Name: In Situ Caratterizzazione di idrate proteine in acqua da Salvi e TOF-SIMS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Scopri la caratterizzazione in situ di film proteici adsorbiti in soluzione acquosa mediante spettrometria di massa TOF-SIMS. Questo metodo consente l'analisi delle biomolecole all'interfaccia solido-liquido per studi biochimici avanzati.

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Siamo grati al fondo LDRD del Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) e Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD. L'accesso strumentale è stato fornito attraverso una proposta a tema scientifico del W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL è una struttura scientifica nazionale sponsorizzata dall'Office of Biological and Environmental Research (BER) del PNNL. Gli autori ringraziano il signor Xiao Sui, il signor Yuanzhao Ding e la signora Juan Yao per aver corretto le bozze del manoscritto e per aver fornito un utile feedback. PNNL è gestito da Battelle per il DOE con il contratto DE-AC05-76RL01830.

1. Pulizia e sterilizzazione della Microchannel SALVI <ol><li> Sterilizzazione della Microchannel in SALVI <ol><li> Disegnare 2 ml di soluzione acquosa al 70% di etanolo in una siringa, collegare la siringa con l&#39;estremità di entrata della SALVI, e iniettare lentamente 1 ml del liquido in 10 min. Rimuovere la siringa al termine dell&#39;iniezione. Quindi, collegare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di SALVI utilizzando un polietereterchetone (PEEK) unione. In alternativa, utilizzare una pompa a siringa per condurre la stessa procedura. Ad esempio, impostare la velocità di flusso a 100 microlitri / min. </li><li> Mantenere la microcanali SALVI riempito con soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente per 4 ore. </li></ol></li><li> Introdurre deionizzata (DI) Acqua in SALVI <ol><li> Disegnare 2 ml di acqua deionizzata sterile in una siringa, collegare la siringa con l&#39;ingresso di SALVI, e iniettare lentamente 1 ml del liquido in 10 min. Rimuovere la siringa e collegare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di SALVI utilizzando un&#39;unione PEEK. In alternativa, utilizzare una pompa a siringa, come indicato inpasso 1.1.1. </li></ol></li></ol> 2. immobilizzazione del Film di proteine ​​in SALVI <ol><li> Immobilizzare il Film di proteine ​​in SALVI <ol><li> Disegnare 2 ml di fibronectina (10 ug / ml in tampone fosfato, PBS) soluzione in una siringa, collegare la siringa con l&#39;ingresso di SALVI, lentamente iniettare 1 ml del liquido in 10 min, rimuovere la siringa, e collegare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di SALVI utilizzando una unione PEEK. </li><li> Incubare la SALVI riempito con la soluzione fibronectina in un piatto di coltura pulito, mantiene il piatto nella cappa a temperatura ambiente per 12 ore. </li><li> Disegnare 2 ml di acqua deionizzata sterile in una siringa e collegare la siringa con l&#39;ingresso di Salvi. Iniettare lentamente 1 ml di acqua in 10 minuti, rimuovere la siringa, e collegare l&#39;ingresso e l&#39;uscita di Salvi. Nota: Se dotato di un microscopio ottico, controllare il SALVI sotto il microscopio per assicurare che la membrana peccato è intatto prima analisi ToF-SIMS. Ora il dispositivo è pronto per SALVI TOF-SIMS unANALISI. </li></ol></li></ol> 3. Installare SALVI nella Loadlock Camera TOF-SIMS Nota: I guanti devono essere indossati in ogni momento durante la manipolazione del dispositivo Salvi e installarla sul palco TOF-SIMS per evitare potenziali contaminazioni durante l&#39;analisi di superficie. <ol><li> Montare SALVI allo stage <ol><li> Posare la fase TOF-SIMS su una superficie piana e pulita. Mettere il dispositivo SALVI sul palco con il wafer di silicio e la membrana SiN rivolto verso l&#39;alto. Fissare il SALVI con quattro pezzi di fissaggio in metallo e avvitare i pezzi di metallo che tengono l&#39;angolo del dispositivo nella piastra metallica con quattro viti. </li><li> Delicatamente arrotolare il tubo PTFE collegato al canale microfluidica. Utilizzare quattro pezzi di metallo e quattro viti per tenere la parte rigida verso il basso. Assicurarsi che il dispositivo è posizionato nello spazio aperto sulla scena SIMS modo che non interferisca con il fascio di ioni primario durante l&#39;analisi. Ulteriori immagini e illustrazione del fabricat SALVIione e l&#39;installazione sono disponibili in pubblicazioni precedenti. 8,9,11 </li></ol></li><li> Montare la Coppa Faraday allo stage <ol><li> Fissare la coppa di Faraday sul palco da una vite. </li></ol></li><li> Caricare lo stage nelle TOF-SIMS Loadlock Camera <ol><li> Aprire il loadlock ToF-SIMS, tenere e impostare la fase orizzontale sulla piattaforma di carico, e chiudere la porta loadlock. </li></ol></li></ol> 4. ToF-SIMS acquisizione dati <ol><li> Accendere la pompa di aspirazione e garantire vuoto adatto (per esempio, dell&#39;ordine di 10 -6 mbar o Torr) viene raggiunto nella camera loadlock. </li><li> Spostare il SALVI nella camera principale una volta il vuoto è stabilizzata dopo circa 30 min. Nota: Il vuoto deve essere inferiore a 5 x 10 -6 mbar di vuoto nella camera principale durante l&#39;acquisizione dei dati. Altrimenti, alto vuoto è indicativo di una perdita nel sistema SALVI. </li><li> Regolare il fascio di ioni primario e analizzatore di ToF-SIMS con unrisoluzione spaziale di circa 400 nm secondo le raccomandazioni del produttore. La corrente del fascio primario è di 1.200 pA, mentre il tempo di ciclo è di 30 msec sotto la modalità DC. Nota: Questo processo segue in gran parte le raccomandazioni del produttore. </li><li> Trovare il canale microfluidica utilizzando il microscopio ottico. Utilizzare il centro ottico di immagine come riferimento e allinearlo a essere coerente con il centro dell&#39;immagine di ioni secondari. </li><li> Prima di ogni misurazione, utilizzare un 1 KeV O 2 + fascio (~ 40 nA) per eseguire la scansione sulla finestra SiN con una superficie di 500 x 500 micron 2 per ~ 15 secondi per eliminare la contaminazione superficiale. Inoltre, utilizzare un cannone inondazione elettronico per compensare la carica superficie durante tutte le misure. Utilizzare la funzione automatica della pistola inondazioni nella modalità predefinita per questo passo. </li><li> Selezionare la modalità positiva o negativa prima dell&#39;acquisizione dei dati. Utilizzare la keV Bi 3 + trave 25 come il fascio di ioni primario in tutte le misure. Nota: La procedura è simile fo acquisizioni di dati positivi e negativi. Per motivi di spazio, la modalità positiva è descritto in dettaglio qui. <ol><li> profondità Profiling <ol><li> Eseguire la scansione del fascio + Bi 3 su un&#39;area circolare con un diametro di ~ 2 micron con 32 pixel di risoluzione di 32 pixel. </li><li> Per ridurre al minimo il tempo necessario per punch-through la membrana SiN, utilizzare una larghezza di impulso lunga (cioè, 180 nsec, la corrente del fascio ~ 1,0 pA in un tempo di ciclo di 100 msec) Bi 3 + fascio. Le intensità di ioni secondari rappresentante l&#39;aumento superficie del liquido quando viene raggiunto punch-through. Il tempo di punch-through varia da 300 sec a 500 sec, a seconda del lotto di membrana SiN. Nota: Questa differenza sembra essere correlato al lotto di membrane SiN acquisite secondo la nostra esperienza. Tuttavia, il tempo di punch-through non influisce realmente l&#39;analisi dei dati. </li><li> Dopo la membrana SiN punch-through, mantenere la stessa corrente per circa 200 secondi perottenere dati sufficienti per 2D ricostruzioni di immagini. </li><li> Ridurre la larghezza di impulso di 80 nanosecondi per la raccolta dei dati per acquisire gli spettri con una migliore risoluzione di massa. Continuare questa acquisizione per circa altri 200 sec. I dati dello spettro mostrati nella Figura 1 sono ottenuti da questa regione. </li></ol></li><li> 2D Imaging e Mass Spectra <ol><li> Raccogliere il immagini 2D e dati di spettri di massa, allo stesso tempo quando si misurano i dati di profili di profondità. Lo strumento TOF-SIMS salva tutte le informazioni di ogni spot durante l&#39;esperimento. I dati sono mostrati in diverse finestre (Fpanel - Spectra, Fpanel - Profili e Fpanel - separatamente le immagini) del software di controllo digitale. Controllare i dati in ogni pannello giudiziosamente durante l&#39;acquisizione dei dati. </li></ol></li></ol></li></ol> Analisi 5. TOF-SIMS dati Nota: L&#39;analisi dei dati è inizialmente effettuata utilizzando il software strumentale IonToF TOF-SIMS. <ol><li> Aprire l&#39;unasoftware ANALISI DELLA SIMS (Measurement Explorer) e quindi fare clic su &quot;profili &#39;,&#39; pulsanti &#39;immagine spettri&#39; e &#39;, rispettivamente per elaborare profilo di profondità, m / z spettro, e dati di immagine. </li><li> Aprire i file di dati che hanno l&#39;estensione &quot;.ita&quot;. </li><li> Selezionare i picchi di interesse, digitare il nome della specie nella casella &quot;ioni&quot;, e li etichetta con colori diversi in spettri. Utilizzare la rotellina del mouse per trascinare lungo l&#39;asse x. Utilizzare Ctrl e rotella di scorrimento per regolare altezze dei picchi e larghezze. Lettera switch &quot;L&quot; tra le modalità lineari e log lungo l&#39;asse y. </li><li> Condurre ricostruzione dei dati prima della calibrazione di massa. Altrimenti, è difficile scegliere la spaziatura tra i picchi in fase di calibrazione di massa. <ol><li> Selezionare i dati di profondità profiling di interesse e ricostruire gli spettri in base alla profondità serie temporali profilo. </li><li> Fare clic sul pulsante di ricostruzione. Nella finestra &quot;Start ricostruzione&quot;, digitare un intervallo di scansione di interest. Fai clic su &quot;OK&quot; per ricostruire i dati del profilo di profondità. </li></ol></li><li> Eseguire una calibrazione di massa. Premere il tasto &quot;F3&quot; per aprire la finestra &quot;calibrazione di massa&quot;. Scegli i picchi per la calibrazione in base al campione specifico. 21 In questo lavoro, utilizzare i seguenti picchi CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) e H 13 O 6 + (m / z 109) per il modo positivo. Utilizzare il seguente picchi CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), e C 4 H - (m / z 49) per il modo negativo. <ol><li> Selezionare un picco,fare in modo che la freccia verso il basso è puntato verso il picco nell&#39;angolo in basso a sinistra della finestra. Fare clic su tale picco e digitare il nome di picco nella finestra &quot;calibrazione di massa&quot;, fai clic su &quot;Aggiungi&quot;, e lo ione di interesse è compreso nella calibrazione di massa. </li><li> Infine, fare clic sul pulsante &quot;Recalibrate&quot;. Controllare se le aree dei picchi sono al posto giusto in base alla loro massa per caricare rapporti. Nel menu &quot;Spectrum&quot;, selezionare e fare clic su &quot;Applica calibrazione di massa&quot; a &quot;tutti gli spettri&quot; o &quot;spettri Selected&quot;, in base all&#39;analisi specifica condotta. </li></ol></li><li> Come selezione di picco è necessario per l&#39;analisi del campione, determinare picchi caratteristici del campione secondo la letteratura o di altri risultati precedenti. Confrontare l&#39;intensità dei picchi di interesse della m / z spettri. Se necessario, aggiungere nuovi picchi o cancellare i picchi inutili nella lista di picco. <ol><li> Aggiungi picchi. Fare clic su un picco, trovare le linee rosse nella casella in basso a sinistra. Hold il tasto &quot;Ctrl&quot;, scorrere il mouse in senso orizzontale per definire ampiezza del picco, che aggiunge un picco alla lista di picco automaticamente. Un altro modo per aggiungere un picco è quello di selezionare un picco nella finestra principale di spettro, e quindi fare clic sul pulsante &quot;aggiungi picco&quot; sopra la finestra. Se ci sono molti picchi da aggiungere, nel menu &quot;Spectrum&quot;, selezionare &quot;picchi di ricerca&quot;, verificare le specifiche connessi nella finestra appena aperta, quindi aggiungere i picchi in base alle esigenze. </li><li> Per esportare un elenco di picco, nel menu &quot;Peak List&quot;, selezionare &quot;Salva ...&quot;, la lista di picco nel formato &quot;itmil&quot;. Utilizzare i tasti Ctrl e tasto sinistro per trascinare lungo lo spettro. Nella finestra di spettri, selezionare un picco di interesse e trascinare le due linee tratteggiate a posizioni desiderabili. </li><li> Per importare un elenco di picco, nel menu &quot;Messa intervallo List&quot;, scegliere &quot;Importa ...&quot;, individuare un file di elenco di picco esistente con l&#39;estensione &quot;.ITPL&quot;. Fai clic su &quot;Apri&quot;. </li><li> Per utilizzare un &quot;itmil&quot; lista di picco, inil menu &quot;Messa Lista Intervallo&quot;, fare clic su &quot;Apri ...&quot;, trovare il file, quindi fare clic su &quot;Apri&quot;. </li></ol></li><li> Applicare un elenco di picco per analizzare ulteriormente i dati. Al-basso a sinistra della finestra &quot;Spectra&quot;, c&#39;è una finestra chiamata &quot;Mass Elenco Interval&quot;. L&#39;elenco di picco importato viene mostrato qui. <ol><li> Fare clic destro sul file di elenco di picco da utilizzare, applicare alla &quot;spettro attivo&quot; o &quot;tutti gli spettri&quot;. </li></ol></li><li> Visualizzare i profili di dati. Nella finestra &quot;Profilo&quot;, Usa lettera &quot;M&quot; per adattarsi alla finestra (gamma completa) e la lettera &quot;N&quot; per adattarsi al asse y. Utilizzare Ctrl e rotellina di scorrimento per regolare la larghezza del profilo. Oppure utilizzare &quot;/&quot; e &quot;*&quot; sulla tastiera per modificare l&#39;intervallo dell&#39;asse Y e l&#39;altezza. </li><li> Esportare i dati per un ulteriore tracciato utilizzando altri software di grafica dopo la prima analisi. <ol><li> Per esportare un profilo di profondità, nella finestra &quot;profilo&quot;, fare clic sul menu &quot;File&quot;, quindi selezionare &quot;Export &amp; #34 ;, quindi selezionare &quot;Salva con nome&quot; file &quot;.txt&quot;. </li><li> Per esportare un file spettro m / z, nella finestra &quot;Spectra&quot;, fare clic sul menu &quot;File&quot;, quindi selezionare &quot;Export&quot;, quindi selezionare &quot;Salva con nome&quot; file &quot;.txt&quot;. </li><li> Per esportare un file di immagine, nella finestra, stampa schermo &quot;Immagine&quot; e salvare come file immagine. </li></ol></li></ol> 6. ToF-SIMS dati tracciato e presentazione Nota: utilizzare uno strumento grafico per tracciare i dati dopo i dati SIMS vengono elaborati utilizzando il software strumentale. <ol><li> Utilizzare uno strumento grafico per importare i dati. </li><li> Fare una trama con il m / z come l&#39;asse delle ascisse e l&#39;intensità di picco come l&#39;asse y per mostrare lo spettro ricostruito. Un esempio è riportato nella figura 1. </li><li> Fare un grafico usando il tempo di polverizzazione come l&#39;asse delle ascisse e l&#39;intensità di picco come l&#39;asse y per visualizzare il profilo di profondità serie temporali ricostruito. Un esempio è dato in FiguRE 2. </li><li> Combina immagini 2D ricostruite di diversa m / z e formare una matrice per mostrare la mappatura di ioni. Un esempio è riportato nella figura 2. </li></ol>

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<li>Muramoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToF-SIMS+Analysis+of+Adsorbed+Proteins%3A+Principal+Component+Analysis+of+the+Primary+Ion+Species+Effect+on+the+Protein+Fragmentation+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns.</a> J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).</li>
<li>Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+interpretation+of+ToF-SIMS+measurements+on+adsorbed+proteins+using+PCA%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA.</a> Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).</li>
<li>Gustavsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.-Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications.</a> J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).</li>
<li>Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly%28hydroxylethyl+methacrylate%29+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Biomater%22%5BJournal%5D)">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

SALVI è un&#39;interfaccia microfluidico che consente superficie del liquido dinamico e analisi interfaccia liquido-solido da strumenti vuoto based, come ToF-SIMS e microscopia elettronica a scansione (SEM). A causa l&#39;utilizzo di piccole aperture per esporre il liquido direttamente nel vuoto, SALVI è adatto per molte spettroscopia e di imaging tecniche finemente focalizzato, senza alcuna modifica; 22 la portabilità e la versatilità di microfluidica ne fanno una vera e propria piattaforma di imaging multim...

L&#39;idratazione è cruciale per la struttura, 1 conformazione, 2 e 3 attività biologica delle proteine. Le proteine ​​senza molecole d&#39;acqua che li circondano non avrebbero attività biologiche vitali. In particolare, le molecole d&#39;acqua interagiscono con la superficie e la struttura interna delle proteine, e diversi stati di idratazione di proteine ​​rendono tali interazioni distinte. 4 L&#39;interazione delle proteine ​​con le superfici solide è un fenomeno fondamentale, con implicazioni nel campo delle nanotecnologie, biomateriali e processi di ingegneria tissutale. Studi hanno a lungo indicato che i cambiamenti conformazionali possono verificarsi come proteina incontra una superficie. ToF-SIMS è stato concepito come la tecnica che ha il potenziale per studiare all&#39;interfaccia proteina-solido. 5-7 È importante comprendere l&#39;idratazione di proteine ​​su superfici solide, che fornisce potenzialmente una comprensione fondamentale del meccanismo della loro struttura, conformazione e biological&#39;attività al. Tuttavia, le tecniche analitiche superficie maggiore sono per lo più sotto vuoto-based e applicazioni dirette per Studi liquidi volatili sono difficili a causa della rapida evaporazione del liquido volatile in ambiente sottovuoto. Abbiamo sviluppato un vuoto un&#39;interfaccia microfluidica compatibile, sistema per l&#39;analisi presso l&#39;interfaccia Vacuum Liquid (SALVI), per consentire osservazioni dirette di superfici liquide e interazioni liquido-solido che utilizzano tempo di volo di ioni secondari spettrometria di massa (TOF-SIMS). 8- 11 Gli aspetti unici sono i seguenti: 1) la finestra di rilevamento è un&#39;apertura di 2-3 micron di diametro che permette l&#39;imaging diretto della superficie del liquido, 2) tensione superficiale è utilizzato per contenere il liquido all&#39;interno del diaframma, e 3) Salvi è portatile tra più piattaforme analitiche. 11,12 Salvi è composto da una membrana di nitruro di silicio (SiN) come area di rilevamento e un microcanale in polidimetilsilossano (PDMS). E &#39;fabricated nella stanza pulita, ei fattori di fabbricazione e di progettazione chiave sono stati dettagliatamente nei precedenti documenti e brevetti. 8-12 Le applicazioni di ToF-SIMS come strumento analitico sono state dimostrate utilizzando una varietà di soluzioni acquose e le miscele di liquidi complessi, alcuni dei che conteneva le nanoparticelle. 13-17 in particolare, SALVI liquido TOF-SIMS consente dinamica sondare l&#39;interfaccia liquido-solido dei sistemi live biologici (ad esempio, biofilm), celle singole, e l&#39;interfaccia solido-elettrolitico, aprendo nuove opportunità per in situ condensato fase studi, tra cui liquidi con l&#39;ausilio TOF-SIMS. Tuttavia, il design attuale non consente ancora interazioni gas-liquido. Questa è una direzione per lo sviluppo futuro. SALVI è stato utilizzato per studiare il film proteina idrata in questo lavoro per la prima volta. Fibronectina è un dimero proteine ​​comunemente usato, costituito da due monomeri quasi identici collegati da una coppia di ponti disolfuro, 18 che is ben noto per la sua capacità di legare le cellule. 19,20 E &#39;stato scelto come sistema modello per illustrare che il film proteina idratata potrebbe essere sondato in modo dinamico con il liquido SALVI ToF-SIMS approccio. La soluzione proteica è stata introdotta nel microcanali. Dopo incubazione per 12 ore, un film proteina idratata formata sul lato posteriore della membrana SiN. Deionizzata (DI) l&#39;acqua è stata utilizzata per risciacquare il canale dopo l&#39;introduzione di proteine. Le informazioni sono state raccolte da idrati molecole di proteine ​​fibronectina nel microcanali SALVI usando dinamica TOF-SIMS. DI acqua è stato studiato anche come controllo da confrontare con i risultati ottenuti da idratato film sottile fibronectina. sono state osservate differenze distinte tra il film proteina idratata e acqua deionizzata. Questo lavoro dimostra che l&#39;assorbimento di proteine ​​sulla superficie in ambiente liquido può essere studiato con il romanzo Salvi e liquido approccio ToF-SIMS. Il protocollo video è destinato a fornire una guida tecnica per le persone che sono interessatead utilizzare questo nuovo strumento di analisi per le diverse applicazioni di SALVI con ToF-SIMS e ridurre gli errori inutili in gestione dei liquidi, nonché l&#39;acquisizione di dati ToF-SIMS e l&#39;analisi.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF. Risoluzione SIMS 5</td><td>: >10.000 m/&Delta; m per la risoluzione di massa; >4.000 m/&Delta; m per alta risoluzione spaziale&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema per l'analisi presso l'interfaccia del vuoto liquido (SALVI)</td> Pacific <td>Northwest National Laboratory</td><td>N/A</td><td>SALVI è uno strumento analitico unico, autonomo e portatile che, per la prima volta, consente a strumenti scientifici basati sul vuoto come la spettrometria di massa di ioni secondari a tempo di volo (ToF-SIMS) di analizzare le superfici liquide nel loro stato naturale a livello molecolare.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>per il collegamento dell'ingresso e dell'uscita del</td></tr><tr><td>SALVI 5 assi Sample Stage</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>Stage è autocostruito per il montaggio di SALVI in ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure Water Purification System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP Modulo di filtrazione ad osmosi inversa (D2716)</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Intervallo: da 100 a 1.000 ml</td></tr><tr><td>Puntale per pipette</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1.000 &; l</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td>95% denaturato</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

in situ caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da salvi e tof-sims

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Questo lavoro dimostra in situ caratterizzazione di biomolecole di proteine ​​nella soluzione acquosa utilizzando il sistema per l&#39;analisi al Interface Vacuum Liquid (SALVI) e tempo di volo spettrometria di massa di ioni secondari (TOF-SIMS). Il film proteine ​​fibronectina è stato immobilizzato sulla membrana di nitruro di silicio (SiN) che forma l&#39;area di rilevamento SALVI. Durante l&#39;analisi ToF-SIMS, sono stati condotti tre modalità di analisi compreso alta spettrometria di massa spaziale risoluzione, immagini bidimensionali (2D), e profili di profondità. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in entrambe le modalità positivi e negativi. acqua deionizzata è stato anche analizzato come un campione di riferimento. I nostri risultati mostrano che il film fibronectina in acqua ha più distinti e più forti picchi di cluster di acqua rispetto alla sola acqua. picchi caratteristici di frammenti di amminoacidi sono anche osservabili nella proteina idratata ToF-SIMS spettri. Questi risultati dimostrano che molecola proteica adsorbimento su una superficie può essere studiato Dynamically usando Salvi e ToF-SIMS nell&#39;ambiente liquido per la prima volta.

Un paio di risultati rappresentativi sono presentati per dimostrare i vantaggi del protocollo proposto. Utilizzando l&#39;interfaccia microfluidica SALVI, il fascio di ioni primario (Bi 3 +) può bombardare direttamente sul film fibronectina idratato in acqua deionizzata. Così la mappatura chimica molecolare della superficie del liquido può essere acquisito correttamente. Figura 1a <strong...

Questo lavoro presenta un protocollo di gestione dei liquidi e di introduzione del campione ad un microcanali per in situ tempo di volo ioni secondari analisi di spettrometria di massa di biomolecole proteina in una soluzione acquosa.

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare film di proteine adsorbite in soluzioni acquose, utilizzando il Sistema per l'Analisi all'Interfaccia Liquido-Vuoto e la spettrometria di massa ad ioni secondari con analisi del tempo di volo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo le biomolecole e l'interfaccia biologica. Ad esempio, la caratterizzazione di proteine adsorbite su una superficie solida.I principali vantaggi di questa tecnica sono che le biomolecole possono essere analizzate in situ nell'ambiente liquido e in combinazione con la mappatura molecolare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle biomolecole all'interfaccia solido-liquido, può essere applicato anche ad altri sistemi, inclusa l'analisi di singole cellule tumorali, interazioni farmacologiche e l'adesione di biofilm. In una siringa da cinque millilitri, aspirare due millilitri di una soluzione di etanolo al 70%.Collegare la siringa all'estremità di ingresso del dispositivo SALVI ed iniettare lentamente un millilitro del liquido nell'arco di 10 minuti. Al termine dell'iniezione, rimuovere la siringa e collegare l'ingresso e l'uscita del SALVI mediante un

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Chimica

L'obiettivo di questo esperimento è quello di determinare e controllare la dimensione, la forma e la stabilità del amphiphiles discotici auto-assemblati in acqua. Per polimeri a base acquosa supramolecolari tale livello di controllo è molto difficile. Noi applichiamo una strategia con entrambe le interazioni ripugnante e attraente. Le tecniche sperimentali applicate a caratterizzare questo sistema sono ampiamente applicabile.

Controllo della dimensione, forma e stabilità dei polimeri supramolecolari in acqua

Più della metà delle proteine ​​sono piccole proteine ​​(massa molecolare &lt;200 kDa) che stanno sfidando per entrambi microscopio elettronico di immagini e ricostruzioni tridimensionali. Ottimizzato colorazione negativa è un protocollo robusto e high-throughput per ottenere un elevato contrasto e immagini di piccole proteine ​​o complessi asimmetrici in diverse condizioni fisiologiche relativamente alta risoluzione (~ 1 nm).

Ottimizzato colorazione negativa: un protocollo ad alta velocità per l&#39;esame di piccole e asimmetrica Protein Structure da microscopia elettronica

Morbido atterraggio di ioni selezionati massa sulle superfici è un approccio efficace per la preparazione altamente controllata di nuovi materiali. Accoppiato con l'analisi in situ spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS) e spettroscopia di assorbimento di riflessione infrarossa (IRRAS), atterraggio morbido fornisce approfondimenti senza precedenti sulle interazioni delle specie ben definite con superfici.

In Situ SIMS e IR Spettroscopia di superfici ben definite Preparato da atterraggio morbido di ioni Mass-selezionati

I passaggi chiave della funzione delle proteine, in particolare i cambiamenti conformazionali della spina dorsale e le reazioni di trasferimento protonico, spesso avvengono su una scala temporale da microsecondi a millisecondi. Questi processi dinamici possono essere studiati mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier a scansione a gradini risolta nel tempo, in particolare per le proteine la cui funzione è attivata dalla luce.

Proton Transfer e conformazione proteica Dynamics in proteine ​​fotosensibili da Time-risolto Step-scan trasformata di Fourier Infrared Spectroscopy

L'equilibrio di sedimentazione (SE) può essere utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina in un ambiente fisiologico. Questo manoscritto descrive l'uso di questa tecnica per determinare l'effetto del pH sulla stabilità di un omo-pentamero formato dalla piccola proteina idrofobica (SH) codificata dal virus respiratorio sinciziale umano (hRSV).

Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

Qui, presentiamo protocolli dettagliati per la spettrometria di massa a scambio di idrogeno/deuterio ammide allo stato solido (ssHDX-MS) e la spettrometria di massa per marcatura fotolitica allo stato solido (ssPL-MS) per proteine in polveri solide. I metodi forniscono informazioni ad alta risoluzione sulla conformazione delle proteine e sulle interazioni nello stato solido amorfo, che possono essere utili nella progettazione della formulazione.

Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

Questo articolo presenta un metodo per la coltivazione di un biofilm per in situ spettrometria totale di ione secondaria tempo di volo per la mappatura chimica allo stato idratato, attivata da un reattore di microfluidica, sistema per analisi presso l'interfaccia liquida di vuoto. Shewanella oneidensis MR-1 con proteine di fluorescenza verde è stato usato come modello.

In Situ Caratterizzazione di Shewanella oneidensis MR1 biofilm di SALVI e ToF-SIMS

Presentiamo una procedura per l'analisi di composizione elementare di boehmite particelle in acqua deionizzata e immagini in tempo reale di in situ liquido scansione microscopia elettronica.

In Situ Caratterizzazione delle particelle Boehmite in acqua usando liquido SEM

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La struttura e la dinamica di acqua interfaccia con Tunneling di microscopia e spettroscopia di sondaggio

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Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

Scopri la caratterizzazione in situ di film proteici adsorbiti in soluzione acquosa mediante spettrometria di massa TOF-SIMS. Questo metodo consente l'analisi delle biomolecole all'interfaccia solido-liquido per studi biochimici avanzati.

In Situ Caratterizzazione di idrate proteine ​​in acqua da Salvi e TOF-SIMS

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