En détection de visage de l'oxyde nitrique et de superoxyde dans la couche endothéliale des artères intactes

L’objectif global de cette procédure est de détecter simultanément les anions oxyde nitrique et superoxyde intracellulaires à l’aide du colorant de fluorescence DAF-2DA et DHE dans des aortes de souris intactes fraîchement isolées. Cette méthode peut aider à récupérer en laboratoire le cas d’un chercheur dans le domaine de la physiologie cardiovasculaire, comme la dysfonction endothéliale et le découplage eNOS. Le principal avantage de cette technique est de fournir une méthode simple et précise pour la détection directe ex vivo et la visualisation simultanée de l’anion nitrique et superoxyde dans les vaisseaux sanguins intacts.

Pour ce protocole, construisez un système de bain d’orgue qui peut être chauffé à 37 degrés Celsius et aéré avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone provenant d’un réservoir de gaz carbonique. Pour commencer, préparez suffisamment de tampon de bicarbonate Krebs-Ringer frais au besoin pour baigner les tissus d’intérêt. Par exemple, 200 millilitres sont nécessaires pour les aortes dans une expérience.

Allumez le système de bain d’orgue et réglez la commande de chaleur à 37 degrés Celsius. Après avoir lavé les chambres avec le tampon de bicarbonate Krebs-Ringer, ajoutez cinq millilitres de tampon de bicarbonate de Krebs-Ringer dans chaque chambre et allumez le gaz pour l’aérer avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Gardez les chambres couvertes.

Préparez également une bouteille de tampon de bicarbonate Krebs-Ringer glacé avec aération. Après l’excision de l’aorte thoracique, plongez immédiatement l’ensemble du tissu dans une boîte avec un tampon Krebs-Ringer glacé. Sous un microscope de dissection, retirez le cœur et l’arc aortique tout en maintenant le segment aortique thoracique dans le tampon.

Ensuite, disséquez l’aorte pour l’exempter de tissu périvasculaire adhérent à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces. Ensuite, utilisez une pince pour saisir le bord du tissu et rincez doucement le sang de la lumière vasculaire à l’aide d’un tampon Krebs-Ringer glacé délivré à partir d’une seringue. Les caillots sanguins dans la lumière vasculaire doivent être évacués car ils peuvent provoquer des signaux artificiels et interférer avec les signaux fluorescents, tandis que dans le même temps, la force du rinçage doit être contrôlée pour ne pas endommager la couche endothéliale.

Maintenant, coupez les anneaux aortiques nettoyés en segments de trois millimètres de long. Après avoir préparé les anneaux aortiques nettoyés, tachez-les. En touchant uniquement le côté adventice des anneaux aortiques avec une pince, sans clamper les vaisseaux sanguins, transférez les segments aortiques nettoyés dans les chambres de bain d’organes préparées.

Laissez les artères s’équilibrer dans le tampon pendant 30 minutes. Après une demi-heure, ajoutez de l’acétylcholine dans le bain d’organe pour obtenir une concentration finale d’une micromolaire et incubez les artères pendant 10 minutes avec l’acétylcholine. Pendant ce temps, dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, préparez un millilitre de solution de coloration avec un tampon Krebs préchauffé.

Ensuite, enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour minimiser l’exposition à la lumière et maintenez-le à 37 degrés Celsius. Après la stimulation à l’acétylcholine, transférez les anneaux aortiques du bain d’organe dans le tube de solution de coloration et laissez-les incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité avec aération. Toutes les étapes à partir de ce moment doivent être effectuées avec une exposition minimale à la lumière.

Ensuite, transférez les anneaux aortiques dans un nouveau tube rempli de tampon Krebs pendant une minute. Effectuez cette étape de lavage trois fois. Ensuite, fixez les anneaux aortiques dans un bain de solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante.

Après l’étape de fixation, transférez les anneaux dans la solution DAPI pendant trois minutes à température ambiante pour appliquer la contre-teinture. Ensuite, lavez les anneaux aortiques avec du PBS trois fois pendant une minute par lavage. Soyez toujours sensible à la fragilité du tissu endothélial lorsque vous déplacez les anneaux.

Au microscope, coupez les anneaux aortiques longitudinalement avec des ciseaux microchirurgicaux sur une lame. Ensuite, retirez tout excès de liquide sur l’aorte tout en la gardant humide. Forcez les aortes enroulées à plat contre une lame, l’endothélium vers le bas sur la lame de verre, à l’aide de deux pinces microchirurgicales.

Dans ce processus, ne bougez pas les aortes d’avant en arrière. Cette étape est très critique, mais pas facile à utiliser. Il est préférable de pratiquer bien avant l’expérience formelle.

Ensuite, déposez le support de montage sur l’aorte. Couvrez la lame et scellez-la avec du vernis à ongles. Après le séchage à l’air libre dans l’obscurité, imagez les lames à l’aide de la microscopie confocale.

Utilisez une vitesse de balayage de 200 hertz, une résolution de 1024 x 1024 pixels et une taille de pile z d’un quart de micron. Pour observer le DAF-2DA, utilisez un laser à argon, réglez la fluorescence d’excitation à 488 nanomètres et la détection d’émission à 515 nanomètres. Pour observer la DHE, réglez la fluorescence d’excitation sur 514 nanomètres et réglez la détection sur 605 nanomètres.

Après avoir effectué la mise au point avec des grossissements de 10x, réglez l’objectif sur des grossissements de 40x. Maintenant, définissez la plage de la couche endothéliale en ajustant la position z sur le panneau de commande, en utilisant les noyaux colorés au DAPI comme points de repère. Ensuite, balayez à partir de la couche endothéliale sur la bordure de la lumière à travers toute l’épaisseur de la couche endothéliale et enregistrez les images.

Scannez au moins trois champs de vision différents pour chaque échantillon. De jeunes souris C57 noires 6 ont été rendues obèses en étant nourries avec un régime riche en graisses pendant 14 semaines. Les témoins ont été nourris avec une nourriture normale.

Après 14 semaines, leurs artères thoraciques ont été examinées. Avant la coloration, les tissus ont été exposés à l’inhibiteur d’eNOS L-NAME pendant une heure à une nanomolaire. Le signal du DAF-2T, visible en vert, est converti du DAF-2 sans fluorescence par l’oxyde nitrique.

Ainsi, la coloration suggère la présence d’oxyde nitrique dans une cellule. De même, lorsqu’elle est oxydée par le superoxyde, la DHE émet un signal fluorescent rouge. Ainsi, les échantillons montrant plus de couleur rouge ont plus de superoxyde dans les cellules.

La quantification des images de fluorescence confocale a révélé une diminution de la production d’oxyde nitrique et une augmentation de la génération de super-oxyde sensible au L-NAME dans la couche endothéliale aortique des souris nourries avec un régime riche en graisses. Ces données soutiennent l’idée que le découplage des eNOS se produit avec l’obésité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter l’oxyde nitrique et les anions superoxyde, ainsi que l’utilisation de colorants fluorescents dans les vaisseaux sanguins intacts.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en six heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder la couche endothéliale intacte pendant toute la procédure de l’opération. Et immergez toujours les vaisseaux sanguins dans le tampon Krebs-Ringer pour maintenir les cellules endothéliales en vie avant l’étape de fixation.

En combinaison avec cette procédure, d’autres mesures telles que l’analyse des réponses vasomotrices des vaisseaux sanguins peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la fonction physiologique des cellules endothéliales dans la régulation du tonus vasculaire.