Name: Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans Arabidopsis Roots pour surveiller cellulaire spécifique dun tissu mural Modifications (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Découvrez la quantification de la cellulose cristalline à résolution cellulaire dans les racines d'Arabidopsis par microscopie à lumière polarisée. Cette méthode permet d'analyser la composition pariétale et de comparer les tissus.

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Nous remercions le Dr M. Rosenberg pour ses conseils et son aide pour la coupe anatomique. Nous remercions également D. Eisler pour son assistance technique. Cette recherche a été soutenue par des subventions du FP7-PEOPLE-IRG-2008, Recherche et développement agricoles binationaux (BARD ; IS-4246-09) et la Fondation israélienne des sciences (ISF ; 592/13).

1. Croissance des végétaux <ol><li> Stériliser la surface des graines. <ol><li> Stériliser les graines (jusqu&#39;à 30 mg) par voie humide ou sèche. A titre d&#39;exemple, pour la méthode de stérilisation à sec, ajouter HCl 1 ml glacial 37% dans 50 ml eau de Javel, dans un récipient en verre dans un dessiccateur fermé pendant au moins 4 heures et jusqu&#39;à la nuit. Effectuez cette étape dans une hotte chimique. </li></ol></li><li> Etaler les semences stériles sur des plaques avec la gélose végétale de 0,8% en 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS). Envelopper les plaques avec Parafilm ou ruban poreux et couvrir de papier d&#39;aluminium. </li><li> Stocker les plaques à 4 ° C pendant 1 - 4 jours pour favoriser la germination uniforme. </li><li> Transférer les plaques dans une chambre convenable pour la culture de plants d&#39;Arabidopsis de croissance. Placer les plaques verticalement afin d&#39;assurer la croissance des racines sur du milieu d&#39;agar et d&#39;empêcher la pénétration. </li><li> plantules de transfert à fixateur 7 jours après la germination (DAG). </li></ol> 2. Fixation <ol><li> Préparer 50 ml Richardson Solution en combinant des volumes égaux de 1% Borax (agent tampon), 1% de bleu de méthylène et 1% Azure (colorants histologiques) dans de l&#39;eau distillée deux fois. Filtrer à travers un Seringue Driven 0,22 um PVDF filtre Unité avant utilisation. </li><li> Préparer 50 ml de fixatif: 1,25% de glutaraldéhyde dans du cacodylate de sodium 0,05 M (agent tampon). Remarque: Ces matériaux sont toxiques et doivent être manipulés dans une hotte chimique. </li><li> Ajouter 100 pi de solution Richardson (voir 2.1) à la solution de fixation (voir 2.2) pour obtenir la solution finale de fixation. </li><li> Mark chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits avec le nom de l&#39;échantillon correspondant. </li><li> Placez 2 - 3 ml solution finale de fixation (voir 2.3) dans les puits, de sorte que les semis, une fois transférés, seront entièrement couverts en liquide. </li><li> transférer avec précaution, en utilisant une pince, jusqu&#39;à 10 plants à chaque puits. Sceller les plaques à l&#39;aide de Parafilm. Conserver à 4 ° C, dans l&#39;obscurité, pendant au moins une nuit, et jusqu&#39;à une semaine. </li></ol> 3. déshydratation <ol> &lt;li&gt; déshydrater semis. Transférez entre les puits de nouvelles plaques de 6 puits, contenant des concentrations croissantes d&#39;éthanol, comme indiqué ici: 10% d&#39;éthanol pendant 15 min; 30% d&#39;éthanol pendant 15 min; éthanol à 50% pendant 15 min; éthanol à 70% pendant 15 min; éthanol à 85% pendant 15 min; éthanol à 95% pendant 15 min; 95% d&#39;éthanol à 4 ° C pendant une nuit, au minimum. Traiter les semis en les saisissant avec soin par leurs cotylédons préférables avec des pinces en plastique. </li></ol> 4. infiltration <ol><li> Préparer le milieu d&#39;infiltration. Mélanger le contenu de 1 sachet de la historesin kit activateur avec 50 ml Kit de base de résine liquide dans une petite bouteille en verre. Remuer avec aimant pour 20 min. support d&#39;infiltration peut être conservé à 4 ° C pendant quelques semaines. </li><li> Mark chaque puits d&#39;une nouvelle plaque de 6 puits avec le nom de l&#39;échantillon correspondant et remplir avec 2 - 3 ml de milieu d&#39;infiltration. </li><li> Transférer les plantules dans la solution d&#39;éthanol à 95% dans le milieu d&#39;infiltration en utilisant une pince. Assurez-vous que les plants sont fully couverte par le milieu. </li><li> Conserver à 4 ° C pendant au moins 4 jours, afin d&#39;assurer une pénétration maximale dans les tissus végétaux. </li></ol> 5. Bloc Préparation <ol><li> Placez de petites étiquettes, crayon marqués avec le nom de l&#39;échantillon, à l&#39;intérieur de chaque puits d&#39;incorporer des moules. </li><li> Préparer l&#39;intégration moyenne en ajoutant 1 ml de durcisseur à 15 ml de milieu d&#39;infiltration (voir 4.1). Ne pas essayer de préparer un volume inférieur à 15 ml, pour éviter les problèmes de polymérisation. </li><li> Remplissez la moitié de chaque puits dans le moule avec 200 ul milieu d&#39;enrobage et couvrir avec un morceau de film en tête coupé à la forme du moule, mais à une taille de 1 mm de plus de chaque côté. Incuber à température ambiante pendant au moins 2 heures, pour permettre la polymérisation. Ne pas dépasser 5 heures. </li><li> Préparer un lot supplémentaire de milieu d&#39;inclusion (voir 5.2) et garder sur la glace, pour éviter la polymérisation en pointes des racines sont disposées dans le moule. </li><li> Couper chaque extrémité de la racine sous un champ de dissection en utilisant scalpel et positionner très soigneusement it: verticalement pour des sections transversales ou horizontalement, de la section longitudinale, à environ 2 - 3 mm de la périphérie du moule. Remplissez le moule complètement avec une solution de blocage et le couvercle avec un film en tête. A noter que la solution de blocage se rétracte légèrement lorsqu&#39;elle est polymérisée. </li><li> Conserver à température ambiante pendant 2 heures, au minimum. </li><li> Pour sécher les blocs, placer dans une boîte de gel de silice sec et laisser à température ambiante pendant la nuit, au minimum. </li></ol> 6. sectionnement <ol><li> Préparer des couteaux de verre de tiges de verre avec un fabricant de couteau. Utilisez les couteaux de verre pour la coupe de tissu. Couper la baguette de verre dans un carré et puis couper le carré en diagonale pour produire deux couteaux, en utilisant un outil diamant de notation. </li><li> Section blocs dans 2 - 3 um tranches de largeur, en utilisant une machine de découpe. Placer les tranches sur une lame de verre, sur le dessus de gouttelettes d&#39;eau distillée et placer la lame sur un bloc chauffant à basse température (50 - 60 ° C), jusqu&#39;à évaporation de l&#39;eau. </li></ol><ol><li> Diluer solution Richardson (voir 2.1) à 0,2% de la solution originale et utiliser 1 ml de celui-ci pour couvrir les tranches. Placer sur le bloc thermique pendant 5 secondes, puis laver avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Sécher la lame sur une plaque chauffante. Observer sous un microscope de dissection et marquer le dos de la lame avec un marqueur, pour indiquer la position des tranches d&#39;intérêt, afin de faciliter leur identification ultérieure au microscope. </li><li> Ajouter 100 ul de milieu de montage et couvercle avec une lamelle. </li></ol> 8. Image Acquisition <ol><li> Placez la lame recouverte contenant les sections de racines sous un microscope optique équipé d&#39; un système Polscope approprié pour obtenir des informations de retardement et un filtre polariseur / interférence optique (Figure 1 AD). </li><li> Sélectionnez un grossissement qui permet une visualisation claire de l&#39;ensemble de l&#39; échantillon (par exemple, 40X dans cette étude) et concentrer le Microscopee sur un champ vide qui contient la section de bloc, mais pas de section de la racine. Essayez de trouver une région propre, sans taches. Utilisez cette région pour définir l&#39;arrière-plan. </li><li> Réglez le système d&#39;imagerie et les paramètres du logiciel: Définir plage à 17 nm. Appliquer &quot;Exposition automatique&quot; et de l&#39;image de fond obtenir du champ vide (voir 8.2). Une image de fond est utilisé par expérience. </li></ol> 9. Polscope Analyse de Cellulose microfibrilles Orientation <ol><li> L&#39;analyse des coupes longitudinales. <ol><li> Placer une diapositive contenant des sections longitudinales sous le microscope et obtenir une image de retardement de celui-ci. Focaliser le microscope sur une section de racine d&#39;intérêt. Fournir un nouveau nom de fichier. </li><li> Capturer une image a ouvert (image avec des informations de retard) par la fenêtre &quot;Live a ouvert&quot;. Être sûr de capturer un article qui comprend la paroi cellulaire, ce qui peut être identifié par la cellulose colorée courant le long de la périphérie de la cellule, comme le montre la figure 2C.</li></ol></li><li> L&#39;analyse d&#39;image. <ol><li> Double-cliquez sur l&#39;image pertinente dans la pile d&#39;images. Sélectionnez &quot;Couleur Orientation pseudo&quot; dans l&#39;onglet &quot;Paramètres d&#39;affichage&quot;. </li><li> Pour estimer l&#39;angle cellulose microfibrilles, correspondre à l&#39;ombre correspondante de la paroi cellulaire pour que, dans la roue des couleurs. NOTE: La roue de couleur à la figure 2C reflète l&#39;axe lent de la lumière se trouvant le long de la microfibrilles qui indique la direction le long de l&#39;axe long des microfibrilles. L&#39;angle de microfibrilles de cellulose est l&#39;angle indiqué par la couleur et l&#39;axe long de la cellule. Par exemple, la cellule d&#39;allongement dans l&#39;encart montre la couleur cyan, incliné d&#39;environ 90 ° par rapport à l&#39;axe long des cellules. </li><li> Pour quantifier l&#39;angle des microfibrilles moyenne dans la paroi cellulaire, utiliser l&#39;outil &quot;Retardateur et Azimuth Stamp&quot; de la barre d&#39;outils du logiciel. Tout en sélectionnant l&#39;outil, pointez et cliquez sur la région d&#39;intérêt dans l&#39;image obtenue. NOTE: Ce will résultat dans l&#39;affichage des angles (azimut) en degrés (figure 2C). </li><li> Dans un accès ouvert polarisé logiciel d&#39;analyse d&#39;images de lumière alternative, le déjeuner plugin &quot;Pol-Analyzer&quot; dans le menu du plugin. Dans la nouvelle fenêtre ouverte, sélectionnez l&#39;onglet et ouvert &quot;biréfringence&quot; et puis enregistrez le fichier d&#39;arrière-plan et le fichier d&#39;image. </li><li> Dans la fenêtre d&#39;image, sélectionnez &quot;Caractéristiques&quot;. et ajuster la «taille de pixel de retour sur investissement &#39;(utilisation de 5 pixels pour cette étude). Dans le &quot;Specs.&quot; fenêtre, sélectionnez &quot;Afficher les valeurs dans le tableau de résultats&quot;. </li><li> Utilisez l&#39;outil Polygon pour marquer la zone d&#39;intérêt dans la fenêtre d&#39;image. Sélectionnez &quot;Lignes d&#39;orientation&quot; pour obtenir l&#39;orientation de la microfibrilles de cellulose. NOTE: Cela se traduira par l&#39;affichage des angles (azimut) en degrés. Remarque: L&#39;angle calculé par une moyenne des deux méthodes doivent ensuite être étalonnée par rapport à la position de la section de base le long de la glissière. Pour corriger l&#39;écart dele positionnement horizontal de la partie entière de la racine le long de la glissière, quantifie l&#39;angle de microfibrilles moyenne de la paroi de la cellule adjacente à la cellule le long de son axe (qui est perpendiculaire à la section et le long de l&#39;axe de croissance de la racine, la figure 2C). Cet angle est de 180 °, quand la partie de pied est positionné avec précision le long de la glissière. Pour le calcul de l&#39;angle de microfibrilles, soustraire l&#39;angle de microfibrilles moyenne mesurée de la paroi cellulaire flanquant de 180 °. Ajouter la différence abouti à l&#39;angle de la paroi cellulaire de microfibrilles moyenne mesurée qui repose à plat sur la diapositive. </li></ol></li></ol> 10. Polscope Analyse de Crystalline Cellulose Accumulation <ol><li> Utilisez les sections transversales (croisées). Notez que l&#39;accumulation de la cellulose cristalline ne peut être comparée entre les cellules lorsque leurs microfibrilles de cellulose sont alignées à un angle similaire (tel que déterminé à 9). </li><li> Double-cliquez sur l&#39;image pertinente dans la pile d&#39;images. Sélectionnez &quot;Pseudo couleur &quot;dans l&#39;onglet&quot; Paramètres d&#39;affichage &quot;. </li><li> Pour mesurer retardance. Zoom-in sur l&#39;image. Sélectionnez &quot;Région&quot; et marquer toutes les régions d&#39;intérêt. Déplacer vers l&#39;onglet &quot;mesures&quot; et &quot;Copy to Clipboard&quot; toutes les valeurs. <ol><li> Transférer les données vers Excel et d&#39;extraire les informations requises (région de retardance moyenne). Normaliser les données. NOTE: Pour tenir compte des différences d&#39;épaisseur entre les tranches, d&#39;exprimer les valeurs relatives à un bord de la paroi cellulaire spécifique dans la diapositive. Pour normaliser, diviser la retardance moyenne correspondant à la paroi cellulaire d&#39;intérêt par la retardance moyenne d&#39;une paroi cellulaire différente dans la même image. Par exemple, la paroi cellulaire de l&#39;épiderme externe a été étalonnée par rapport à la paroi de la cellule corticale interne dans notre étude. </li></ol></li><li> Répétez les mesures pendant au moins 3 sections par racine, avec un minimum de 3 racines par échantillon. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Ici, nous présentons une méthode de détermination de l&#39;accumulation de cellulose cristalline dans les différents tissus composant les racines d&#39; Arabidopsis, tout en conservant les informations anatomiques. En tant que tel, il fournit une étape supplémentaire vers la compréhension des processus de croissance des plantes à une résolution cellulaire. Cette méthode peut également être appliquée pour l&#39;étude des espèces et des organes végétaux supplémentaires. Un certain nom...

La paroi de la cellule végétale est une structure dynamique. les cellules en croissance sont entourées d&#39;une paroi cellulaire primaire, dont l&#39;organisation permet aux cellules de se développer. Les cellules qui cessent de croître dépôt d&#39;une paroi secondaire plus rigide qui améliore le support mécanique de la plante. Les deux parois cellulaires sont composées de microfibrilles de cellulose noyées dans une matrice de polysaccharides de structures différentes (par exemple, l&#39; hémicellulose et la pectine) qui varient selon les différents stades de développement et des tissus 1,2. La cellulose est synthétisée sous la forme de chaînes (1,4) -β-D-glucane qui sont étroitement alignées pour former la microfibrilles d&#39;une structure cristalline. cellulose Amorphous fait référence aux régions où les chaînes glucane sont moins ordonnés. Le rapport entre les domaines cristallins et amorphes , est un paramètre pensé à affecter les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire, en offrant une résistance mécanique et les caractéristiques viscoélastiques, respectivement 3. Plusieurs méthodes ont étédéveloppé pour détecter et quantifier les deux formes d&#39;arrangement de cellulose, dont la diffraction des rayons X et de polarisation croisée / l&#39; angle magique RMN du solide 4. Diffraction des rayons X peut être utilisée pour déterminer la proportion des domaines cristallins par rapport à la cellulose amorphe dans l&#39;échantillon 5. Une méthode alternative utilise le fractionnement du contenu de la paroi cellulaire en matière insoluble en milieu acide et soluble dans l&#39;acide, de faire la distinction entre le cristallin et la cellulose amorphe ou d&#39;autres polymères, respectivement. Dans cette approche, l&#39; incorporation de glucose marqué ([14 C] glucose) est utilisé pour quantifier le 6,7 de cellulose. Ces procédés nécessitent de grandes quantités de matériel végétal pour l&#39;analyse d&#39;organes entiers, au mieux, et, par conséquent, ne sont pas suffisamment sensibles à une variation spécifique au tissu dans la structure de la paroi cellulaire. Visualisation des microfibrilles de cellulose à une résolution cellulaire peut être obtenue dans les études d&#39;imagerie en temps réel associées à des colorants fluorescents 8,9, qui peuvent identifier les changements dansl&#39;orientation des microfibrilles de cellulose. Cependant, ces colorants ne sont pas utilisés pour la quantification, ils ne sont pas spécifiques à la cellulose cristalline et peuvent interférer avec la structure normale de la paroi cellulaire 8. Polscope est une technique d&#39;imagerie qui repose sur la capacité de cellulose cristalline pour diviser les faisceaux lumineux et à retarder une partie de la lumière 10. un retard de lumière est la plus forte pour les microfibrilles qui se situent perpendiculairement à la direction de propagation de la lumière. Pour microfibrilles avec une orientation similaire, plus le degré de cristallinité, plus la lumière retardance 11. Par conséquent, polscope est utilisé pour étudier à la fois les niveaux et l&#39;orientation des microfibrilles de cellulose relative. Roots présentent une croissance linéaire, au cours de laquelle les cellules provenant à la niche de cellules souches, à la pointe de la racine, subir une série de divisions cellulaires, avant de se développer rapidement 12. Les cellules comprenant la racine se développer dans un unidirectionnel (anisotrope)Ainsi, comme dicté par les petites molécules de signalisation des hormones qui ont une incidence sur les propriétés de la paroi de la cellule 13. Réponses différentielles aux hormones, dans le temps et l&#39; espace, constituent un moyen d&#39;assurer une croissance équilibrée de l&#39; organe 14. Par conséquent, l&#39;analyse à haute résolution de la structure de la paroi cellulaire peut fournir des informations importantes nécessaires pour mieux comprendre le lien entre les réponses spécifiques de type cellulaire à la croissance organe entier. Nous rapportons ici la mise en œuvre de polscope pour étudier l&#39; accumulation spécifique de tissu de cellulose cristalline dans les racines d&#39; Arabidopsis, comme observé dans les sections anatomiques de haute qualité. Cette méthode a récemment découvert la cellule accumulation de cellulose cristalline spécifique de type en réponse à une perturbation spatiale de l&#39; activité hormonale 15.

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>LOBA CHEMIE&nbsp ;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Filtre PVDF</td> 0,22 mm entraîné par seringue Azure <td>Sigma</td> 861065 <td></td></tr><tr><td></td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate de sodium</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Leica kit historesin&nbsp ;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>moules d’enrobage</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>film 100 &micro ; P.P.C.&nbsp ;</td><td></td><td></td> www.Jolybar.com <td>film suspendu</td></tr><tr><td>Knivemaker</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&nbsp ;</td><td>Microscope à</td><td>lumière moyenne à montage</td><td>9990402</td> thermique</tr> Système d’imagerie <tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio Système d’imagerie</td><td>IRC</td><td>Système d’imagerie</td><td></td>Abrio</tr><tr><td>Logiciel Abrio V2.2 Logiciel</td><td>IRC</td><td>Abrio V2.2 Logiciel</td><td></td></tr><tr><td>d’analyse d’images en lumière polarisée en libre accès</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td></tr></tbody></table>

résolution quantification haut de crystalline cellulose accumulation dans<em&gt; arabidopsis</em&gt; roots pour surveiller cellulaire spécifique d&#39;un tissu mural modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Les cellules végétales sont entourées d’une paroi cellulaire dont la composition détermine leur taille et leur forme finales. La paroi cellulaire est composée d’une matrice complexe contenant des polysaccharides qui comprennent des microfibrilles de cellulose qui forment à la fois des structures cristallines et des chaînes cellulosiques d’organisation amorphe. L’orientation des fibres de cellulose et leurs concentrations dictent les propriétés mécaniques de la cellule. Plusieurs méthodes sont utilisées pour déterminer les niveaux de cellulose cristalline, chacune apportant à la fois des avantages et des limites. Certains peuvent distinguer la proportion de régions cristallines dans la cellulose totale. Cependant, elles sont limitées aux analyses d’organes entiers qui manquent d’informations spatio-temporelles. D’autres, qui s’appuient sur l’imagerie en direct, sont limitées par l’utilisation de colorants imprécis. Ici, nous rapportons un système sensible basé sur la lumière polarisée pour la quantification spécifique de l’arriération relative de la lumière, représentant l’accumulation de cellulose cristalline dans les coupes transversales des racines d’Arabidopsis thaliana. Dans cette méthode, la résolution cellulaire et les données anatomiques sont maintenues, ce qui permet des comparaisons directes entre les différents tissus composant la racine en croissance. Cette approche ouvre une nouvelle dimension analytique, mettant en lumière le lien entre la composition de la paroi cellulaire, le comportement cellulaire et la croissance de l’organe entier.

Nous étudions l&#39;impact des réponses spécifiques de type cellulaire pour brassinostéroïdes (BRS), en utilisant la racine de Arabidopsis comme un organe de modèle 15-17. Lorsque le récepteur BRI1 BR est ciblée, dans le fond de BRI1 mutante, à un sous - ensemble des cellules de l&#39; épiderme , appelées cellules non capillaires (figure 2A, B), il inhibe l&#39; expansion des cellules unidirectionnel de cellules voisines, et la croissance tou...

<classe p='jove_content'>La cellulose cristalline est un constituant important de la paroi cellulaire végétale. Cependant, sa quantification à une résolution cellulaire est techniquement difficile. Ici, nous rapportons l’utilisation de la technologie de la lumière polarisée et des sections efficaces des racines pour obtenir des informations sur la composition de la paroi cellulaire à une résolution spatio-temporelle.

Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots pour surveiller cellulaire spécifique d&#39;un tissu mural Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

L'objectif général de cette préparation de coupe transversale anatomique est de quantifier l'accumulation relative de cristaux et de cellulose à une résolution cellulaire, permettant des comparaisons directes entre les différents tissus de la racine primaire d'Arabidopsis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie et du développement végétal, telles que la manière dont la composition cellulaire d'un type cellulaire donné influence la croissance d'un organe entier. Après avoir stérilisé les graines d'Arabidopsis selon le protocole indiqué, répartir les graines stériles sur des boîtes contenant 0,8 % d'agar végétal et du milieu 0,5XM.Avec du film parafilm, enveloppez les boîtes et recouvrez-les de papier d'aluminium. Conservez les boîtes à 4 degrés Celsius pendant un à quatre jours afin de favoriser une germination uniforme. Ensuite, transférez les boîtes dans une chambre de croissance adaptée à la culture de jeunes plants d'Arabidopsis, en orientant les boîtes verticalement pour maintenir la croissance des racines à la surface du milieu gélosé. Préparez la solution de Richardson selon le protocole indiqué dans le texte. Filtrez-la à l’aide d’un filtre PVD de 0,22 micron actionné par une seringue avant utilisation.Ensuite, sous une hotte chimique, préparez 50 millilitres de fixateur en combinant 38 ml de cacodylate de sodium 0,5 M avec 2,5 ml de glutaraldéhyde. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution de Richardson à la solution de fixation pour obtenir la solution de fixation finale. Utilisez une plaque pré-graduée, puis ajoutez 2 à 3 ml de la solution de fixation finale dans les puits afin que la solution recouvre entièrement les semis.À l’aide de pinces en plastique, transférez délicatement jusqu’à 10 plantules dans chaque puits. Scellez les plaques avec du parafilm avant de les conserver à l’obscurité à 4 degrés Celsius pendant au moins une nuit et jusqu’à une semaine. Pour déshydrater les plantules fixées, utilisez des pinces pour saisir les plantes par leur base et transférez-les dans les puits de nouvelles plaques à six puits marquées, contenant des concentrations croissantes d’éthanol, pendant les durées indiquées ici.Préparez le milieu d'infiltration dans un petit flacon en verre en mélangeant le contenu d'un sachet d'activateur Historesin avec 50 ml de liquide de résine de base. Insérez un barreau aimanté et agitez la solution sur un agitateur magnétique pendant 20 minutes. Remplissez les puits étiquetés d'une plaque à six puits avec 2 à 3 ml de milieu d'infiltration.Ensuite, lorsque les semis sont complètement déshydratés, utilisez une pince pour les transférer de la solution d'éthanol à 95 % vers le milieu d'infiltration, en veillant à ce qu'ils soient entièrement recouverts par le milieu. Conservez les échantillons à 4 degrés Celsius pendant au moins quatre jours afin de garantir une pénétration maximale dans les tissus végétaux. Pour préparer les blocs, placez de petites étiquettes marquées au crayon avec le nom de l'échantillon à l'intérieur de chaque puits des moules d'encapsulation.Préparez le milieu d'inclusion en ajoutant 1 ml de durcisseur à 15 ml de milieu d'infiltration. À l’aide d’environ 200 microlitres de milieu d’inclusion, remplissez la moitié de chaque puits du moule. Utilisez ensuite un film recouvrant placé au-dessus pour couvrir le moule, avec un excès de 1 ml de chaque côté.Incuber les moules à température ambiante pendant au moins deux heures pour permettre une polymérisation partielle. Ensuite, préparer un lot supplémentaire de milieu d'inclusion et le maintenir sur glace pour éviter la polymérisation pendant que les extrémités des racines sont disposées dans le moule. Ajouter le milieu d'inclusion dans une petite plaque et placer une plantule dans le milieu.Sous un microscope stéréoscopique, utilisez un scalpel pour couper chaque apex racinaire, puis placez-le très soigneusement dans le moule à environ 2 à 3 mm du bord du moule, soit verticalement pour des sections de transfert, soit horizontalement pour des sections longitudinales. Après avoir disposé le tissu, remplissez complètement le moule avec du milieu d'inclusion et recouvrez d'un film transparent. Incubez ensuite à température ambiante pendant au moins deux heures. Pour sécher les blocs, placez-les dans un dessiccateur contenant du gel de silice anhydre et laissez-les à température ambiante toute la nuit.À l’aide d’un fabricant de lames équipé d’un outil de gravure en diamant, préparez des lames en verre à partir de tiges de verre en découpant la tige de verre en un carré, puis en coupant le carré en diagonale pour produire deux lames. Vérifiez que les deux lames possèdent des bords tranchants. Montez un bloc dans un porte-objet.Ensuite, à l’aide d’une lame industrielle à tranchant unique, retirez l’excès de matériau du bloc jusqu’à un millimètre de l’extrémité racinaire afin d’obtenir une forme pyramidale. Sectionnez le bloc façonné en tranches de 2 à 3 micromètres d’épaisseur et transférez les tranches sur une lame en verre marquée. Ajoutez ensuite des gouttelettes d’eau sur les tranches.Il est important de préparer des sections uniformes en largeur afin de minimiser la variabilité des données analysées. Placer les lames en verre sur les blocs chauffants réglés à faible température jusqu'à évaporation de l'eau. Pour préparer les lames à l'observation au microscope polarisant, diluer la solution de Richardson à 2 % de la solution initiale et utiliser environ 1 ml pour recouvrir les tranches.Placez ensuite les échantillons sur le bloc chauffant pendant 5 secondes et rincez-les avec de l'eau distillée. Après avoir séché les lames sur la plaque chauffante, observez les sections au microscope stéréoscopique et utilisez un marqueur pour indiquer au dos de la lame la position des sections d'intérêt. Ajoutez 100 microlitres de milieu de montage avant de couvrir avec la lamelle.Imagez et analysez selon le protocole indiqué dans le texte. On observe ici une coupe transversale de la racine primaire d'Arabidopsis, présentant une organisation radiale de ses cellules et tissus constitutifs, notamment des cellules non pileuses, des cellules pileuses et du cortex. Cette image de microscopie confocale montre l'expression de BRI1-GFP dans les cellules non pileuses, dans un fond muté de BRI1 qui inhibe l'expansion unidirectionnelle des cellules voisines ainsi que la croissance globale de la racine.Comme on le voit ici, les sections longitudinales des racines obtenues à partir du type sauvage et à partir de lignées exprimant BRI1 dans les cellules non pileuses présentaient une orientation similaire des microfibrilles de cellulose, avec une grande variabilité des angles présents dans les cellules méristématiques par rapport aux cellules de la zone de transition. Cela permet de comparer l'accumulation relative de cristaux dans la cellulose dans les cellules méristématiques et allongées correspondantes des deux fonds génétiques, comme illustré ici en coupes transversales, et révèle une corrélation entre l'expression de BRI1 dans les cellules non pileuses et une forte accumulation locale de cristaux dans la cellulose. En général, dans les vidéos, les personnes novices avec cette méthode éprouveront des difficultés car il est délicat d'obtenir des racines bien orientées durant la procédure d'encapsulation.Par conséquent, plusieurs blocs doivent être préparés pour la coupe. Une fois maîtrisée, la coupe d'un seul bloc peut être réalisée en 2 à 3 heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que l'accumulation de cristaux dans la cellulose est comparable entre les cellules si elles possèdent une orientation similaire de leurs microfibrilles de cellulose, comme le montrent les coupes longitudinales.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de fixer des plantules d'Arabidopsis et de les inclure dans des blocs, ainsi que de préparer des coupes transversales et longitudinales des racines. Vous devriez également avoir une bonne idée des données pouvant être obtenues par microscopie en lumière polarisée.

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Découvrez la quantification de la cellulose cristalline à résolution cellulaire dans les racines d'Arabidopsis par microscopie à lumière polarisée. Cette méthode permet d'analyser la composition pariétale et de comparer les tissus.

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