Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans Arabidopsis Roots pour surveiller cellulaire spécifique d'un tissu mural Modifications

L’objectif global de cette préparation de coupe efficace anatomique est de quantifier l’accumulation relative de cristaux et de cellulose à la résolution cellulaire, permettant des comparaisons directes entre les différents tissus de la racine primaire d’Arabidopsis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie et du développement des plantes, telles que la façon dont la composition cellulaire d’un type de cellule donné affecte la croissance de l’ensemble d’organes. Après avoir stérilisé les graines d’Arabidopsis conformément au protocole textuel, étalez les graines stériles sur des plaques contenant 0,8 % de gélose végétale et 0,5 % de milieu XM.

Avec du parafilm, enveloppez les plaques et recouvrez de papier d’aluminium. Conservez les plaques à 4 degrés Celsius pendant un à quatre jours pour favoriser une germination uniforme. Transférez ensuite les plaques dans une chambre de croissance adaptée à la culture des semis d’Arabidopsis, en orientant les plaques verticalement pour maintenir la croissance des racines au-dessus du milieu gélosé Préparez la solution de Richardson selon le protocole de texte Filtrez à travers une unité de filtre PVD de 0,22 micron entraînée par seringue avant utilisation.

Ensuite, sous une hotte chimique, préparez 50 millilitres de fixateur en combinant 38 ml de cacodylate de sodium 0,5M avec 2,5 ml de glutaraldéhyde. Ajoutez ensuite 100 microlitres de la solution de Richardson à la solution de fixation pour générer la solution de fixation finale. Utilisez une plaque pré-marquée, puis placez 2 à 3 ml de solution de fixation finale dans les puits afin que la solution recouvre entièrement les semis.

À l’aide d’une pince en plastique, transférez soigneusement jusqu’à 10 plants dans chaque puits. Utilisez du parafilm pour sceller les plaques avant de les stocker dans l’obscurité à 4 degrés Celsius pendant au moins une nuit et jusqu’à une semaine. Pour déshydrater les semis fixés, utilisez des pinces pour ramasser les plantes et les transférer dans les puits de nouvelles plaques à six puits marquées contenant des concentrations croissantes d’éthanol pour les temps indiqués ici.

Préparez le milieu d’infiltration dans une petite bouteille en verre en mélangeant le contenu d’un sachet de Historesin Activator avec 50 ml de liquide de résine basique. Insérez un aimant et remuez la solution sur une plaque d’agitation pendant 20 minutes. Remplissez les puits étiquetés d’une plaque à six puits avec 2 à 3 ml de milieu d’infiltration.

Ensuite, lorsque les plantules sont complètement déshydratées, utilisez une pince pour les transférer de la solution d’éthanol à 95 % au milieu d’infiltration, en veillant à ce qu’ils soient entièrement recouverts par le milieu. Conservez les échantillons à 4 degrés Celsius pendant au moins quatre jours pour assurer une pénétration maximale dans les tissus végétaux. Pour préparer les blocs, placez de petites étiquettes marquées au crayon avec le nom de l’échantillon à l’intérieur de chaque moule d’enrobage de puits.

Préparez le milieu d’enrobage en ajoutant 1 ml de durcisseur à 15 ml de milieu d’infiltration. Avec environ 200 microlitres de milieu d’enrobage, remplissez la moitié de chaque puits dans le moule. Et utilisez un morceau de film suspendu pour couvrir le moule avec 1 ml supplémentaire de chaque côté.

Incuber les moules à température ambiante pendant au moins deux heures pour permettre une polymérisation partielle. Ensuite, préparez un lot supplémentaire de milieu d’enrobage et gardez-le bien en place pour éviter la polymérisation pendant que les pointes des racines sont disposées dans le moule. Ajoutez le milieu d’enrobage dans une petite assiette et placez un semis dans un milieu.

Sous une lunette de dissection, utilisez un scalpel pour couper chaque pointe de racine, puis positionnez-la très soigneusement dans le moule à environ 2 à 3 mm de la périphérie du moule, soit verticalement pour les sections de transfert, soit horizontalement pour les sections longitudinales. Après avoir disposé le tissu, utilisez un support d’enrobage pour remplir complètement le moule et recouvrez d’un film aérien. Incuber ensuite à température ambiante pendant au moins deux heures Pour sécher les blocs, placez-les dans un dessiccateur avec du gel de silice sec et laissez-les à température ambiante pendant la nuit.

À l’aide d’un coutelier équipé d’un outil d’inciseur de diamant, préparez des couteaux en verre à partir de tiges de verre, en coupant la route de verre en carré, puis en coupant le carré en diagonale pour produire deux couteaux. Vérifiez que les deux couteaux ont des bords tranchants. Montez un bloc dans un support.

Ensuite, avec une lame industrielle à un seul tranchant, retirez l’excédent de matériau du bloc jusqu’à un mm de l’extrémité de la racine pour obtenir une forme pyramidale. Divisez le bloc façonné en tranches de 2 à 3 microns de largeur et transférez les tranches sur une lame de verre marquée. Ajoutez ensuite des gouttelettes d’eau sur les tranches.

Il est important de préparer des sections de largeur uniforme afin de minimiser la variabilité des données analysées. Placez les lames de verre sur les blocs chauffants réglés à feu doux jusqu’à ce que l’eau s’évapore. Pour préparer les lames à visualiser au microscope polarisé, diluez la solution de Richardson à 2 % de la solution d’origine et utilisez environ 1 ml pour couvrir les tranches.

Placez ensuite les échantillons sur le bloc chauffant pendant 5 secondes et utilisez de l’eau distillée pour les laver. Après avoir séché les lames sur la plaque chauffante, observez les tranches sous un microscope de dissection et utilisez un marqueur pour marquer le dos d’une lame afin d’indiquer la position des tranches d’intérêt. Ajoutez 100 microlitres de support de montage avant de recouvrir avec la lamelle.

Image et analyse selon le protocole texte. Voici une coupe transversale de la racine primaire d’Arabidopsis avec l’organisation radiale de ses cellules et tissus constitutifs, y compris les cellules non ciliées, les cellules ciliées et le cortex. Cette image confocale montre l’expression de BRI1-GFP dans les cellules non ciliées dans un fond mutant BRI1 qui inhibe l’expansion unidirectionnelle des cellules voisines et la croissance de la racine entière.

Comme on le voit ici, les coupes longitudinales des racines obtenues à partir du type sauvage et des lignes exprimant BRI1 dans les cellules non ciliées ont montré une orientation similaire des microfibrilles de cellulose avec une grande variabilité des angles présents dans les cellules méristématiques par rapport aux cellules de la zone de transition. Cela permet de comparer l’accumulation relative de cristaux dans la cellulose dans les cellules méristématiques et allongées correspondantes des deux fonds génétiques, comme le montrent ici les coupes efficaces, et révèle une corrélation entre l’expression de BRI1 dans les cellules non ciliées et une forte accumulation locale de cristaux dans la cellulose. Généralement, dans les vidéos, les nouveaux venus dans cette méthode auront du mal car il est difficile d’obtenir des racines bien orientées lors de la procédure d’encastrement.

Par conséquent, plusieurs blocs doivent être préparés pour le sectionnement. Une fois masterisé, une section d’un seul bloc peut être réalisée en 2 à 3 heures. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’accumulation de cristaux dans la cellulose est comparable entre les cellules si elles ont une orientation similaire de ses microfibrilles de cellulose, telle que déterminée par les coupes longitudinales.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fixer les semis d’Arabidopsis et de les intégrer dans des blocs, puis de préparer des sections transversales de racines longitudinales et transversales. Vous devez également avoir un bon aperçu des données qui peuvent être obtenues en utilisant la microscopie à lumière polarisée.