Name: Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Découvrez des protocoles pour caractériser l'allongement embryonnaire chez Caenorhabditis elegans. Cette méthode permet d'identifier les gènes régulant les phases précoces et tardives du développement.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada et de la Fondation canadienne pour l’innovation. Merci au Dr Paul Mains (Université de Calgary, Calgary, Canada) pour la souche let-502(sb118ts). Certaines des souches ont été fournies par le Caenorhabditis Genetics Center, qui est financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li>
<li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+morphogenesis%3A+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li>
<li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502%2FROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li>
<li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation%3A+LET-502%2FROCK%2C+MRCK-1+and+PAK-1%2C+three+kinases+with+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li>
<li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase%2C+MEL-11+myosin+phosphatase%2C+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li>
<li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684(2014).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22Methods%22">Methods</a>. Wood, W. B. , 587-606 (1988).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform%2C+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li>
<li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li>
<li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077(2014).</li>
<li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li>
<li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin%2FIGF-1+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+cells+%3A+devoted+to+molecular+%26+cellular+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li>
<li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43(2014).</li>
<li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li>
<li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole décrit les nouveaux paramètres pour caractériser début et fin des phases d&#39;allongement embryonnaire. Dans la section 1, l&#39;étape critique est la présence potentielle de bactéries sur le pad. Les embryons sont hermétiquement enfermés entre le patin et la lamelle lors de l&#39;acquisition d&#39;image. La lame d&#39;étanchéité est nécessaire pour éviter la dessication des animaux lors de l&#39;acquisition d&#39;une durée de plus de deux heures. À notre connaissance, aucun de...

Depuis près de 50 ans , les nématodes Caenorhabditis elegans est établi comme un modèle puissant pour étudier des questions importantes dans le développement, la neurobiologie, l&#39; évolution, les interactions hôte-pathogène, etc. 1 La force de ce modèle dans l&#39;étude du développement réside dans: son cycle de vie court de 3 jours; la facilité avec laquelle ces animaux peuvent être génétiquement modifiées; sa transparence qui permet l&#39;observation du déplacement de la cellule et de la morphologie des animaux vivants et de son développement qui est la plupart du temps extra-utérine. Les stades de développement du nématode impliquent l&#39;embryogenèse et quatre stades larvaires (L1 à L4), suivie par l&#39;âge adulte. Au cours du développement embryonnaire, épidermique morphogenèse a attiré une attention considérable pour sa capacité à permettre une meilleure compréhension de la façon dont épithéliales cellules migrent en tant que groupe, comment ils réorganisent leurs jonctions et modifier leur morphologie individuelle, ainsi que leur positionnement relatif dans un épithélium fonctionnel.Epidermal morphogenèse est divisé en quatre étapes: intercalation dorsale consistant en la réorganisation des cellules épidermiques dorsale, appelée l&#39;hypoderme; enceinte ventrale, consistant à la migration des cellules hypodermiques ventrale vers la ligne médiane ventrale enrobant ainsi l&#39;embryon dans une monocouche de cellules épithéliales; début et fin de l&#39;allongement transformer l&#39;embryon en forme de haricot en larves vermiform. Après morphogenèse, embryon éclosent et les larves L1 commencent à se nourrir en utilisant des bactéries disponibles dans leur environnement immédiat. allongement embryonnaire est donc une phase tardive du développement embryonnaire. Il est constitué de l&#39;extension de l&#39;embryon, le long de son axe longitudinal, et une réduction de son diamètre transversal. Cela implique une modification spectaculaire de la forme des cellules hypodermiques. Allongement est divisé en un début et une phase tardive. La première phase commence au stade de la virgule et se termine lorsque les muscles corps à parois commencent à contracter à l&#39; étape 1.75 fois dans wild type ( en poids) des embryons - correspondant à des embryons qui sont 1,75 fois la longueur par rapport à des embryons non-allongée. Morphogenèse se produisant à ce stade sont principalement motivés par la contraction des faisceaux filamenteux d&#39;actine (FB) situés au pôle apical des cellules hypodermiques qui conduisent leur allongement le long de l&#39;axe antéro-postérieur de l&#39;embryon 2. Contraction de FBs est le contrôle par phosphorylation des chaînes de myosine-lumière par trois kinases LET-502 / ROCK, MRCK-1 et PAK-1 5. La phase tardive de l&#39;allongement, commence lorsque les muscles corps à parois deviennent fonctionnels et commencent à contracter. Elle implique la signalisation de transduction mécanique des muscles corps de paroi aux cellules dorsale et ventrale hypodermiques et se termine lorsque les animaux éclosent 3. les défauts de Allongement sont généralement caractérisés par le pourcentage d&#39;animaux qui meurent comme des embryons (létalité embryonnaire; Emb) et ceux d&#39;arrêter leur développement en tant L1 larves (larvaire arrestation phénotype; Lva) et étant sensiblement plus courte que poids. Identification de la scène de l&#39; arrestation de développement nécessite une observation microscopique des embryons morts et arrêté Larves 3-6. Il a été récemment montré que plusieurs gènes, comme le régulateur / Cdc42 Rac et effecteur pix-1 et pak-1, contrôlent la morphogenèse au cours précoce et tardive allongement 3,7. Nous avons récemment montré que morphogenèse diffèrent selon l&#39;axe antéro-postérieur de l&#39;embryon lors de l&#39; allongement précoce 3 7. Ces résultats ont motivé l&#39;élaboration de nouvelles mesures ciblant spécifiquement les étapes d&#39;allongement précoce ou tardive et d&#39;autres mesures permettant la caractérisation de la morphologie des embryons le long de leur axe antéro-postérieur lors de l&#39;allongement précoce. Ces nouveaux procédés consistent à mesurer la longueur des embryons au début et à la fin de l&#39;allongement précoce, ainsi que la largeur de leur ilannonces et les queues. 7 Deux protocoles ont également été développés pour mesurer la longueur des larves nouvellement écloses, synchronisé à l&#39; étape L1 7. Les coquilles des embryons de les protéger contre le traitement d&#39;hypochlorite alcalin alors que les larves, les adultes et les bactéries présentes dans les milieux de culture sont dissous par le traitement. Ce traitement est ensuite utilisé pour purifier les embryons provenant d&#39; une population non synchronisée contenant une majorité des adultes bien nourris 8. La restriction alimentaire est utilisé pour synchroniser les larves nouvellement écloses. Mesurer la longueur de ces larves est ensuite utilisé pour détecter des défauts d&#39;allongement. Cette mesure est préférable à la mesure des larves arrêtés sur des plaques de culture parce que les larves qui éclosent de non-entièrement embryons allongés peut récupérer à &quot;longueur normale&quot; lors de l&#39;alimentation, mais maintiendra leur taille réduite lors de son arrestation en l&#39;absence de nourriture. Ici, nous présentons des protocoles détaillés permettant la mesure du chierngth d&#39;allonger les embryons ainsi que la largeur de la tête et la queue à l&#39;aide de time-lapse DIC microscopie et l&#39;analyse de l&#39;image (Protocole 1). Nous fournissons également des protocoles détaillés pour mesurer la longueur des larves synchronisée par analyse d&#39;image (protocole n ° 2) et Flow-cytométrie (protocole n ° 3).

<table><tbody><tr><td>Agar&nbsp ;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Chlorure de calcium)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Solution de nettoyage&nbsp ;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Lames en verre</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>Particules de contrôle à haute fluorescence</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (phosphate de potassium, dibasique)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (phosphate de potassium, monobasique)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (sulfate de magnésium)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4(phosphate de sodium, dibasique)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (chlorure de sodium)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pébéo Gomme à Dessin 45&nbsp ; ML</td><td>P&eacute ; b&eacute ; o</td><td>PDG033000</td><td>tout magasin d’art/artisanat</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Tampon gaine</td><td>union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>union Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

novel metrics à caractériser embryonic allongement du nématode<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

La dissection des voies de signalisation qui contrôlent l’altération des processus morphogéniques au cours du développement embryonnaire nécessite des mesures robustes et sensibles. L’allongement embryonnaire du nématode Caenorhabditis elegans est un stade tardif de développement consistant en l’allongement de l’embryon le long de son axe longitudinal. Cette étape de développement est contrôlée par la communication intercellulaire entre les cellules hypodermiques et les muscles sous-jacents de la paroi corporelle. Ces mécanismes de signalisation contrôlent la morphologie des cellules hypodermiques en remodelant le cytosquelette et les jonctions cellule-cellule. La mesure de la létalité embryonnaire et de l’arrêt du développement aux stades larvaires, ainsi que l’altération du cytosquelette et des structures d’adhésion cellule-cellule dans les cellules hypodermiques et musculaires, sont des phénotypes classiques qui sont utilisés depuis plus de 25 ans pour disséquer ces voies de signalisation. Des études récentes ont nécessité la mise au point de nouvelles mesures ciblant spécifiquement l’élongation précoce ou tardive et caractérisant les défauts morphogéniques le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés permettant de mesurer avec précision la longueur et la largeur des embryons allongés ainsi que la longueur des larves synchronisées. Ces méthodes constituent des outils utiles pour identifier les gènes contrôlant l’élongation, pour évaluer si ces gènes contrôlent à la fois les phases précoces et tardives de ce stade et sont nécessaires uniformément le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Head-, caudales et Chef / Ratio de queue-largeur sont Metrics robustes. Les protocoles décrits ici ont été utilisés avec succès pour caractériser la fonction des régulateurs et des effecteurs de Rho GTPases pix-1, pak-1 et laissez-502 lors de l&#39; allongement précoce <su...

Ici, nous détaillons des protocoles spécifiquement conçus pour surveiller les défauts morphogéniques qui se produisent pendant les phases précoces et tardives de l’élongation embryonnaire du nématode Caenorhabditis elegans. En fin de compte, ces protocoles sont conçus pour identifier les gènes qui régulent ces phases et pour caractériser leurs besoins différentiels le long de l’axe antéro-postérieur de l’embryon.

Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

L'objectif général de ce groupe d'expériences est d'identifier les défauts du développement chez le nématode Caenorhabditis elegans durant les phases précoces et tardives de l'allongement embryonnaire. Cette méthode permet de répondre à une question clé dans le domaine de la génétique du développement. Elle permet la caractérisation des gènes contrôlant une étape tardive du développement embryonnaire de Caenorhabditis elegans appelée allongement embryonnaire.Le principal avantage de ce groupe de techniques est qu'il permet d'identifier les gènes contrôlant soit les stades précoces soit les stades tardifs de l'élongation, ainsi que ceux qui régulent les processus morphogénétiques dans la partie antérieure ou postérieure de l'embryon. Je vais démontrer la procédure conjointement avec Olivier Rocheleau-Leclair, un ancien étudiant du laboratoire. Cette procédure nécessite des objectifs DIC, un prisme et un système de capture vidéo pour la microscopie en laps de temps de piles Z.Tout d'abord, positionnez l'échantillon monté sur lame pour l'observation. Les détails de la préparation sont indiqués dans le protocole écrit. En commençant par un grossissement faible, identifiez les embryons à leurs stades pré-morphogénétiques.Ensuite, ajoutez une goutte d'huile et utilisez un objectif plus puissant. Identifiez maintenant les points supérieur et inférieur des embryons afin d'enregistrer et de définir les paramètres de la pile Z. Réglez l'acquisition en laps de temps pour prendre des images toutes les deux minutes.S'assurer que l'obturateur de lumière est fermé entre les acquisitions d'images. Le temps nécessaire pour capturer l'événement précoce d'élongation peut varier de une à huit heures, selon le stade de l'embryon. Exécuter maintenant le programme d'acquisition d'images et enregistrer les résultats.Ensuite, procédez à leur analyse à l'aide du logiciel Fiji ImageJ. Une fois les images chargées, sélectionnez le mode d'affichage Hyperstick. Ajustez ensuite la luminosité et le contraste en appliquant le mode automatique (Auto Mode) à partir des tables de correspondance (Lookup Tables).Ensuite, accédez à Analyser les mesures et définissez les paramètres. Pour chaque embryon, réglez la barre d'échelle Z afin de vous concentrer sur le pharynx, qui constitue un bon repère pour le point central de l'embryon. Réglez maintenant la barre d'échelle temporelle au début de l'allongement précoce pour un embryon spécifique.Prenez note de ce temps. Ensuite, calculez la longueur de l'embryon à l'aide de l'outil Analyser Mesurer en traçant une ligne depuis l'extrémité de la queue jusqu'à la bouche, en suivant la ligne médiane. Prenez note de cette longueur.Ensuite, ajustez le point temporel à la fin de l'événement d'élongation précoce et répétez la mesure de la longueur. Utilisez ces valeurs pour calculer la durée de l'élongation précoce et l'augmentation de la longueur pendant l'élongation précoce. La variation de la largeur peut également être mesurée à l'aide de l'outil de ligne droite en traçant une ligne traversant la ligne médiane de la tête.Il s'agit d'un bon emplacement pour des mesures cohérentes. Procéder de la même manière au niveau de la ligne médiane de la queue, puis calculer le rapport tête-queue pour tout point temporel et utiliser cette valeur pour évaluer les changements de largeur. Pour ce protocole, un cytomètre en flux doit être préparé pour l'écoulement de particules de grande taille.Une telle machine devient essentiellement un trieur de vers. Avant de commencer, mettez en marche le bloc laser, le compresseur, le trieur de vers et le logiciel. Dans le logiciel, appuyez sur Démarrer et vérifiez le contrôle du laser à argon.Sélectionnez le mode d'exécution et laissez le laser s'échauffer jusqu'à une puissance proche de 10 milliwatts, puis sélectionnez Terminé. Attendez au moins 15 minutes pour que la pression s'équilibre. Préparez maintenant l'échantillon.Tout d'abord, déposez 10 microlitres de L1 synchronisés de type sauvage dans une boîte de culture et estimez la fraction d'œufs morts au microscope. Si cette estimation est supérieure à 20 %, n'utilisez pas l'échantillon. Transférez environ 700 microlitres de L1 synchronisés en solution M9 dans un tube de 15 millilitres et ajoutez de l'iodure de propidium à 10 microgrammes par millilitre.Laisser agir la coloration pendant 30 minutes à température ambiante. Préparer maintenant le système. Il est essentiel de régler le débit à l’aide des régulateurs de débit de l’enveloppe et de l’échantillon à 5,1 et 5,51 respectivement.Lorsque les pressions sont stables, cliquez sur la case Pression correcte. Ensuite, utilisez la commande Acquérir et secouez manuellement le tubulure pour éliminer toutes les bulles du canal entre le gobelet d'échantillon et la chambre d'analyse. La fenêtre d'acquisition indiquera finalement l'absence de bulles.Ceci est également essentiel pour l'expérience. Réglez maintenant les paramètres pour les mesures de fluorescences et de temps de vol (TOF). Réglez les échelles pour TOF, EXT, Vert, Jaune et Rouge sur 256.Ensuite, régler le gain comme indiqué. Puis, régler la commande PMT à 700 pour le vert et le jaune et à 900 pour le rouge. Calibrez maintenant le trieuse de vers.Chargez 20 millilitres de particules de contrôle polyvalentes à forte fluorescence dans un gobelet d'échantillon et insérez-le dans le trieur. Dans le logiciel, sélectionnez Exécuter les particules de contrôle dans Outils, puis cliquez sur Acquérir. Vérifiez que le coefficient de variation obtenu est supérieur ou égal à 11 et que la moyenne est égale à 21 plus ou moins six.Si ce n'est pas le cas, essayez de nettoyer les tubules en cliquant sur le bouton Nettoyer ou en agitant le canal d'écoulement. Quittez maintenant le mode Particules de contrôle en décochant la commande dans Outils. Une fois la coloration des vers avec l'iodure de propidium terminée (30 minutes), ajoutez 10 millilitres de M9 aux vers colorés et mélangez.Incuber pendant au moins 15 minutes à température ambiante. Prélevez maintenant cinq millilitres de la dilution et ajoutez-les à une cuve d'échantillon contenant 15 millilitres de M9. Faites passer cette dilution dans le trieur de vers. Appuyez sur le bouton Acquérir et observez le débit.Il peut être nécessaire d'ajuster la concentration de vers pour obtenir un bon débit, compris entre 15 et 25 objets par seconde. Une fois la concentration appropriée des objets atteinte, ajoutez des particules témoins au test pour obtenir une concentration finale d'environ 0,5 à 1x les particules témoins en solution. Réglez maintenant le paramètre de tri dans le menu de tri sur TOF en fonction du vert.Ensuite, ajustez les paramètres de tri selon le temps de vol (TOF) par rapport au rouge. Cela permettra de séparer les particules de contrôle des animaux morts et des animaux vivants. Lancez maintenant l'expérience en cliquant sur Acquérir.Analyser environ 10 000 objets, ce qui correspond à environ 8 000 animaux. Ensuite, arrêter l'expérience et cliquer sur Stocker pour enregistrer les données dans un fichier texte à des fins d'analyse. Afin d'établir la robustesse de la mesure de la largeur de la tête, la mesure a été effectuée indépendamment cinq fois sur 12 embryons de type sauvage au stade 1,2 pli.Il n'y avait aucune variance parmi les données lors de l'application du test de Brown-Forsythe. La reproductibilité et les effets de lot associés à la mesure de la largeur de la tête ont été évalués à l'aide d'images DIC 4D prises à trois jours différents. Parmi ces trois groupes de mesures, aucune variance ni aucun effet de lot n'ont été observés.Les deux protocoles décrits ont été utilisés pour évaluer la longueur des larves arrêtées dans des lignées sauvages et mutantes. L'analyse d'image a fourni des mesures absolues de longueur en micromètres. Les mutants étaient plus petits que les types sauvages dans cette expérience.La mesure de la longueur par cytométrie en flux a donné des résultats comparables. Toutefois, ces mesures étaient nettement plus robustes. Ainsi, cette méthode devrait permettre de mettre en évidence des effets plus subtils dans les populations mutantes.Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de maintenir un débit constant tout au long de l'expérience afin d'assurer une comparaison équitable entre les souches analysées. Une fois maîtrisée, la mesure de la longueur des larves par cytométrie en flux permet de caractériser de 18 à 24 conditions ou souches mutantes par jour, même en tenant compte de l'étalonnage initial de l'appareil. Suite à cette procédure, nous sommes en mesure d'étudier la morphologie des cellules hypodermiques.Pour ce faire, nous pouvons utiliser un marqueur fluorescent et la microscopie confocale afin de caractériser la fonction moléculaire des gènes identifiés. N'oubliez pas que l'iodure de propidium peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et de lunettes de protection, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Suivi et quantification des processus de développement des<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilisation des outils open-source

Ici, nous présentons une approche combinatoire utilisant la microscopie à haute résolution, les outils de calcul, et l’étiquetage à une seule cellule dans les embryons vivants de C. elegans pour comprendre la dynamique de cellule unique pendant le neurodéveloppement.

Microscopie isotrope en feuilles légères et analyse automatisée de la lignée cellulaire au catalogue Caenorhabditis elegans embryogenèse avec résolution subcellulaire

Le sperme doit naviguer avec succès à travers l’oviducte pour fertiliser un ovocyte. Ici, nous décrivons un dosage pour mesurer la migration des spermatozoïdes dans l’utérus hermaphrodite de C. elegans . Ce dosage peut fournir des données quantitatives sur la distribution du sperme dans l’utérus après l’accouplement, ainsi que sur la vitesse, la vitesse directionnelle et la fréquence d’inversion.

Mesure du sperme guidage et motilité dans le Caenorhabditis elegans hermaphrodite appareil de reproduction

Cette étude décrit des mesures quantitatives de la taille et de la localisation synaptiques, de la morphologie musculaire et de la forme mitochondriale chez C. elegans à l'aide d'outils de traitement d'image librement disponibles. Cette approche permet à des études futures chez C. elegans de comparer quantitativement l'étendue des changements structurels tissulaires et organllés résultant de mutations génétiques.

Approches quantitatives pour l'étude des structures cellulaires et de la morphologie d'organite à Caenorhabditis elegans

Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l'imagerie simultanée en time-lapse 3D de l'embryogenèse dans 80-100 embryons d'élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d'image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l'analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l'embryogenèse.

Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

Nous présentons ici un protocole pour la préparation et le montage des embryons de Caenorhabditis elegans , l’enregistrement du développement sous un microscope 4D et le traçage de la lignée cellulaire.

Microscopie 4D: Démêler le développement embryonnaire de Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie Nomarski

Nous présentons ici une méthode générale pour déterminer la viabilité embryonnaire et le nombre total d’embryons produits (couvée) à l’aide de l’organisme modèle C. elegans.

Mesure de la viabilité embryonnaire et de la taille du couvain chez Caenorhabditis elegans

Découvrez des protocoles pour caractériser l'allongement embryonnaire chez Caenorhabditis elegans. Cette méthode permet d'identifier les gènes régulant les phases précoces et tardives du développement.

Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode

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