La caractérisation in situ des protéines hydratés dans l'eau par Salvi TOF-SIMS

L’objectif général de cette procédure est de caractériser les films de protéines adsorbées dans des solutions aqueuses, à l’aide du système d’analyse à l’interface liquide-vide, et de la spectrométrie de masse d’ions secondaires à temps de vol. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les biomolécules et la biointerface. Par exemple, la caractérisation de protéines adsorbées sur une surface solide.

Le principal avantage de cette technique est que les biomolécules peuvent être démarrées in situ dans l’environnement liquide, et en combinaison avec la cartographie moléculaire. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les biomolécules à l’interface solide-liquide, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, notamment l’étude de cellules cancéreuses uniques, les interactions médicamenteuses et la fixation de biofilms. Dans une seringue de cinq millilitres, prélevez deux millilitres d’une solution d’éthanol à 70 %.

Connectez la seringue à l’extrémité d’entrée de l’appareil SALVI et injectez lentement un millilitre de liquide pendant 10 minutes. À la fin de l’injection, retirez la seringue et connectez l’entrée et la sortie du SALVI à l’aide d’une union polyéther-éther-cétone. Conservez le microcanal SALVI rempli de la solution d’éthanol à 70 % à température ambiante pendant quatre heures.

Ensuite, remplissez une deuxième seringue avec de l’eau déminéralisée stérile. Connectez-le à l’entrée du SALVI et injectez lentement l’eau déminéralisée dans l’appareil pendant 10 minutes. Retirez la seringue et rebranchez l’entrée et la sortie de l’appareil ensemble.

Afin d’immobiliser un film protéique, commencez par aspirer deux millilitres de solution de fibronectine dans une seringue. Connectez la seringue à l’entrée de l’appareil SALVI et injectez lentement un millilitre de liquide pendant 10 minutes. Ensuite, retirez la seringue et rebranchez à nouveau l’entrée et la sortie.

Incuber l’installation dans un plat de culture propre à température ambiante pendant 12 heures. Après l’incubation, injectez lentement un millilitre d’eau déminéralisée stérile pendant 10 minutes, puis reconnectez l’entrée à la sortie. Pour commencer, posez la platine ToF-SIMS sur une surface plane et propre.

Placez l’appareil SALVI sur la scène avec la plaquette de silicium et la membrane de nitrure de silicium vers le haut. Fixez l’appareil SALVI à la platine à l’aide de quatre pièces de serrage métalliques et vissez les pièces métalliques qui maintiennent le coin de l’appareil dans la plaque métallique à l’aide de quatre vis. Ensuite, enroulez doucement le tube PFTE connecté au canal microfluidique.

Utilisez quatre pièces métalliques et quatre vis pour maintenir la partie rigide vers le bas. Assurez-vous que l’appareil est positionné dans l’espace ouvert de la platine, afin qu’il n’interfère pas avec le faisceau d’ions primaires pendant l’analyse. Ensuite, montez la tasse Faraday sur la scène à l’aide d’une vis.

Ensuite, ouvrez la porte de verrouillage ToF-SIMS et placez la scène horizontalement sur la plate-forme de chargement avant de fermer la porte. Allumez la pompe à vide et laissez la chambre de verrouillage descendre à environ 10 puissance moins six millibars. Ensuite, déplacez l’appareil SALVI dans la chambre principale après environ 30 minutes, une fois le vide stabilisé.

Ajustez le faisceau d’ions primaires, et l’analyseur du ToF-SIMS, pour acquérir une résolution spatiale d’environ 400 nanomètres en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Ensuite, trouvez le canal microfluidique à l’aide du microscope optique. Utilisez le centre de l’image optique comme référence et alignez-le de manière à ce qu’il soit cohérent avec le centre de l’image des ions secondaires.

La démonstration visuelle de cette étape est essentielle, car elle est difficile à apprendre, car l’échantillon est plus épais que les échantillons solides normaux, et il est difficile d’ajuster les paramètres pour trouver la meilleure mise au point du canal. Avant chaque mesure, utilisez un faisceau d’oxygène d’un kiloélectronvolt pour balayer la fenêtre en nitrure de silicium pendant environ 15 secondes afin d’éliminer la contamination de surface. Utilisez également un pistolet à inondation d’électrons pour compenser la charge de surface pendant toutes les mesures.

Ensuite, sélectionnez le mode positif ou négatif avant de commencer l’acquisition des données. Utilisez le bismuth trois plus de 25 kiloélectronvolts comme faisceau d’ions primaire dans toutes les mesures. Pour le profilage en profondeur, balayez le faisceau d’ions primaires sur une zone ronde d’un diamètre d’environ deux micromètres avec une résolution de 32 pixels par 32 pixels.

Pour minimiser le temps nécessaire pour percer la membrane en nitrure de silicium, utilisez un faisceau d’ions primaires à large largeur d’impulsion. Après le perçage de la membrane de nitrure de silicium, maintenez le même courant pendant environ 200 secondes pour obtenir suffisamment de données pour les reconstructions d’images bidimensionnelles. Pour la collecte de données, réduisez la largeur d’impulsion à 80 nanosecondes afin d’acquérir des spectres avec une meilleure résolution de masse.

Continuez cette acquisition pendant environ 200 secondes supplémentaires. En utilisant l’interface microfluidique SALVI, le faisceau d’ions primaires peut bombarder directement le film de fibronectine hydraté. Un certain nombre de grappes d’eau et de fragments d’acides aminés sont indiqués par les données de spécification de masse ToF-SIMS.

Cela fournit une preuve directe de la propriété des molécules d’eau entourant et à l’intérieur des molécules de protéines hydratées. Ici, on peut voir la série chronologique du profil de profondeur du film de fibronectine hydratée et de l’eau déminéralisée. Les intensités des seconds ions sélectionnés sont négligeables avant que la membrane de nitrure de silicium ne soit percée.

Une fois que la membrane en nitrure de silicium est percée, l’intensité des ions secondaires augmente considérablement. Le procédé à largeur d’impulsion courte est utilisé pour obtenir des données avec une meilleure résolution de masse pour les reconstructions d’images et de spectres. Les images 2D du film de fibronectine hydratée et de l’eau déminéralisée représentent le nombre d’ions secondaires sélectionnés dans l’échantillon.

Plus l’image est lumineuse, plus le nombre d’ions secondaires est élevé. Ces images intuitives permettent une comparaison claire des ions secondaires sélectionnés entre différents échantillons, ce qui est utile pour l’analyse des données. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler qu’un microréacteur doit être étanche avant d’être installé dans la chambre à vide.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie et des biointerfaces pour explorer l’adsorption des protéines, la fixation du biofilm, les monocouches assemblées en surface et de nombreux autres phénomènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier divers échantillons de liquide à l’aide de SALVI et du ToF-SIMS liquide.