Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

L'objectif général de cette quantification des points de F-actine dans des neurones en culture est d'introduire une méthode utile pour étudier l'intégrité et la cognitivité des structures synaptiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences concernant la spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit un protocole détaillé pour la culture neuronale primaire, suivi de l'identification et de la quantification des points de F-actine.

Lorsque l'objectif à atteindre est inconnu, il est nécessaire d'estimer l'intégrité générale des structures fondatrices de la rétine. Nous avons eu l'idée de cette méthode en étudiant les lésions neuronales induites par des drogues d'abus telles que la cocaïne, et par des protéines toxiques du VIH telles que tat et JP 120. Deux jours avant la mise en place de la culture, recouvrir 12 à 35 boîtes de culture de 35 mm à fond en verre avec deux millilitres de solution working de poly-L-lysine. Conserver les boîtes dans la hotte pendant la nuit afin de maintenir leur stérilité.

Le lendemain, jeter l'agent d'enduction et rincer les boîtes avec de l'eau doublement distillée. Laisser sécher les boîtes pendant une heure sous la hotte. Ensuite, transférer deux millilitres de milieu de culture dans chaque boîte.

Et incuber les boîtes pendant toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le jour de la culture, placer le cerveau récolté dans une boîte de Pétri contenant du HBSS froid. Ensuite, en maintenant fermement le cerveau avec des pinces, utiliser des pinces courbes pour séparer les hémisphères et retirer les méninges.

Isolez les cortèxes frontaux et transférez les morceaux dans un tube de centrifugation stérile de 15 millilitres. Ajoutez deux millilitres de HBSS frais et 20 microlitres de trypsine-EDTA dans le tube, puis incubez les tissus nerveux pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, en agitant doucement de temps en temps.

À la fin de l'incubation, utilisez une pipette en verre pour aspirer tout l'HBSS ancien. Rincez ensuite les corticaux deux fois avec de l'HBSS frais. Après le deuxième lavage, immergez le tissu dans l'inhibiteur de trypsine.

Mélangez bien et laissez l'échantillon reposer cinq minutes à température ambiante. Lavez ensuite les tissus deux fois avec du HBSS frais. Utilisez maintenant une pipette en verre munie d'une poire en caoutchouc pour triturer très lentement les morceaux de cerveau de 10 à 15 fois.

Ensuite, à l’aide d’une pipette calibrée équipée d’une pointe stérile à diamètre réduit, triturez très lentement la suspension tissulaire une nouvelle fois. Lorsque la solution est homogène, ensemencez les cellules à la densité appropriée dans les boîtes de culture pré-enduites pour une incubation nocturne dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 24 heures, remplacez le milieu d’ensemencement par un milieu basal étroit complet, sans sérum, fraîchement préparé.

Et remettre les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins 12 à 14 jours. La mise en place à faible densité est importante pour visualiser les neurones individuels. Et le milieu basal pour neurones est essentiel pour minimiser la perforation des astrocytes au sein des cultures cellulaires.

Pour marquer les cellules en immunocytochimie, lavez d'abord la boîte de culture cellulaire à fond en verre deux fois avec du PBS. Fixez ensuite les cellules avec du paraformaldéhyde à quatre pour cent pendant 15 minutes à température ambiante, puis effectuez deux lavages au PBS.

Ensuite, perméabilisez les cellules avec du Triton X-100 à 0,1 pour cent dans du PBS pendant cinq minutes, puis étiquetez-les avec une coloration spécifique de l'F-actine à température ambiante. Après 20 minutes, rincez les cellules deux fois avec du PBS et bloquez toute coloration non spécifique de la surface cellulaire à l'aide de 10 % de sérum de chèvre normal. À la fin de l'incubation, étiquetez les cellules pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un anticorps polyclonal de poule anti-map2.

Le lendemain matin, rincer les cellules deux fois avec du PBS et les marquer avec l'anticorps secondaire approprié. Après deux heures à température ambiante, rincer à nouveau les cellules avec du PBS, puis les marquer avec 10 microlitres de huxs pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, laver les cellules deux fois supplémentaires avec du PBS et les conserver avec 100 microlitres de réactif anti-décoloration.

Dans les trois jours suivant cette coloration, allumez le microscope à fluorescence et sélectionnez l'objectif 20 X. Ensuite, dans le logiciel du microscope, réglez la taille de l'image en pixels à 1600 par 1200 et la résolution de l'image à 0,17 micron par pixel avec un zoom de 1 X. Transférez la boîte de cellules sur la platine du microscope.

Et acquérir des images des neurones MAP2 et F-actine marqués en co-immunomarquage selon les canaux fluorescents vert et rouge. Une fois toutes les images obtenues, choisir cinq images de neurones individuels dans les canaux vert, rouge et bleu présentant des arbres dendritiques bien définis. Et utiliser l'immunofluorescence continue MAP2 pour identifier les structures riches en F-actine situées dans les segments dendritiques de second ordre.

Faites pivoter horizontalement la région sélectionnée d'images. Copiez et collez ensuite cette région comme une nouvelle image. Soustrayez ensuite la fluorescence de fond de l'image et utilisez le logiciel pour compter le nombre de puncta brillants de F-actine en vert.

Utilisez des observateurs indépendants formés pour mesurer la longueur des segments dendritiques sélectionnés. Ensuite, exportez les nombres de puncta et les données de longueur des segments dendritiques vers un fichier de feuille de calcul. Assurez-vous que les observateurs incluent les puncta de posture de l'F-actine présentant une intensité de fluorescence rose d'au moins 50 % supérieure à l'intensité moyenne de coloration dans la tige dendritique de chaque segment sélectionné.

Enfin, calculez la densité selon la formule, en exprimant les données comme le nombre de points de F-actine par dix micromètres de dendrite. Ici, les images en contraste interférentiel différentiel montrent les changements morphologiques observés dans les neurones corticaux fœtaux de rat en cours de développement aux jours 4 à 27 en culture. Remarquez l'augmentation de la longueur et du nombre des dendrites au fur et à mesure que les neurones primaires de rat en culture mûrissent.

Étant donné que le marquage de l'F-actine par la phalloïdine est très rapide, il est possible d'estimer visuellement l'intégrité du réseau synapto-dendritique avant de procéder au marquage immunocytochimique par anticorps. Map2 marque les dendrites intactes, confirmant ainsi que les points de F-actine se situent sur les dendrites neuronales et ne sont pas localisés dans d'autres cellules, telles que les astrocytes. Sur des images haute résolution, on peut observer des structures riches en F-actine contenant des filopodes phi, des prolongements en épines et des taches de F-actine.

Dans cette expérience visant à évaluer les lésions synapto-dendritiques induites par la protéine Tat du VIH-1, la coloration de Map2 a révélé une réduction du nombre de branches dendritiques et une diminution de l’F-actine dans les neurones corticaux de rat après traitement par la protéine Tat du VIH-1. En effet, le nombre de points fluorescents d’F-actine augmente ou diminue en réponse au traitement expérimental. Par exemple, dans cette expérience, lorsque les neurones en culture ont été traités avec le bloqueur non compétitif des récepteurs NMDA, la mémantine, les points positifs pour l’F-actine ont présenté une augmentation significative de leur densité.

En revanche, le traitement combiné à la méthamphétamine et à la protéine Tat du VIH1 a entraîné une perte significative des points de F-actine. Après avoir acquis des images haute résolution des neurones Map2 marqués pour la F-actine, veillez à ce que deux observateurs formés sélectionnent des segments des dendrites de second ordre afin d'analyser les densités de points. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche en neurosciences.

Non seulement pour la surveillance des synaptopathies aiguës, mais aussi pour l'étude de la récupération synaptique et des processus expérimentaux de restauration neuronale. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise au point d'une méthode fiable permettant de mesurer l'intégrité synaptique du réseau dendritique neuronal.