthode utile pour étudier l'intégrité et la cognitivité des structures synaptiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences concernant la spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit un protocole détaillé pour la culture neuronale primaire, suivi de l'identification et de la quantification des points de F-actine.Lorsque l'objectif à atteindre est inconnu, il est nécessaire d'estimer l'intégrité générale des structures fondatrices de la rétine. Nous avons eu l'idée de cette méthode en étudiant les lésions neuronales induites par des drogues d'abus telles que la cocaïne, et par des protéines toxiques du VIH telles que tat et JP 120. Deux jours avant la mise en place de la culture, recouvrir 12 à 35 boîtes de culture de 35 mm à fond en verre avec deux millilitres de solution working de poly-L-lysine. Conserver les boîtes dans la hotte pendant la nuit afin de maintenir leur stérilité.Le lendemain, jeter l'agent d'enduction et rincer les boîtes avec de l'eau doublement distillée. Laisser sécher les boîtes pendant une heure sous la hotte. Ensuite, transférer deux millilitres de milieu de culture dans chaque boîte.Et incuber les boîtes pendant toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour de la culture, placer le cerveau récolté dans une boîte de Pétri contenant du HBSS froid. Ensuite, en maintenant fermement le cerveau avec des pinces, utiliser des pinces courbes pour séparer les hémisphères et retirer les méninges.Isolez les cortèxes frontaux et transférez les morceaux dans un tube de centrifugation stérile de 15 millilitres. Ajoutez deux millilitres de HBSS frais et 20 microlitres de trypsine-EDTA dans le tube, puis incubez les tissus nerveux pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, en agitant doucement de temps en temps.À la fin de l'incubation, utilisez une pipette en verre pour aspirer tout l'HBSS ancien. Rincez ensuite les corticaux deux fois avec de l'HBSS frais. Après le deuxième lavage, immergez le tissu dans l'inhibiteur de trypsine.Mélangez bien et laissez l'échantillon reposer cinq minutes à température ambiante. Lavez ensuite les tissus deux fois avec du HBSS frais. Utilisez maintenant une pipette en verre munie d'une poire en caoutchouc pour triturer très lentement les morceaux de cerveau de 10 à 15 fois.Ensuite, à l’aide d’une pipette calibrée équipée d’une pointe stérile à diamètre réduit, triturez très lentement la suspension tissulaire une nouvelle fois. Lorsque la solution est homogène, ensemencez les cellules à la densité appropriée dans les boîtes de culture pré-enduites pour une incubation nocturne dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 24 heures, remplacez le milieu d’ensemencement par un milieu basal étroit complet, sans sérum, fraîchement préparé.Et remettre les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins 12 à 14 jours. La mise en place à faible densité est importante pour visualiser les neurones individuels. Et le milieu basal pour neurones est essentiel pour minimiser la perforation des astrocytes au sein des cultures cellulaires.Pour marquer les cellules en immunocytochimie, lavez d'abord la boîte de culture cellulaire à fond en verre deux fois avec du PBS. Fixez ensuite les cellules avec du paraformaldéhyde à quatre pour cent pendant 15 minutes à température ambiante, puis effectuez deux lavages au PBS.Ensuite, perméabilisez les cellules avec du Triton X-100 à 0,1 pour cent dans du PBS pendant cinq minutes, puis étiquetez-les avec une coloration spécifique de l'F-actine à température ambiante. Après 20 minutes, rincez les cellules deux fois avec du PBS et bloquez toute coloration non spécifique de la surface cellulaire à l'aide de 10 % de sérum de chèvre normal. À la fin de l'incubation, étiquetez les cellules pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un anticorps polyclonal de poule anti-map2.Le lendemain matin, rincer les cellules deux fois avec du PBS et les marquer avec l'anticorps secondaire approprié. Après deux heures à température ambiante, rincer à nouveau les cellules avec du PBS, puis les marquer avec 10 microlitres de huxs pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, laver les cellules deux fois supplémentaires avec du PBS et les conserver avec 100 microlitres de réactif anti-décoloration.Dans les trois jours suivant cette coloration, allumez le microscope à fluorescence et sélectionnez l'objectif 20 X. Ensuite, dans le logiciel du microscope, réglez la taille de l'image en pixels à 1600 par 1200 et la résolution de l'image à 0,17 micron par pixel avec un zoom de 1 X. Transférez la boîte de cellules sur la platine du microscope.Et acquérir des images des neurones MAP2 et F-actine marqués en co-immunomarquage selon les canaux fluorescents vert et rouge. Une fois toutes les images obtenues, choisir cinq images de neurones individuels dans les canaux vert, rouge et bleu présentant des arbres dendritiques bien définis. Et utiliser l'immunofluorescence continue MAP2 pour identifier les structures riches en F-actine situées dans les segments dendritiques de second ordre.Faites pivoter horizontalement la région sélectionnée d'images. Copiez et collez ensuite cette région comme une nouvelle image. Soustrayez ensuite la fluorescence de fond de l'image et utilisez le logiciel pour compter le nombre de puncta brillants de F-actine en vert.Utilisez des observateurs indépendants formés pour mesurer la longueur des segments dendritiques sélectionnés. Ensuite, exportez les nombres de puncta et les données de longueur des segments dendritiques vers un fichier de feuille de calcul. Assurez-vous que les observateurs incluent les puncta de posture de l'F-actine présentant une intensité de fluorescence rose d'au moins 50 % supérieure à l'intensité moyenne de coloration dans la tige dendritique de chaque segment sélectionné.Enfin, calculez la densité selon la formule, en exprimant les données comme le nombre de points de F-actine par dix micromètres de dendrite. Ici, les images en contraste interférentiel différentiel montrent les changements morphologiques observés dans les neurones corticaux fœtaux de rat en cours de développement aux jours 4 à 27 en culture. Remarquez l'augmentation de la longueur et du nombre des dendrites au fur et à mesure que les neurones primaires de rat en culture mûrissent.Étant donné que le marquage de l'F-actine par la phalloïdine est très rapide, il est possible d'estimer visuellement l'intégrité du réseau synapto-dendritique avant de procéder au marquage immunocytochimique par anticorps. Map2 marque les dendrites intactes, confirmant ainsi que les points de F-actine se situent sur les dendrites neuronales et ne sont pas localisés dans d'autres cellules, telles que les astrocytes. Sur des images haute résolution, on peut observer des structures riches en F-actine contenant des filopodes phi, des prolongements en épines et des taches de F-actine.Dans cette expérience visant à évaluer les lésions synapto-dendritiques induites par la protéine Tat du VIH-1, la coloration de Map2 a révélé une réduction du nombre de branches dendritiques et une diminution de l’F-actine dans les neurones corticaux de rat après traitement par la protéine Tat du VIH-1. En effet, le nombre de points fluorescents d’F-actine augmente ou diminue en réponse au traitement expérimental. Par exemple, dans cette expérience, lorsque les neurones en culture ont été traités avec le bloqueur non compétitif des récepteurs NMDA, la mémantine, les points positifs pour l’F-actine ont présenté une augmentation significative de leur densité.En revanche, le traitement combiné à la méthamphétamine et à la protéine Tat du VIH1 a entraîné une perte significative des points de F-actine. Après avoir acquis des images haute résolution des neurones Map2 marqués pour la F-actine, veillez à ce que deux observateurs formés sélectionnent des segments des dendrites de second ordre afin d'analyser les densités de points. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche en neurosciences.Non seulement pour la surveillance des synaptopathies aiguës, mais aussi pour l'étude de la récupération synaptique et des processus expérimentaux de restauration neuronale. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise au point d'une méthode fiable permettant de mesurer l'intégrité synaptique du réseau dendritique neuronal.

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Ce protocole de détails comment quantifier le numéro de synapses neuronales dans la culture à la fois dissociées et dans les sections du cerveau en utilisant l'immunocytochimie. En utilisant des anticorps spécifiques du compartiment, nous appelons les terminaux présynaptiques ainsi que des sites de spécialisation post-synaptiques. Nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux générés par ces marqueurs.

Synapses Quantifier: un dosage à base d&#39;immunocytochimie Quantifier Nombre Synapse

Une méthode de visualiser et de quantifier la F-actine se termine barbelés dans les cônes de croissance neuronale est décrite. Après les neurones en culture sur des lamelles en verre, les cellules sont perméabilisées avec une solution contenant de la saponine. Ensuite, une courte incubation avec le tampon de la saponine contenant rhodamine-actine intègre actine fluorescente sur l'actine se termine sans barbelés.

Etiquetage F-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées

Cette vidéo montre la procédure de coloration fluorescente des neurones corticaux de rat pour la microscopie. Il cible l’actine F et les protéines dendritiques pour analyser l’intégrité structurelle et calculer la densité de l’actine F, ce qui est crucial pour l’étude de la fonction neuronale et de la santé.

Quantification de l’actine ponctuée filamenteuse dans les neurones corticaux du rat

Nous présentons une solution logicielle pour le suivi semi automatisé de la concentration relative de protéines sur toute la longueur des protrusions cellulaires dynamiques.

Une interface utilisateur graphique pour le suivi assisté par logiciel de la concentration de protéines dans les protrusions cellulaires dynamiques

Début endosome fonctions dépendent de la polymérisation de l’actine-F. Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à biochimiques et génétiques manipulations.

In Vitro Polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces

Présenté ici est la méthode du tube mis à jour le rouleau pour la culture et intermittent une imagerie du cerveau rongeur tranches sur plusieurs semaines avec un repositionnement précis sur couvre-objet en photodécoupe. Viabilité neuronale et la morphologie de la tranche sont bien entretenus. Sont prévues des adaptations de ce système entièrement fermé à l’aide de virus pour l’expression spécifique de type cellulaire.

Mis à jour le rouleau Tube méthode d’imagerie Intermittent précisément localisé et répétitif au cours de la Culture à long terme des tranches de cerveau dans un système fermé

Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

Nous rapportons une analyse simple, rapide et à haut débit basée sur la spectroscopie de fluorescence pour la quantification des filaments d’actine dans des échantillons biologiques ex vivo des tissus cérébraux des rongeurs et des sujets humains.

Un test basé sur la spectroscopie de fluorescence à temps efficace pour évaluer l’état de polymérisation de l’actine dans les tissus cérébraux des rongeurs et des humains

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

DetectSyn est un test fluorescent rapide et impartial qui mesure les changements dans le nombre relatif de synapses (engagement pré- et postsynaptique) entre les traitements ou les états pathologiques. Cette technique utilise une technique de ligature de proximité qui peut être utilisée à la fois dans les neurones cultivés et les tissus fixes.

DetectSyn: Une méthode fluorescente rapide et impartiale pour détecter les changements dans la densité des synapses

Le présent protocole décrit une méthode pour visualiser et mesurer les anneaux d’actine et d’autres composants du squelette périodique membranaire du segment initial de l’axone à l’aide de neurones hippocampiques de rat cultivés et d’une microscopie à illumination structurée en 3D (3D-SIM).

Mesure des propriétés du squelette périodique membranaire du segment initial de l’axone à l’aide de la microscopie à éclairage structuré en 3D (3D-SIM)

Apprenez à quantifier les punctas de F-actine dans les neurones corticaux de rat par immunocytochimie et microscopie à fluorescence. Cette méthode permet d'évaluer l'intégrité synaptique et la plasticité dendritique.

Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

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